全 文 ：第 34 卷第 16 期
2014年 8月
生 态 学 报
ACTA ECOLOGICA SINICA
Vol.34,No.16
Aug.,2014
http: / / www.ecologica.cn
基金项目:国家自然科学基金项目(30860016);新疆师范大学科研处(XJNUBS1004); 微生物重点学科资助项目
收稿日期:2012鄄12鄄18; 摇 摇 网络出版日期:2014鄄03鄄04
*通讯作者 Corresponding author.E鄄mail: zw0991@ sohu.com
DOI: 10.5846 / stxb201212181817
张伟,陈一峰.棉花长期连作对新疆土壤细菌群落结构的影响.生态学报,2014,34(16):4682鄄4689.
Zhang W, Chen Y F. Analysis of the bacterial communities in continuous cotton fields of Xinjiang Province. Acta Ecologica Sinica, 2014, 34 ( 16):
4682鄄4689.
棉花长期连作对新疆土壤细菌群落结构的影响
张摇 伟1,2,*,陈一峰2
(1. 新疆师范大学生命科学学院,乌鲁木齐摇 830046; 2. 新疆农业科学院微生物应用研究所, 乌鲁木齐摇 830000)
摘要:新疆部分棉区发生连作障碍后与其他地区有所不同,能自发恢复并长期保持高产、稳产,为了查明该类棉田土壤细菌群落
结构在连作障碍发生及自发恢复整个过程中的演替规律。 以未开垦土地作为对照,利用 16S rRNA鄄PCR鄄DGGE(polymerase
chain reaction鄄density gradient gel electrophoresis)法对比研究了新疆阿克苏棉区分别连作 1、3、5、10、15 和 20a 棉田 1—30 cm 深
度土壤细菌群落结构组成。 结果表明未开垦土地细菌多样性指数丰富度最高,多样性和均匀度指数最低。 随着棉花连作年限
的延长,土壤细菌群落丰富度指数不断下降,而多样性和均匀度指数逐渐增大。 当连作年限继续延长至 10a后各指数出现恢复
或趋于达到一个新的相对稳定状态。 聚类分析显示 7个样品分别聚为 3簇,其中连作 3a的样品差异最大,相似度仅有 44%,而
连作 10a后的样品和对照较为相似。 主成分分析也有类似的结果。 对比回收的部分序列显示,序列间相似性在 88%以上,分属
于 Microbacterium、Uncultured Chloroflexi bacterium、TM7 Phylum sp. Canine、Flavobacteria等 4个不同菌属。 分析认为棉花长期连
作对该地区土壤细菌群落结构组成影响很大,但随着连作年限延长至 5a以后,细菌群落结构组成能自发趋于稳定和回升。 此
外,对比棉田细菌群落结构整体变化规律和棉花产量的增减及病虫害发生规律发现,在棉花长期连作过程中两者有很强的关
联性。
关键词:棉田土壤;细菌群落;16S rRNA鄄PCR鄄DGGE;聚类分析;主成分分析
Analysis of the bacterial communities in continuous cotton fields of Xinjiang
Province
ZHANG Wei1,2,*,CHEN Yifeng2
1 College of Life Science, XinJiang Normal University, Urumqi 830046, China
2 Institute of Microbiology, Xinjiang Academy of Agricultural Sciences Urumqi 830000, China
Abstract: Long鄄term continuous cropping of cotton has caused dramatic soil鄄borne diseases in many places, leading to
substantial agricultural losses. However, in some areas of Xingjang Province, the obstacles caused by continuous cotton
cropping can spontaneously restore and maintain high yields of cotton for many years. To analyze the variable spectrum of
soil bacterial communities and changes in the community structure in these spontaneously restored fields during cropping,
soils at depths from 1 to 30 cm were sampled from cotton fields with a history of 0, 1, 3, 5, 10, 15 or 20 years of cotton
cropping in the Akesu region of Xinjiang Province. The bacterial communities in these samples were studied using 16S
rRNA鄄based polymerase chain reaction鄄density gradient gel electrophoresis (PCR鄄DGGE) with samples from uncultivated
land as a control. Bacterial community diversity indices including the Shannon鄄Wiener diversity (H), Abundance index
(S) and Evenness index (EH) were compared among these samples. Samples from uncultivated land had relatively high
levels of the richness indices but both the Diversity and Evenness Indices were at lower levels. With increasing years of
cotton cropping, both the bacterial Diversity and Evenness Indices increased, whereas the richness indices showed a general
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decrease. However, after 10 years of continuous cropping all these indices were restored to their original values or reached a
relative stable level. Cluster analysis of DGGE fragments indicated that the seven samples were clustered into three
branches: fragments from samples under successional cropping for 0, 10 and 20 years formed one small branch with a
similarity of approximately 50%; fragments from successional cropping for 1, 5 and 15 years formed another branch with a
similarity of 53%; and the last branch comprised fragments from successional cropping for 3 years with a similarity of 44%.
Principal component analysis (PCA) showed that all of the samples were statistically correlated with the major component
and fluctuated on the right of the major component between the positive and negative axes of the second principal
component. Both cluster analysis and PCA results suggested that, compared to those from original uncropped fields, the
bacterial community structure showed the most variation in samples from the field of 3鄄year cropping, whereas similar
patterns of bacterial community structure were found between samples from fields of 10 years of cotton cropping and those
from uncropped fields. Nineteen clones were sequenced from each band and among them one sequence was selected and
submitted to GenBank (accessory no. JN572545鄄JN572563). By aligning with the GenBank database, all sequences from
DGGE were classified into four groups: Microbacterium, Uncultured Chloroflexi bacterium, TM7 Phylum sp. canine, and
Flavobacteria. Further analysis demonstrated that the isolated V3 sequences showed a homology of 88%—100% to known
sequences in GenBank and 47% of the sequences belonged to bacteria which were not cultured. No microbial data were
correlated with soil鄄borne plant diseases of cotton. The study demonstrated that the age of cotton fields had significant effects
on soil bacterial diversity. Continuous cotton cropping exerted significant influences on the community structure of soil
bacteria in Xinjiang Province, with an initial suppression effect on bacterial diversity. However, the bacterial community
reached a stabilized or even increased level compared with its original state after 5 years of continuous cropping. In addition,
correlations between variations in the bacterial community structure at a depth of 1—30 cm and the yield of cotton and pest
disease attacks were also found in this study.
Key Words: cotton field soils; bacterial communities; 16S rRNA鄄PCR鄄DGGE; cluster analysis; principal
component analysis
摇 摇 新疆是我国最早种植棉花的地区之一,也是目
前我国唯一的长绒棉种植基地。 由于新疆地区具有
日照充足,降水稀少,空气干燥等多种适于种植棉花
的自然环境条件,自 20 世纪 80 年代以来新疆棉花
的种植面积不断扩大,至 2012 年新疆棉花在种植面
积、总产量、平均亩产等 7 项指标上已连续 21a 位居
全国首位[1鄄2]。 与此同时,由于新疆农作物种类单
一,长期以来棉花连作现象严重,尤其是主产区,棉
花种植面积占到 95%以上,休作、轮作几乎是不可能
的。 连作障碍是植物和土壤两个系统内部诸多因素
综合作用的结果[3], 土壤微生物群落结构的稳定对
维持土壤系统的健康和质量非常关键[4], 对植物生
长具有重要作用[5]。 土壤微生物群落结构的变化会
直接影响土壤功能的发挥[6]。 与其他地区作物连作
一样,新疆棉花连作也带来了病虫害持续加重[7]、土
壤中农药、化肥、地膜污染长期积累等生态问题[8鄄9]。
但值得关注的是部分地区的棉花随着连作年限的继
续延长,发生连作障碍后只需施用较少的农药、化
肥,连作障碍现象会自发的缓解并长年保持高产、稳
产,因此连作年限达到 30a以上, 这一现象引起人们
的关注。
新疆棉花主产区存在着棉花连作时间跨度从
0—30a的各类棉田,棉花长期的种植已经形成了独
特的棉田土壤微生物群落[10鄄11]。 这些微生物参与土
壤物质转化过程,在土壤形成、肥力演变、农业污染
物的降解和土壤结构的形成与改良等方面起重要作
用,但长期的棉花连作对于微生物群落结构带来的
影响和微生物群落结构的变化与棉花连作后产量的
下降及病虫害发生规律之间的关系还不清楚。 PCR鄄
DGGE技术近些年在微生物生态领域有广泛的应
用[12鄄16],本文利用该技术着重研究随着棉花连作年
限的延长,土壤中细菌群落在组成、多样性和演替等
方面发生的变化,试图从土壤微生物生态的角度解
释新疆棉花长期连作后连作障碍的发生及自发消
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除,以及该地区棉花种植过程中病虫害的发生规律
与土壤微生物群落结构演替之间的联系。
1摇 材料和方法
1.1摇 样品的采集
采样时间和地点: 2011年 8 月于新疆阿克苏高
产棉区,选择棉花连作年限为 0(尚未开垦的土地)、
1、3、5、10、15和 20a的土地分别收集土样。 方法:土
钻垂直打下 30 cm(耕作层)深度取土,相同连作年
限的棉田选择不同的 5处采集等量样品混合后作为
一个土样,合计为 7 个土样。 采样范围在(E 80毅16忆
77义—24忆45义,N 41毅07忆47义—24忆85义)之间。 土样采集
后低温保存带回实验室,-80 益储存使用。
1.2摇 样品总 DNA的提取和纯化
DNA 的提取参照 Zhou 等的 SDS based DNA
extraction法[17鄄18],唯一改动之处是,在氯仿、异戊醇
抽提前多加了一步等体积的酚、氯仿和异戊醇抽提。
DNA的纯化按 Moreira的方法[19],每一 DNA 样品做
3个重复,等量混合后备用。
1.3摇 16s rRNA片段的 PCR扩增
第一套 PCR摇 用细菌的通用引物 For / Dev 扩增
差不多全长的 16s rRNA[20] (表 1)。 25 滋L 反应体
系:2.5 mmol / L 的 dNTP 2.8 滋L,2.5 滋L 10x Buffer,
1u Taq酶,引物各 3 pmol。 反应程序:94 益,5 min;
94 益,60 s;55 益,45 s;72 益,60 s,共 3O 个循环;
72 益,5 min后稳定在 4 益。
第二套 PCR摇 用 F341GC / R534 引物扩增细菌
16 s rRNA v3 区[21](表 1)。 25 滋L 反应体系:稀释
100 倍的第一套 PCR产物 1 滋L,2.5 mmol / L的 dNTP
2.8 滋L,2.5 滋L 10x Buffer,1 u Taq酶,引物各 5 pmol。
反应程序:94 益,5 min;94 益,60 s;55 益,45 s;
72 益,60 s;共 30 个循环: 72益,5 min 后稳定在
4 益。
1.4摇 PCR产物的 DGGE电泳
用 D鄄code System 电泳仪(Bio鄄Rad 公司)进行
DGGE电泳分离。 制备变性梯度凝胶,使聚丙烯酰
胺凝胶(Polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)浓
度为 6%—8%,变性梯度 30%—70% (7mol / L 尿素
和 4O%甲酰胺为 100%变性),电泳缓冲液为 1x
TAE,25 滋L 第二套 PCR产物在 6O 益,150 V条件下
电泳 4 h,取出后用硝酸银法染色[22]。 FR鄄 200 紫外
与可见分析装置(复日科技)下进行拍照。
表 1摇 用于 16s rRNA扩增的引物
Table 1摇 Primer for 16s rRNA amplication
引物名
Primer
16s rRNA位点
16s rRNA target
引物序列
Primer sequence(5忆—3忆)
参考文献
References
For 9—27 GAGTTTGATCCTGGCTCAG [20]
Dev 1541—1525 AGAAAGGAGGTGATCCAGCC [20]
F341鄄GC 341—359 GC鄄CCTACGGGAGGCAGCAG [21]
R534 534—518 ATTACCGCGGCTGCTGG [21]
摇 摇 在 5忆端加入了一个富含 GC序列的 GC夹:CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG G
1.5摇 数据处理
用 Quantity One v4.62软件对 DGGE 图谱进行数
字化、标准化后, 得到一个记录 DGGE 胶中条带迁
移位置和亮度的数字化矩阵。 系统自动依据条带的
有无按照非加权成对算术平均法(Unweighted Pair鄄
Group Method with Arithmetic,UPGMA)对各泳道土
壤样 品 进 行 聚 类 和 相 似 性 比 较。 用 Gel鄄Pro
analyzer、SPSS16.0 和 Excel 软件直接读取 DGGE 指
纹图谱条带信息,以代表每一细菌种群的条带在每
一泳道中亮度峰值的百分含量为重要值对样品进行
主成分( Principal component analysis, PCA)和相关
方差分析等工作。 用 Shannon鄄Wiener 指数(H)、丰
富度(S)和均匀度(EH)来评价土壤细菌群落的多样
性,其算式为:
H =移
s
i = 1
pi lnpi
EH = H / Hmax = H / lnS
式中,pi为某一条带的强度与同泳道中所有条带总强
度的比值,S 为每一泳道总的条带数[23]。 根据泳道
的 pi值进行 PCA分析。
1.6摇 特异序列的回收及信息比对
选择并回收 DGGE 凝胶上 0a 样品中所占灰度
比较大的条带和连作样品中出现的特异条带。 回收
和克隆参考 Daniela 的方法[24]。 对回收的序列上传
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至 GenBank,获得的序列号是 JN5725鄄 63。 通过
BLAST查询及 CLUSTAL X2.0、MEGA4.0 软件处理
构建相关序列进化树。
2摇 结果与讨论
2.1摇 连作对棉田细菌多样性的影响
细菌 16s rRNA 的 PCR鄄DGGE 图谱显示条带数
较多,可见各样品中细菌多样性都很丰富。 其中不
同连作年限土样分离出有相同的带也有不同的带,
但带的多少及光密度都发生了较大变化(图 1)。 通
过软件进一步数字化处理后得到表示土壤细菌多样
性的 Shannon鄄Wiener指数(H)、丰富度(S)和均匀度
(E)指数。 由数据看出,香农多样性指数未开垦地
最低为 2.98,随着连作年限的增加,细菌多样性指数
先增加后减少,其中连作 5—15a 的数值比较稳定。
丰富度未开垦土地最高为 69,连作后都有所降低,最
低为未开垦地为 46。 均匀度是未开垦地最低为 0.
668,连作后有所增加,其中 10a 的最高为 0郾 887(表
2)。 由此可知棉花长期连作使土壤细菌群落结构类
型发生了很大改变[25鄄28]。 首先,未开垦土样香农多
样性和均匀度指数最低,但其丰富度最高,分析原因
可能是原生态土壤中有机质和水分等含量较少不利
于细菌的大量繁殖,但细菌群落结构组成较丰
富[12]。 其次,棉花的种植使土壤中细菌多样性和均
匀度增大,而丰富度下降,尤其是连作前 5a 各指数
的变化较大,而随着连作年限的继续延长,各指数的
变化趋缓。 分析原因可能是棉花的种植给土壤输入
较多的有机质等营养物质导致细菌的大量繁殖,而
某些种类的细菌由于环境的不利改变而消失[7]。
图 1摇 棉花连作 0、1、3、5、10、15、20a的土壤细菌 16s rRNA DGGE图谱及聚类分析
Fig.1摇 DGGE patterns and cluster analysis of 16s rRNA from 0, 1, 3, 5, 10, 15 and 20 years cotton continuous cropping field, respectively
表 2摇 各样品细菌 16s rRNA DGGE图谱多样性指数(H)、均匀度(E)和丰富度(S)指数
Table 2摇 Shannon鄄Weaver diversity (H), eveness index (E) and abundance index (S) of the cotton soils bacterial community with difference
continuous cropping years
样品
Number
样地
Sample
香农鄄威纳指数
Shannon鄄Wiener diversity
丰富度指数
Abundance index
均匀度指
Eveness index
1 连作 0a 2.98依0.13b* 69依4.5a 0.668依0.06a
2 连作 1a 3.12依0.14b 46依0.6a 0.841依0.03b
3 连作 3a 3.41依0.17a 67依0.5a 0.811依0.02b
4 连作 5a 3.28依0.13b 56依3.5b 0.815依0.01b
5 连作 10a 3.44依0.11a 48依4.0b 0.887依0.07a
6 连作 15a 3.65依0.10a 67依0.5a 0.868依0.02b
7 连作 20a 3.06依0.09a 48依0.5b 0.790依0.04a
摇 摇 *a, b表示在 P<0.05水平下有显著差异
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2.2摇 连作对棉田细菌群落结构组成的影响
聚类分析结果表明:土壤中细菌群落结构组成
发生了较大的变化。 其中,连作 1、5 和 15a 的聚为
一小类,相似度达 55%以上。 连作 0、10 和 20a 的聚
为另一小类,相似度达 50%以上。 而连作 3a 的最后
才聚到一起,相似度只有 44%(图 1)。 可见连作 3a
的土样细菌群落结构变化最大,而随着棉花连作年
限的延长,细菌群落结构呈现反复波动并有恢复的
趋势。 对 DGGE 图谱各泳道每个条带的 P i 值进行
主成分分析,结果表明,第一主成分方差贡献率达
55.37%,第二主成分方差贡献率达 15.5%,积累方差
达 70.87%。 在这两个主成分为坐标轴构建的二维
坐标系中,不同连作年限样品与对照相比都发生了
明显的位置变化,但又明显被分为两组,其中连作 5、
10、和 20a样品与对照较为一致,而连作 1、3 和 15a
样品变化趋势较一致,其中棉花连作 3a 对土壤细菌
群落组成影响最大,这点和聚类分析结果一致(图
2)。 总体分析原因可能在外界环境发生长期一致的
改变后,土壤细菌群落为应对外界环境的变化自发
的调整结构类型,表现在反复波动中逐渐恢复并稳
定下来,同时显示出一定的稳定性[25]。 由此可见棉
花的长期种植不仅改变了原土壤细菌群落的微环
境,并影响了土壤细菌群落结构组成。
图 2摇 样品细菌群落结构主成分分析
Fig.2摇 Principal component analysis of the monoculture cotton
soil bacterial with different years
2.3摇 序列同源性分析
条带 1—8是 0a样品强度较大的,条带 a—k 是
棉花连作不同年限后新出现的强度较大的(图 1)。
这 19个条带之间同源性在 88%—100%之间。 部分
序列 与 已 知 的 Microbacterium insulae、 Devriesea
agamarum、 Atopobium rimae 等微生物同源性达到
100%,并隶属于多个属。 查阅已知的与 DGGE 凝胶
上回收条带序列同源性最近的微生物信息,都属于
土壤中常见的类型(进化树结果)(图 3)。 由于土壤
细菌数量和种类繁多,DGGE 凝胶上出现的条带很
多,而每一条带代表的是一类细菌[26],虽然回收了
部分特异的条带,但测序后并没有发现有导致棉花
病虫害的微生物信息,至于哪些菌群发生的改变会
影响棉花产量和病虫害的发生还有待深入研究[26]。
2.4摇 连作棉花发病规律、产量变化与土壤细菌群落
结构变化的关系
耕作土中细菌群落的结构组成和分布特征受土
壤理化性质、当地水文气候等的影响[27],此外耕作
制度对土壤细菌结构组成的影响也是非常重要
的[28鄄29]。 目前关于农作物连作对土壤细菌群落组成
的研究比较多,但还是不能完全清楚土壤微生物与
作物之间的复杂相互关系。 新疆作为我国长绒棉种
植基地,与其他地区作物连作一样,起初棉花连作也
带来了病虫害加重、产量下降等负面影响[30],但随
着连作年限的继续延长,连作障碍的现象能自发缓
解[7]。 针对这一现象本文研究了 0—20a 棉花连作
过程中土壤细菌群落结构组成的变化规律。 在参考
当地农技部门记载的数据和走访棉花种植户后发
现:棉花连作障碍的发生与土壤细菌群落结构的变
化规律在时间上比较一致[31鄄32]。 比如,连作 3a 是产
量较低、病虫害较重的阶段,而土壤细菌群落结构变
化也最大。 随着连作年限延长至 5a 之后各种负面
影响趋于减缓,10a之后甚至出现恢复的迹象。 研究
后发现土壤细菌群落组成也在这个阶段出现稳定及
恢复的趋势。 但由于土壤细菌组成和功能的复杂
性,对于土壤细菌群落组成与农作物之间的互作关
系了解较少,因此还需要做更深入的研究才能更好
的给当地棉花连作造成的土传病虫害防治及耕作管
理制度的改善提供指导[33]。
3摇 结论
首先:与利用其他方法的相关研究报道有相似
之处[33鄄34],都发现棉花单一作物长期连作对本地区
土壤细菌群落结构组成及功能有重大影响,表现在
随着连作年限的增加,土壤细菌结构组成发生反复
波动。 当连作年限超过 5a 后,土壤细菌群落组成逐
渐趋于稳定,并与原生态土壤细菌结构组成有一
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图 3摇 对回收的序列和相似性序列绘制系统树
Fig.3摇 The closest sequence match of known phylogenetic affiliation to band sequences extracted from DGGE gel
定的相似性。 其次,长期一致的外界胁迫可以使土
壤微生物群落结构组成发生适应性改变,但在某些
特殊的环境下也有可能形成新的、稳定的、健康的、
适合作物长期种植的结构类型。 此外,在长期的连
作过程中,土壤会发生“细菌型冶向“真菌型冶的转
变[35],因此也有必要研究土壤真菌的结构组成及多
样性随着连作年限延长发生的变化。
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