全 文 ：第 34 卷第 19 期
2014年 10月
生 态 学 报
ACTA ECOLOGICA SINICA
Vol.34,No.19
Oct.,2014
http: / / www.ecologica.cn
基金项目:国家环保公益性项目(201009032)
收稿日期:2013鄄01鄄09; 摇 摇 网络出版日期:2014鄄03鄄07
*通讯作者 Corresponding author.E鄄mail: fenghu@ njau.edu.cn
DOI: 10.5846 / stxb201301090073
史志明, 徐莉, 胡锋.蚯蚓生物标记物在土壤生态风险评价中的应用.生态学报,2014,34(19):5369鄄5379.
Shi Z M, Xu L, Hu F.Progress in earthworm biomarker studies and theirs applications in soil pollution risk assessment.Acta Ecologica Sinica,2014,34
(19):5369鄄5379.
蚯蚓生物标记物在土壤生态风险评价中的应用
史志明, 徐摇 莉, 胡摇 锋*
(南京农业大学资源与环境科学学院, 南京摇 210095)
摘要:蚯蚓在土壤中行使了很多重要的生态功能,蚯蚓生物标记物常用作土壤污染风险评价研究。 这篇综述的目的是探讨当前
蚯蚓生物标记物研究是否可以应用到实际的土壤污染风险评价。 1)讨论了蚯蚓生物标记物在土壤污染风险评价体系中的重
要性,认为它是化学分析方法的有益补充,可以提供更为全面和客观的土壤污染信息;2)综述了相关研究中所使用的蚯蚓类
型,土壤类型和生物标记物类型,及其它试验设计要素和最后结果的变异,认为目前蚯蚓生物标记物研究以实验室基础研究为
主,筛选出了大量的生物标记物,一定程度上揭示了生物标记物的对各类典型污染物及其组合的应答机制;同时也认为,未来的
蚯蚓生物标记物研究应该重点探讨将其应用到实际的土壤污染风险评价中的可行性及如何应用;3)目前不同研究之间从试验
设计到结果都具有很大的变异,难以通过综合比较获得完全可靠的具有实践意义的结论和成果,因此,有必要通过建立标准化
的蚯蚓生物标记物研究方法,推动生物标记物的研究工作;4)提出了蚯蚓生物标记物研究方法标准化的具体建议,推荐了蚯蚓
生物标记物走向实际应用所需要解决的问题。
关键词:蚯蚓; 生物标记物; 土壤污染风险评价; 土壤污染预警
Progress in earthworm biomarker studies and theirs applications in soil pollution
risk assessment
SHI Zhiming, XU Li, HU Feng*
College of Resources and Environmental Science, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
Abstract: Earthworms perform a number of essential functions in soil and are ideal indicators of soil pollution and declines
in soil quality. The effects of pollutants on earthworm biomarkers are often investigated to assess the risk of soil pollution.
The aim of this review is to explore whether the currently known earthworm biomarkers can be used in practice to assess soil
pollution risk. In this paper, we review four aspects of earthworm biomarkers based on studies published in the past two
decades and especially in the most recent 10 years. 1) The role of earthworm biomarkers in soil pollution risk assessment
was first discussed, leading to the conclusion that although earthworm biomarkers cannot replace conventional chemical
analytical methods, they offer a good complement for the flaws of chemical analysis, and may provide more comprehensive
and straightforward information about soil pollution risk. Therefore, earthworm biomarkers may be very useful for primary
screens in large鄄scale soil pollution surveys. 2) The earthworms tested in previous studies represented many different species
and all three ecological categories ( epigeic, anecic, and endogeic), but most studies involved Eisenia fetida / andrei
(epigeic) . Earthworm biomarkers could be classified into different groups: physiological鄄biochemical, individual behavior,
morphological, molecular genetic and immunological. However, most researchers have focused on the anti鄄oxidant defense
system, metallothionein (MT), avoidance response, lysosomal fragility (neutral red retention assay), and the comet assay.
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In addition, the range of exposure medium, exposure time, other components in the experimental design, and differences in
the results were critically reviewed. We concluded that earthworm biomarker studies have been carried out mainly at the
laboratory scale, that many biomarkers have been screened, and that the response mechanisms of typical earthworm
biomarkers to typical pollutants and to combined pollutants have been elucidated to some extent. However, in the future,
studies should focus on the feasibility of using earthworm biomarkers in real soil conditions. 3) Published studies vary
greatly in experimental design and results, including the range of biomarkers and the response level in earthworms, and
therefore are not directly comparable. This fact may pose a challenge to inferring broadly reliable conclusion and might limit
the practical applications of this research. To elucidate the problems, we discuss the varying responses of superoxide
dismutase, an important component of the antioxidant enzyme system in different earthworm studies; the results varied by
three orders of magnitude which is confusing because the change of physiological鄄biochemical level should not be so large
even in spiked earthworms. As a result, standard protocols for earthworm biomarker assays may be needed to aid
comparisons among studies. 4) We recommend a set of research guidelines ( such as the earthworm species to be tested,
exposure times, types of biomarkers, etc.) based on the current studies. In addition, future studies should focus on methods
to screen earthworm biomarkers that are simple, sensitive, and highly repeatable. Establishing a database of basal biomarker
levels in earthworms in different soil types that is integrated with a national survey of pollution sources should be useful for
practical applications in China. This review provided a global evaluation of earthworm biomarker studies and can serve as a
reference for establishing standard earthworm biomarker assay protocols. Therefore, it will promote further studies and
practical applications of earthworm biomarkers in assessing soil pollution.
Key Words: earthworm; biomarkers; soil pollution risk assessment; soil pollution early鄄warning
摇 摇 在土壤生态系统中,蚯蚓是最重要的栖息者之
一[1]。 一方面,蚯蚓在土壤的形成过程中,土壤结构
和土壤肥力的保持等方面,具有独特的作用[2],另一
方面,蚯蚓在陆地生态系统中具有特殊地位,很多动
物如鼹鼠,獾和鸟类都可以取食蚯蚓,从某种意义
上,它连接了土壤圈与大气圈,沟通了土壤生物同地
上生物之间的联系[3鄄4]。 在生态毒理学上,还由于蚯
蚓分布广泛,对土壤污染胁迫比较敏感,而被称为土
壤质量的指示者,并在许多生态毒理国际标准中推
荐受试物种之一[5鄄6]。 深入挖掘蚯蚓的“指示冶功
能,有利于更好地开发利用蚯蚓资源。
蚯蚓生物标记物试验蚯蚓生态毒理学研究的重
要内容。 自美国国家科学院生物标记物委员会于
1987年对生物标记物进行了系统论述后的 20 余年
来,自 2001年在丹麦举办第三次蚯蚓生态毒理学国
际研讨会后的 10 余年来[7],尽管开展了很多研究,
生物标记物的概念和研究方法也有了进一步发展,
但在实际土壤污染风险评价中,蚯蚓生物标记物试
验并没有像蚯蚓常规毒理试验那样可以形成标准并
在实际中广泛应用。 那么,着眼于科学研究服务现
实问题的角度,令人困惑的问题就产生了,蚯蚓生物
标记物研究是否有实际意义,当前对于蚯蚓生物标
记物的研究工作是否可以应用于实际土壤污染风险
管理和评价,但鲜有相关报道。 因此本文拟就这个
问题,从实际土壤污染风险评价的角度,首先探讨蚯
蚓生物标记物的地位和意义,接着,对蚯蚓生物标记
物研究现状进行归纳,总结和评述,最后提出推动蚯
蚓生物标记物研究和实际应用的建议,包括尝试提
出蚯蚓生物标记物研究方法的标准化的建议。
1摇 蚯蚓生物标记物土壤污染风险评价体系中的
位置
蚯蚓生物标记物是指在亚致死浓度条件下,通
过检测蚯蚓在行为上,生理生化上等敏感指标的变
化对土壤污染状况进行评价,从某种意义上讲,它是
蚯蚓常规毒性试验方法的拓展[8]。 由于蚯蚓生物标
记物对土壤污染胁迫比较敏感,因此可以用作是土
壤污染预警和诊断的一种工具。
从实际应用的角度,可以将蚯蚓生物标记物融
入到土壤风险评价框架中(图 1)。 由图 1 可以看
出,在土壤污染风险评价中,1)广义上讲,蚯蚓生物
标记物属于生物指示法的范畴,都是通过考察蚯蚓
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的相应水平的指标来指示环境污染状况,常规毒性
试验检测致死率,繁殖率等个体水平的指标,而蚯蚓
生物标记物试验通常检测细胞水平,生理生化水平,
甚至基因水平上指标;2)从适用范围来讲,化学分析
方法可以检测任何污染程度的土壤,而常规蚯蚓毒
理试验(急性毒性试验和生殖毒性试验等),只对低
于某种污染程度的土壤适用(中度污染土壤),但生
物标记物方法只能对轻度污染土壤适用;3)同化学
分析方法相比,面对一块未知风险的潜在污染土壤,
生物指示法的缺点是,总体上,它无法确定土壤中存
在污染物的类型和含量,但由于生物指示法能够客
观反映出污染物在土壤真实的生物有效性和毒性,
进而直观地指示潜在污染土壤是否存在现实风险,
因此它可以对土壤污染的风险状况做出综合评估;
4) 进一步地,由于土壤修复目标是无害化,而对无
害化目标的确定,采用生物指示法就远远比化学分
析法客观准确;这一点对于建立污染土壤的修复基
准也尤其重要[9鄄11];综上,生物指示法在土壤污染风
险评价中占据重要的位置,虽然它不能作为传统化
学分析手段的替代,却是化学分析手段的有益不可
或缺的补充,二者结合可以相得益彰。
理解生物指示法在实际土壤污染风险评价和管
理中的价值,有助于更好的认识和应用蚯蚓生物标
记物。 例如,在大规模土壤污染风险评价中,可以首
先将土壤视作一个“黑箱冶,通过生物测试方法(急
性毒性试验,慢性毒性试验和生物标记物试验等),
初步筛查出那些已经产生风险的污染地块,并粗略
判断土壤污染程度,再通过化学分析手段对这些污
染土壤做进一步分析。 这样不但可以节约大量的化
学分析成本,而且可以获得更为全面,准确和客观的
土壤污染信息。
图 1摇 生物标记物在土壤污染风险评价中的位置
Fig.1摇 The role of biomarkers in soil pollutant risk assessment
2摇 研究现状
本小节通过对蚯蚓生物标记物研究中所涉及的
试验要素进行梳理,并进行简要分析,从整体上为回
答如果将蚯蚓生物标记物应用于实际土壤污染风险
评价,那么试验中涉及到哪些类型的生物标记物,生
物标记物响应的变异性怎么样,需要选用什么样的
蚯蚓和污染物,用什么类型的土壤等问题提供依据。
所参考的资料是 1996 年以来关于蚯蚓生物标记物
研究的部分文献(表 1)。
表 1摇 蚯蚓生物标记物研究部分实验研究(1996—2012年)
Table 1摇 Studies investigating earthworm biomarkers response to pollutants
蚯蚓种
Species
生物标记物
Biomarkers
受试物质
Test pollutant
暴露时间 / d
Exposure time
暴露介质
Exposure medium
参考文献
References
E. fetida 中性红试验 Cu 28 自然土壤 [12]
E. fetida 抗氧化酶 苯并芘 1,2, 7,14 人工土壤,未老化 [13]
E. fetida 抗氧化酶,乙酰胆碱脂酶,谷光甘肽转移酶 Pb 2,7, 14,28 人工土壤 [14]
E. fetida 形态学特征,乙酰胆碱脂酶 毒死蜱 1, 2 滤纸 [15]
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续表
蚯蚓种
Species
生物标记物
Biomarkers
受试物质
Test pollutant
暴露时间 / d
Exposure time
暴露介质
Exposure medium
参考文献
References
E. fetida 中性红试验 Pb 28 自然土壤,未稳定 [16]
E. fetida 中性红试验 Pb 28 自然土壤,未稳定 [17]
E. fetida 回避试验 TNT,原油 2 长期污染土壤 [18]
E. fetida 中性红试验 氰氧化铜 28 人工土壤,稳定 2d [19]
E. fetida 中性红试验彗星试验 乙草胺 5,15,30 人工土壤 未平衡 [20]
E. fetida 抗氧化酶 荧蒽 1,3,7,14 自然土壤,稳定 3d [21]
E. fetida 抗氧化酶细胞色素 P450 菲芘 2 滤纸 [22]
E. fetida 乙酰胆碱脂酶,组织病理响应 有机磷杀虫剂 2 滤纸 [23]
E. fetida 胆碱脂酶 双硫磷 2 滤纸 [24]
E. fetida 中性红试验 As 28 沙土 [25]
E. fetida 彗星试验抗氧化酶 阿特拉津 28 人工土壤,未老化 [26]
E. fetida 抗氧化酶 四溴双酚 A 7,14 人工土壤,未老化 [27]
E. fetida 抗氧化酶 细胞色素 P450 苯并芘 1,3,7,14 自然土壤,未老化 [28]
E. fetida 中性红试验 Cu 21 长期污染土壤 [29]
E. fetida 中性红试验 Zn 42 自然土壤,稳定 7d [30]
E. fetida 彗星试验抗氧化酶 三氯生 2,7,14 盐碱土,未老化 [31]
E. fetida 抗氧化酶热激蛋白 吐纳麝香加乐麝香 2 滤纸 [32]
E. fetida 抗氧化酶 菲 28 自然土壤,未老化 [33]
E. fetida 彗星试验中性红试验 TNT 1,2,3 滤纸 [34]
E. fetida 抗氧化酶 HHCB 3,7,14,28 自然土壤,稳定 1d [35]
E. fetida 抗氧化酶 菲芘 14 自然土壤,平衡 2d [36]
E. fetida 中性红试验 Cu 14 原位污染土壤 [37]
E. fetida 抗氧化酶 荧蒽 7 自然土壤,异老化时间 [38]
E. fetida 抗氧化酶 1,2,4-三氯苯 2,7,14 人工土壤,未老化 [39]
E. fetida 抗氧化酶 菲 芘 28 人工土壤,平衡 15d [40]
E. fetida 抗氧化酶 抗生素类 7,14,28 森林公园,未老化 [41]
E. fetida 抗氧化酶 金霉素 28 盐碱土,未老化 [42]
E. fetida 抗氧化酶 Cd芘 7,14,21,28,35,42,49,56 自然土壤,老化 7d [43]
E. fetida 回避试验 Pb Zn Cu 2 铅矿区污染土壤 [44]
E. fetida 抗氧化酶 多溴联苯醚-Cd 1,3,5,7,14,28 自然土壤,稳定 1d [45]
E. andrei 回避试验 重金属 原位收集,长期暴露 原位污染矿区土壤 [46]
E. andrei 乙酰胆碱脂酶 西维因 1,3,5 自然土壤,稳定 3d [47]
E. andrei 抗氧化酶,乙酰胆碱脂酶 溴氰菊酯 1,3,6,15,21,28 人工土壤,未老化 [48]
E. andrei 抗氧化酶,乙酰胆碱脂酶 乐果 1,3,6,15,21,8 人工土壤,未老化 [49]
E. veneta 中性红试验 重金属 14 黄铁矿区 [50]
L. rubellus 中性红试验 Cu 28 自然土壤,稳定 3d [51]
L. rubellus 中性红试验 Cu 17,40,70,110 自然土壤 [52]
L. rubellus CAT,细胞色素 P450 芘 42 人工土壤,稳定 1d [53]
L. terrestris 伤口愈合 Cd 10,20,30 人工土壤,未平衡 [54]
L. terrestris 中性红试验总免疫活性 重金属 PAHs 12 长期污染田间土壤 [55]
L. terrestris 羧酸酯酶 毒死蜱 1 滤纸 [56]
L. terrestris 组织病理学上,抗氧化酶,谷光甘肽转移酶,粘液分泌 重金属 原位收集,长期暴露 原位污染土壤 [57]
A. chlorotica 胆碱脂酶 杀虫剂 原位收集,长期暴露 苹果园 [58]
A. tuberculata 金属硫蛋白,细胞色素 P450,谷光甘肽转移酶 Cu摇 Zn 2,7,14 工业原位污染土壤 [59]
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续表
蚯蚓种
Species
生物标记物
Biomarkers
受试物质
Test pollutant
暴露时间 / d
Exposure time
暴露介质
Exposure medium
参考文献
References
L. mauritii 抗氧化酶,彗星试验,谷光甘肽转移酶 Pb摇 Zn 28 自然土壤,稳定 7d [60]
L. castaneus 中性红试验 重金属 原位收集,长期暴露 工业污染土壤 [61]
A.caliginosa 胆碱脂酶,谷光甘肽转移酶 毒死蜱 7,14,28 长期污染自然土壤 [62]
A.caliginosa 胆碱脂酶中性红试验 毒死蜱 28 长期污染果园土壤 [63]
A.caliginosa 胆碱脂酶,谷光甘肽转移酶,中性红试验 二嗪农毒死蜱 28 人工土壤,未老化 [64]
D. octaedra 糖元含量 重金属 28 长期污染森林土壤 [65]
A.nocturnallolobophora
icterica 掘穴行为,乙酰胆碱脂酶 吡虫啉 7 污染废弃桃园 [66]
2.1摇 生物标记物类型
表 2将文献中出现的生物标记物类型进行了归
类,可以看出,当前已经筛选出了多种多样的生物标
记物,从微观分子水平上的变化到宏观个体行为形
态上各个尺度变化的均有涉及。 但研究者对这些生
物标记物的关注程度是不同的,其中最多的有生理
生化上的抗氧化酶系统,金属硫蛋白(MT),溶酶体
膜稳定性,行为学上的回避反应和分子遗传学上的
彗星试验。 另外,研究者也特别关注对特定污染物
响应的生物标记物,即特异性生物标记物,但综合文
献可以发现除了金属硫蛋白(对重金属类污染物),
乙酰胆碱脂酶(对有机磷、氨基甲酸酯类)等少量几
类外,大多数生物标记物不具有特异性。 如抗氧化
酶既能为重金属污染胁迫所诱导[60],也可以为持久
性有机污染物所诱导[21,36],而回避反应[44,67]和中性
红 试 验 则 几 乎 对 所 有 的 污 染 胁 迫 均 有
应答[12,16,46,52]。
表 2摇 生物标记物分类
Table 2摇 Classifications of earthworm biomarkers
分类依据 Classification 生物标记物种类 Type of earthworm biomarkers
生理生化学 Physiological and biochemical 抗氧化酶,细胞色素 P450,谷胱甘肽转移酶,乙酰胆碱脂酶 羧酸酯酶, 中性红试验,金属硫蛋白,热激蛋白,糖元含量
行为学 Behavioral 回避反应,掘穴行为,粘液分泌
组织病理学 Histopathological 表面形态完整性,伤口愈合
分子遗传学 Molecular genetic 彗星试验
免疫学 Immunological 总免疫活性
2.2摇 生物标记物响应范围
理论上,生物体在长期进化和自然选择过程中,
其体内的各项生理生化指标应该是处于一个相对稳
定的水平,因此,对于同一种蚯蚓来说,在理想生存
条件下,其生物体内的各项指标包括生态毒理研究
中所说的生物标记物,其基底或背景水平应该是在
一定范围内变化,相对稳定的[8]。 然而,不同文献报
道中,同一种生物标记物的测定数据范围往往差异
很大,即使考虑到有很多环境因子,如温度,湿度,污
染物等对生物标记物应答的影响,这种巨大的差异
值得思考的,如表 3中,赤子爱胜蚓体内超氧化物歧
化酶(SOD)活性的变异性超过 3 个数量级。 究其原
因,蚯蚓生物标记物的测试方法不统一可能是一个
重要的因素。 这说明,不同的研究之间生物标记物
响应,存在很大的不确定性,从而也限制蚯蚓生物标
记物广泛应用,这同时也呼吁建立标准的生物标记
物试验和结果表现方法(例如采用相对值的方法消
除这种不确定性)。
2.3摇 暴露介质和暴露时间
蚯蚓生物标记物暴露介质大致说来有,OECD
等国际组织推荐的人工模拟土壤,未受污染的自然
土壤,从污染场地或矿区采集的长期污染土壤和滤
纸。 除了自然污染土壤外,试验介质中污染物主要
是外源添加。 采用人工添加污染物的生物标记物试
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验主要是着眼于评价评价污染物(单一污染和复合
污染)释放到土壤环境中的毒理效应和相应的机理,
也可以用作制定土壤环境质量标准的依据,是着眼
于危险化学品的管理角度出发,而选用自然污染土
壤作为介质,则是探讨生物标记物在实际土壤污染
风险评价中的适用性。 由于模拟污染土壤与实际长
期的土壤污染存在本质上的不同(前者污染较为简
单,且生物有效性往往较高),因此,很难通过实验室
模拟特定污染的土壤类推到复杂的实际污染土壤。
表 3摇 赤子爱胜蚓抗氧化酶系统在不同文献中的响应范围
Table 3摇 The range of anti鄄oxidant enzymes in E. fetida in different studies
蚯蚓大小 E.fetida
/ (g /条)
SOD
Superoxide dismutase
/ (U mg-1 pr-1)
CAT
Catalase
/ (U mg-1pr-1)
POD
Peroxidase
/ (U mg-1pr-1)
MDA
Malondialdehyde
/ (nmol mg-1pr-1)
来源
References
0.3—0.6 40—60 10—12 5—7 [40]
0.35—0.45 16—30 70—120 40—70 0.4—0.7 [68]
0.35—0.45 100—300 1—5 0.2—0.5 [22]
0.25—0.35 40—60 6—10 3—6nmol / mg [33]
0.3—0.4 0.4—0.8 3.4—9 [41]
0.3—0.4 0.3—0.7 15—40 [26]
0.3—0.6 0.84—1.41 3.65—6.99 0.035—0.081 [31]
0.4—0.5 0.4—0.8 [32]
0.3—0.4 50—60 3—5 [43]
0.3—0.5 150—250 6—10 [28]
0.3—0.4 30—40 22—28 1.2—2.5 [27]
0.3—0.4 3—6 1—4 40—100 [45]
0.3—0.4 150—230 5—10 0.2—0.4 [21]
摇 摇 SOD代表超氧化物歧化酶;CAT代表过氧化氢酶;POD代表过氧化物酶;MDA代表丙二醛
摇 摇 暴露时间也会对蚯蚓生物标记物响应产生影
响,因此暴露时间的不一致会为不同研究之间的比
较带来困难[16,43]。 表 1显示,在暴露介质为滤纸时,
蚯蚓暴露时间为 48 h,通常不超过 72 h;在土壤介质
实验室条件,除了少量研究中,蚯蚓暴露时间基本一
致,即 28 d左右。 这是由于 28 d大致是蚯蚓从一个
虫卵发育到成熟的一个周期。 在实际操作中,研究
者根据相关 OECD 蚯蚓毒性试验中规定的标准,并
进行微小调整确定的[69],取样间隔时间和采样频度
有所差异;而从污染场地采集的蚯蚓,其暴露时间可
能更长。 因此,总体上,在暴露时间的选择上,众多
研究者的观点似乎是一致的,这其实也为将蚯蚓生
物标记物应用于实际土壤污染风险评价提供了
方便。
2.4摇 受试蚯蚓和受试污染物
从表 1可以看出,蚯蚓生物标记物的研究中最
常选用的蚯蚓是赤子爱胜蚓(E. fetida)和安德爱胜
蚓(E. Andrei) [5],也包括了其它种类的蚯蚓,如陆正
蚓 (L. terrestris)等。 所选用的蚯蚓绝大多数是成年
蚯蚓,少量研究也涉及幼年蚓[64]。 这些蚯蚓涵盖了
各种生态型,包括表层种如 D. octaedra, E. veneta, L.
rubellus, L. castaneus 等,内层种如 A. tuberculata, A.
caliginosa, A. icterica, A. chlorotica 等和深层种如 L.
terrestris, A. longata 等。 选择赤子爱胜蚓考虑到它
是几个国际标准堆积中推荐的受试种,其生物学依
据是活性较强,易于大规模饲养,繁殖率高,生活周
期短而且对化学品反应敏感,但这种蚯蚓的缺点是
它不是土著蚯蚓,只栖居在富含有机质的环境
中[70]。 选择其它蚯蚓大多是由于它们是土著蚯蚓,
更能代表实际土壤风险的基本情况,主要缺点是这
些蚯蚓难以饲养,若实地采集,虽然可以满足实验室
研究需要,却无法大规模应用于实际土壤污染风险
评价。
较早用于研究蚯蚓生物标记物响应的受试污染
物是重金属,最近几年越来越多地涉及到了持久性
有机污染物,例如农药,PAHs等,而新引起人们关注
的环境激素类污染物也有涉及(表 1)。 因此大体可
以说,几乎所有的污染物类别都已经包括,其中代表
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性的污染物及复合污染对蚯蚓生物标记物的响应都
有所研究。 污染物之间的复合效应研究,既有重金
属与重金属之内的复合,又有持久性有机污染物之
内的联合,还有重金属与持久性有机污染物之间的
交叉联合。 同样地,这些研究或是评估单一污染物
或复合污染的毒理效应,服务于危险化学品的管理,
或者是模拟典型的现实污染状况,从更广泛的意义
上讲,这些研究还远远不能类推到实际土壤污染风
险评价。
2.5摇 其它
实际上,很多过程可以影响蚯蚓生物标记物响
应。 例如,蚯蚓生物标记物测定前蚯蚓通常需要一
个清肠过程,以排空肠道中残留的内容物,消除这些
内容物对生物标记物测定的影响[70]。 在所有的研
究中,几乎都有这个过程,但清肠时间却并不一致,
有的是 12 h,有的是 24 h,而清肠时间是否对蚯蚓生
物标记物存在影响,鲜有人注意。 再有,蚯蚓培养和
暴露条件,有的是将蚯蚓处在 20 或 22 益,完全黑暗
条件下培养,有的则是明暗交替进行;还有,模拟土
壤污染采用人工染毒的方式,所需平衡或老化的时
间,不同的研究中也差别很大(表 1)。 这些都可能
是降低不同研究之间可比性的重要因素,理论上,这
些问题应该都是可忽略的影响因素,只要在不同的
研究中将这些因素统一,那么这些因素可以作为系
统误差,而不会影响蚯蚓生物标记物的实际应用。
3摇 蚯蚓生物标记物研究现状评述及建议
通过以上归纳和分析可以看出,目前关于蚯蚓
生物标记物的研究,就研究尺度来说,多是停留在实
验室基础研究阶段,即使有少量的应用于实际土壤
污染预警的研究,也是零星的,分散的,探索性的,未
能形成一整套体系;就研究内容来说,这些研究大致
有两个方面,一个是研究污染物(单一污染物或复合
污染物)对各种蚯蚓生物标记物的响应,探讨其中可
能存在的剂量鄄效应关系,揭示响应机理;另一个是
筛选新的生物标记物包括新的特异性生物标记物;
就研究方法和结果的展示来说,这些研究从蚯蚓种
的选择,到试验设计,到最后的测定方法和结果,都
具有多样性和变异性,彼此之间的可比较性较低。
因此,考虑到实际土壤污染的复杂性,总的来说,难
以通过这些研究获得较为可靠的可指导实际的土壤
污染风险评价的结论。
因此,从将生物标记物应用于实际土壤污染评
价的角度,当前的研究并不成熟。 但这些研究提供
了大量有关蚯蚓生物标记物的第一手资料,一定程
度上阐明了生物标记物应答的机制及其同土壤污染
的关系,从而为将蚯蚓生物标记物用于实际土壤污
染风险评价奠定了基础:1)筛选出了大量的,在实验
室条件下较为有效和可靠的生物标记物(包括少量
的特异性生物标记性物),如回避试验和中性红试
验[61,67];2)揭示了典型污染物的代表及其典型组合
对蚯蚓生物标记物的影响及其机制[43,59鄄60]。
这些研究的重要性不言而喻,但着眼于实际污
染风险评价的角度,目前关于蚯蚓生物标记物研究
的两个内容似乎可以适可而止,当然为了评估新的
化学品风险和研究化学品对蚯蚓的毒理学机制的基
础研究除外。 首先,穷尽研究所有污染物及其组合
对各种蚯蚓,各类生物标记物在各种暴露介质中的
响应是不可能的,也是没有必要的;其次,筛选新的
蚯蚓生物标记物包括新的特异性生物标记物似乎变
得很困难,可能也没有必要,因为一方面对蚯蚓生物
标记物的筛选从分子水平到机体水平,已经从各个
层次上筛选出了大量的生物标记物,而且这些生物
标记物响应的生物学机制也一定程度的阐明了,即
使存在新的生物标记物,可能也不便于推广应用;此
外,虽然某些特异的生物标记物可以指示特定的污
染物,但总体上,生物标记物是不具有指示特定污染
物功能。 任何污染胁迫都可能会对蚯蚓造成毒害,
从而会通过蚯蚓的各项生理生化过程包括蚯蚓生物
标记物反映出来,而且土壤的实际污染状况往往包
括多种污染物,是复杂的,难以预测的,即使有更多
的特异性生物标记物,也很难全面反映土壤实际污
染状况,因此从实际风险评价和管理的角度来讲,筛
选特异性生物标记物的意义可能值得重新认识。
而未来的研究重点,应该尝试通过系统研究和
标准化方法推动和评估生物标记物应用于实际的价
值,具体来说,1)将蚯蚓生物标记物研究方法标准化
(4节),积累可供参照的实际土壤污染对生物标记
物响应的数据资料,探索实际应用的可行性;2)在标
准化的基础上,对现有的生物标记物进行再筛选和
再评估,目标是筛选出那些在实际土壤污染条件下,
反应敏感,操作简便,具有较好重现性的生物标记
5735摇 19期 摇 摇 摇 史志明摇 等:蚯蚓生物标记物在土壤生态风险评价中的应用 摇
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物;3)进一步地,结合我国各地土壤类型划分,建立
赤子爱胜蚓生物标记物在各类洁净土壤中背景水平
的数据库,实际上这也有利于建立环境质量基
准[71];4)结合全国土壤污染普查数据和化学分析方
法,建立生物标记物同污染水平的对应关系,最终建
立通过生物标记物响应对土壤污染风险评价的模
型。 通过这些研究,应该能在很大程度上推动蚯蚓
生物标记物的研究和在实际土壤污染风险评价中的
应用。
4摇 蚯蚓生物标记物研究方法的标准化探讨
3节提出了推动蚯蚓生物标记物研究的一些建
议,其中,建立一种标准化的蚯蚓生物标记物试验方
法是重要的,据此,尝试提出了一个蚯蚓生物标记物
研究的推荐性方法(表 4)。 需要说明的是,表中所
列的只是主要需要标准化的条目,具体细节,尚需进
一步探讨。
表 4摇 蚯蚓生物标记物研究方法推荐导则
Table 4摇 Recommended guidelines for earthworm biomarkers study
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受试蚯蚓
Earthworm species
成年赤子爱胜蚓
大小为 0.3—0.4g
1)OECD常规毒理试验推荐的参考蚯蚓;2)对该蚯蚓的研究资料远远
多于其它蚯蚓,有比较完备的资料;3)易于获取;4)最好也同时规定蚯
蚓的饲养方式
暴露介质
Exposure medium 实地污染土壤
1)OECD参考土壤和滤纸不能直接反应污染场地现实;2)该推荐标准
直接用于土壤污染风险评价
暴露时间
Exposure time 28d(回避反应 2d)
现在资料中,除个别报道,绝大多数都暴露 28d(回避反应 2d),方便参
考以前资料
生物标记物
biomarkers
抗氧化酶
溶酶体稳定性
回避反应
乙酰胆碱脂酶
金属硫蛋白等
1)这些生物标记物受到研究者的广泛关注,研究资料丰富;2)相关测
定方法成熟;3)着眼于实际应用的角度,需要对各种生物标记物进行
再评估和筛选。
生物标记物测定方法
Bioassay methods of biomarker 严格规范
现有报道中关于酶生物标记物结果差异很大,尤其是对酶生物标记物
的测定做详细的规范,从缓冲液的配制,到最后结果的计算和表达
5摇 结论
在土壤污染风险评价中,蚯蚓生物标记物在理
论上具有独特的应用价值,虽然它无法替代传统的
化学分析方法,但它是化学分析手段的一种不可或
缺的有益补充。 虽然蚯蚓生物标记物的研究资料已
经很多,但目前依然不可能将其应用于实际的土壤
污染风险评价或预警。 显然,需要开展更多的工作,
其中重要的一项就是建立蚯蚓生物标记物研究的标
准化规程,结合中国实际,积累可供参考的数据,最
终可以将生物标记物理论融入到实际的土壤污染风
险评价和管理体系。
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