全 文 ：食用菌学报 2009.16(1):1 ～ 5
收稿日期:2008-11-07原稿;2009-01-25 修改稿
基金项目:农业部公益性行业科研专项项目“食用菌菌种质量评价与菌种信息系统研究与建立”(编号:nyhyzx-07-
008)的部分研究内容
作者简介:何丽鸿(1979-), 女 , 2005年毕业于南京农业大学生命科学院 ,硕士 , 主要从事堆肥中的分子生态学方面
的研究 ,发表主笔论文 3 篇。
＊本文通讯作者
文章编号:1005-9873(2009)01-0001-05
采用扩增核糖体 DNA限制性分析(ARDRA)研究
双孢蘑菇培养料后发酵过程中的细菌群落结构(Ⅱ)
———细菌群落结构ARDRA分析
何丽鸿1 , 2 , 于荣利1 , 陈明杰1＊ , 潘迎捷3
(1中华人民共和国农业部应用真菌资源与利用重点开放实验室 , 上海市食用菌工程技术研究中心 ,
上海市农业遗传育种重点实验室 , 上海市农业科学院食用菌研究所 , 上海 201106;
2南京农业大学生命科学院微生物系 , 江苏南京 210095;3上海海洋大学 , 上海 200090)
摘 要:采用 ARDRA 对双孢蘑菇[ Agaricus bisporus(Large)Sing.] 培养料后发酵过程中的细菌群落结构进
行研究。细菌 16S rDNA 文库 ARDRA 分析结果表明 ,细菌群落在后发酵过程中发生了明显变化 , 4 个时期文
库的 16S rDNA 组成分别以各自独有酶切类型为主。ARDRA 文库优势类群的序列分析结果显示 , 培养料中
的细菌组成远多于传统分离方法所获得的类群:在“空气调节” 时期培养料(C6)中发现了一些未曾报道的
Bacilli门成员 , 如 Trichococcus 属 、Planococcus 属和Caryophanon 属 ,以及γ-Proteobacte ria亚纲;而在“后发
酵”开始和结束的培养料(C1 和 C7)中分别检测到了 Thermus thermophilus 和α-Proteobacter ia亚纲的细菌 ,
这些是近年来利用分子生物学方法在高温堆肥中发现的新类群;同时 , 在整个“后发酵”过程中还发现了大量
目前尚未获得培养的细菌类群。
关键词:双孢蘑菇;培养料后发酵;细菌 16S rDNA;细菌群落结构;ARDRA
扩增核糖体 DNA 限制性分析(Amplified
Ribosomal DNA Restriction Analysis , ARDRA)
是将PCR技术和 RFLP 技术相结合衍生的分子
技术 ,应用于 rDNA限制性片段长度多态性的分
析 ,对微生物遗传多样性 ,尤其是微生物的分类
具有重要意义。本文在有效提取后发酵培养料
中微生物 DNA 、成功构建细菌 16S rDNA 文库[ 1]
的基础上 , 运用 ARDRA 技术对双孢蘑菇
[ Agaricus bisporus(Large)Sing.]培养料后发酵
4个代表时期的细菌群落结构进行研究。期望为
今后利用现代分子生态学方法快速 、准确地检测
培养料发酵过程中的微生物群落组成提供基础 ,
同时为建立培养料后发酵的定量判断指标提供
参考 。
1 材料与方法
1.1 16S rDNA克隆文库构建
双孢蘑菇后发酵培养料样品 C1 、C3 、C6和 C7
的采样时期分别为后发酵开始 、巴氏消毒结束 、空
气调节第 5天和后发酵结束。样品中微生物 DNA
的提取 ,PCR扩增 ,产物回收 、克隆和 16S rDNA克
隆文库构建及插入情况检测见参考文献[ 1] 。
1.2 ARDRA 分析
质粒用标准方法提取[ 2] , 然后用引物 RV-M
(5 -GAGCGGATAACAATT TCACACAGG -3 )和
M13-47 (5 -CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACG
AC-3 )扩增其中的 16S rDNA 插入片段 , 所得
PCR产物经浓缩后分别用 Hha I 和 A fa I 两种
限制性内切酶(宝生物工程有限公司 ,大连)37 ℃
消化 2.5 h。酶切 DNA 片段用 2%的琼脂糖凝
胶电泳分离 , 经溴化乙锭染色和 VDS 凝胶成像
系统(Pharmacia ,美国)照相后 , 所得 DNA 带型
图谱进行人工比较分析 。
1.3 酶切图谱分析
酶切图谱分析所用指标有丰富度 、香农-威纳
指数 、辛普森多样性指数和均匀度 ,计算公式依
食 用 菌 学 报 第 16 卷
次为:d=(S-1)/ lnN (S:16S rDNA 酶切产生的总
类型数 ,N:总克隆数)、H= -Pilog2Pi(Pi:第i种
16S rDNA酶切类型出现的频率)、D=1-Pi2 和
E=H/Hmax(Hmax为最大多样性)。
1.4 系统发育分析
委托上海博亚生物技术有限公司对各文库中丰
度较高(包含克隆数≥5)的酶切类型进行 16S rDNA
部分序列测定 ,测序结果在 GenBank数据库中进
行BLAST比对 ,检索相近序列 。应用 C lustalX软
件计算本试验获得序列及数据库中相近序列的
亲缘关系 ,并用 Mega2 软件构建系统发育树。
2 结果与分析
2.1 16S rDNA的限制性酶切结果
4份培养料样品 16S rDNA 的 PCR扩增产
物均约为 1.5 kb , 4个文库的目的片段插入效率
均在 90%以上[ 1] 。扩增产物分别以限制性内切
酶 A f aI 和 HhaI进行酶切 ,用 2%的琼脂糖凝胶
进行电泳检测 ,部分电泳结果见图 1和图 2。
如图所示 , 限制性内切酶 HhaI 和 A f aI
相结合对插入片段扩增产物进行酶切 , 能很
好地反映细菌 16S rDN A 序列组成的遗传多
样性 。
2.2 酶切类型统计结果
酶切结果统计过程中 ,4 个文库挑取的总克
隆数均为 150个 ,去掉部分未切开和条带分辨不
清的克隆 ,C1 、C3 、C6和 C7文库中成功酶切检测
的克隆数分别为 97 、95 、95 和 91 ,共 378 个克隆
获得理想 A f aI-HhaI酶切条带 ,可分为 220个酶
切类型。
对 4个文库的酶切图谱进行比较发现 ,各文
库均含有极为丰富的遗传发育类型 ,分别产生
75 、64 、37和 49个酶切类型 ,说明培养料中的细
菌组成极为丰富 。“后发酵”前期文库 C1和 C3 ,
其稀有酶切类型(即只包含 1 个克隆的酶切类
型)所占比例均超过了 80%(分别为 87%和
83%);而“后发酵”后期文库 C6 和 C7 中稀有酶
切类型的比例大幅下降(仅为 59%和 65%),这可
能与“空气调节”使得各种优势微生物大量繁殖
有关 。
4个时期文库分别以各自独有的遗传类型为
主 ,其中单独含有的酶切类型均占到总酶切类型
的 90%以上 ,文库 C1 、C3 、C6和 C7文库中独有
酶切类型比例分别为98%、95%、97%和94%,即
“后发酵”过程中细菌群落结构组成发生了较大
的变化。
2.3 文库多样性分析
应用系列多样性指数 ,对 4 个时期培养料
细菌 16S rDNA 文库遗传类型的数量(丰富度)
和分布频率(均匀度)进行比较。从表 1 可以看
出 ,文库 C6和 C7 的丰富度较文库 C1和 C3有
所下降 ,分析原因可能是“巴氏消毒”过程温控
较高(57 ～ 58 ℃),此时的培养料温度可达 62 ℃,
能有效地杀死那些有害细菌及其孢子 ,经过“空气
调节”后 , 仅有一些能适应高温的嗜热细菌
存活。
从 4 份培养料样品的香农-威纳指数和辛普
森指数可以看出 , “空气调节”后的 C6 和 C7 文
库克隆的 HhaI-A f aI 酶切类型多样性较“空气
调节”前 C1和 C3显著下降 。同时 C6文库的均
匀度也明显下降 , 进一步说明“空气调节”过程
中一些嗜热细菌快速繁殖 , 成为培养料中的优
势类群 。
2
第 1 期 何丽鸿 ,等:采用扩增核糖体 DNA 限制性分析(A RDRA)研究双孢蘑菇培养料后发酵过程中的细菌群落结构(Ⅱ)
表 1 四个文库的酶切类型多样性指数
Table 1 Diversity indices of four composts
样品编号
Sample
no.
多样性参数 Diversity index
丰富度
Margalef
香农-威纳指数
Shannon-Weiner
均匀度
Evenness
辛普森指数
Simpson s
C1 16.169 5.8972 0.893 0.975
C3 14.054 5.3284 0.811 0.982
C6 7.905 4.4723 0.681 0.926
C7 10.641 5.1632 0.792 0.959
2.4 文库中优势菌群的比较
对 4个文库中包含克隆数≥2的酶切类型进
行统计 ,将其中克隆数≥5 的酶切类型定义为优
势类群。
C1文库中最重要的优势类群是DM-2 ,检测的
97个克隆中有 11个属于该酶切类型 ,其丰度为
11.3%。其次 ,酶切类型DM-4 、DM-8和DM-10各
包含 3 个克隆 ,丰度为 3.1%,而 DM-1 、DM-3 、
DM-5 ～ DM-7 和DM-9类型各包含 2个克隆。
文库 C3中优势类群 DM-12 和 DM-17 各包
含 5个克隆 ,丰度为 5.3%。同时 , DM-11 、DM-
13 、DM-14 和 DM-18 类型为 3 个克隆 , DM-5 、
DM-15 、DM-16 、DM-19 和 DM-20 类型仅包含 2
个克隆。其中 ,酶切类型 DM-5也是 C1 文库中
检测到的酶切类型 。
在 95个克隆的 C6文库中 ,DM-26 酶切类型
包含 18个克隆 ,丰度最高(为 18.9%)。酶切类
型 DM-21 和 DM-24 均为 10 个克隆 , 丰度为
10.5%,其中酶切类型 DM-21 在 C1文库中仅含
1个克隆 ,即在 C1文库中的稀有类群 DM-21 在
“空气调节”阶段迅速繁殖 ,而在 C6文库中成为
重要的优势类群。文库 C6 中的另一重要优势
类群为 DM-23 , 丰度为 6.3%。此外 , DM-28 、
DM-33 、DM-22 、DM-30 、DM-31 、DM-25 、DM-27 、
DM-29 、DM-32 、DM-34 和 DM-35类型克隆数分
别为 4 、4 、3 、3 、3 、2 、2 、2 、2 、2和 2个。
在“后发酵”结束时的克隆文库 C7 中 ,酶切
类型 DM-40的丰度最高 ,为 12.1%,包含 11 个
克隆;其次是 DM-12和 DM-36 ,各含 7 个克隆 ,
7.7%的丰度;DM-41 类型 4个克隆;3个克隆的
有 DM-42 、DM-43 、DM-45和 DM-46类型;另有 2
个克隆的 DM-30 、DM-37 ～ DM-39 、DM-44 、DM-
47 ～ DM-50共 9个类型 。其中 ,酶切类型 DM-12
也是文库 C3 中的重要优势类群 ,而 DM-36 和
DM-30在文库 C6中分别以稀有类群和 3个克隆
被检测到 。
2.5 优势菌群的序列测定及系统发育分析
测序和 BLAS T 序列比对结果见表 2。
表 2 优势菌群的 16S rDNA序列测序和 BLAST比对结果
Table 2 Sequences and phylogenetic aff iliations of the dominant types of bacterial 16S rDNA
克隆酶切类型
Clone no.
登录号
Sequence
accession no.
相似物种
BLAST match
登录号
Refer ence
sequence
accession no.
分类地位
Phylogene tic
aff ilia tion
最大相似率
Sim ilar ity
C1-DM-2 DQ082892 嗜热栖热菌 L1菌株
Ther mus thermophilus str ain L1
AY788091 Deinococci 99%
C3-DM-12 DQ082884 不可培养α-变形菌
Uncultur edα-Proteobacter ia AY92224 α-Proteobac teria 94%
C3-DM-17 DQ082886 不可培养细菌克隆 LBA6
Uncult ured bacter ium , clone LBA6 AF392743 Unclassifiedbac te rium 93%
不可培养酸杆菌克隆 AKYC420
Uncultured Acidobac teria bacter ium
clone AKYC420
AY922010 Acidobac te ria 92%
C6-DM-21 DQ082890 不可培养细菌SOB-49
Uncultur ed bacte rium , clone SOB-49 AB126371 Unclassifiedbac te rium 99%
Trichococcus pasteurii X87150 Bac illi 99%
C6-DM-23 DQ082888 Planomicrobium sp . AF144750 Bac illi 98%
C6-DM-24 DQ082887 鲁氏不动杆菌 Acine tobacter lwoffii AY176770 γ-P roteobacter ia 99%
C6-DM-26 DQ082891 动性球菌属Mali 167
Planococcus sp.Mali 167 AY211170 Bac illi 98%
C7-DM-12 DQ082889 Phyllobacteriu m trifolii AY786080 α-Proteobac teria 94%
C7-DM-40 DQ082885 根瘤菌M100
Rhizobiaceae str ain M100
AF345860 α-Proteoba teria 99%
3
食 用 菌 学 报 第 16 卷
文库 C1中最重要的优势类群 DM-2 , 同嗜
热栖热菌(T .thermophi lus)的序列相似性高达
99%。这是近年来在高温堆肥中发现的一个新
类群 ,其最适生长温度为 65 ～ 75 ℃;在有机物降
解方面 ,尤其在 65 ～ 80 ℃的产热过程中发挥着
重要作用。2000年 BLANC等利用 ARDRA方
法分析堆肥中的嗜热细菌组成 ,在挑取的 200个
克隆中有 69 个被确定为嗜热栖热菌(T .
thermophi lus )和芽孢杆菌(Bacillus sp .)[ 3] 。
文库C3中的 DM-12同不同培养α-变形菌的
同源性为 94%;而该文库中的另一重要类群 DM-17
是一类尚未获得培养的酸杆菌纲(Acidobacteria)细
菌 ,在已知的微生物中 ,与其同源性最高的两类
微生物也是从环境样品中筛选出的 ,但同源性仅
有 93%和 92%。
文库 C6中的 DM-21 、DM-23和 DM-26均属
于芽孢杆菌纲:其中 DM-23和 DM-26都是动性球
菌科(Planococcaceae)的 成 员 , DM-23 同 P.
koreense 的同源性为98%, 而 DM-26同动性球菌
属中的“Mali 167”种同源性为 98%。除此外 ,文库
C6中的 DM-24同 γ-变形菌(γ-Proteobacteria)亚
纲中的鲁氏不动杆菌(Acinetobacter lwoffii)同源
性为 99%。虽然在以往的报道中[ 3 , 4] ,也证实在高
温堆肥中有芽孢杆菌纲和γ-Proteobacteria亚纲细
菌的存在 ,然而在具体的种属分布上与本文试验结
果并不完全相同 ,这也说明独特的双孢蘑菇培养料
“二次发酵”工艺对其中微生物的区系组成有较大
影响。
文库 C7中的 DM-40同韩国蘑菇培养料中
分离出的 Rhizobiaceae st r.M100序列同源性高
达 99%。可见虽然各国家或地区的“二次发酵”
工艺存在具体差异 ,但因其基本原理相同 ,所以
在优势微生物的组成上也具有相同点。文库 C7
中 , 另一 类重要 的优势 类群是 DM-12 , 与
Phyllobacterium tri folii 同源性为 94%。酶切分
析结果显示 , DM-12也是文库 C3中的优势菌群 。
序列测定结果进一步证实 C7-DM-12与 C3-DM-
12为同一类群。
为了更为直观地分析和比较各文库中的优
势细菌类群 ,对本研究获得的序列以及数据库中
的相近序列进行亲缘关系分析并建立系统发育
树 ,如图 3。
括号中数字为 GenBank 登录号
The number in p ar en th eses is th e GenBank accession number , the distance bar in dicates a 5% d ifference in th e
nucleic acid sequen ce
图 3 优势酶切类型代表菌株的系统发育分析
Fig.3 Phylogenetic analysis of representative strains of the dominant restriction types
系统发育树中 ,后发酵不同时期培养料的优
势细菌可大致分为三大类群:
第一类是芽孢杆菌纲 ,主要包括文库 C6 中
的 3个优势类群 , C6-DM-21 、C6-DM-23以及C6-
4
第 1 期 何丽鸿 ,等:采用扩增核糖体 DNA 限制性分析(A RDRA)研究双孢蘑菇培养料后发酵过程中的细菌群落结构(Ⅱ)
DM-26。分别同源于 Trichococcus pasteuri i 、
Planococcus sp .`Mali 167 和 P .koreense ,均是
首次在高温堆肥中被检测到。然而同 DEES and
GHIORSE
[ 5] 等研究结果一样 , 在该试验中却未
检测到一直被认为是高温堆肥中最为重要的芽孢
杆菌属嗜热细菌。培养料 C6取自“后发酵”的“空
气调节”阶段 ,此阶段有益嗜热细菌迅速繁殖 ,并
通过其生理代谢将培养料转化成有利双孢蘑菇菌
丝生长利用的“选择性”基质 ,可以推测芽孢杆菌
纲细菌类群在“空气调节”阶段发挥了重要作用。
系统发育树中的另一大分支是 Proteobacteria
纲细菌 ,分属α-Proteobacteria 和 γ-Proteobacteria
两个亚纲 。其中文库 C6中优势菌C6-DM-24隶属
于γ-Proteobacteria 亚纲 ,文库 C7中的两个优势类
群 C7-DM-12和 C7-DM-40以及文库 C3中的 C3-
DM-12则同属于α-Proteobacteria 亚纲。2000年 ,
PETERS等对堆肥(玉米秆 、木屑组成)中的细菌进
行 PCR-SSCP(聚合酶链式反应-单链构象多态 ,
Polymerase Chain Reaction-Single Strand
Conformation Polymorphism)分析时 ,也发现堆肥
中同时分布着大量的γ-Proteobacteria 亚纲和α-
Proteobacteria亚纲细菌[ 6] 。
第三分支是由分别以 C1-DM-2 和 C3-DM-
17为代表的嗜热栖热菌(T .thermophi lus)和酸
杆菌(Acidobacter ia)组成 。
3 讨 论
ARDRA 的分析强度在一定程度上受所挑取
克隆数量限制 。培养料中的细菌组成极为丰富 ,
且 4个文库中均含有大量的稀有酶切类型 ,这些
稀有类群的被检出概率是很低的 ,也有很大的随
机性 ,因此只有挑取的克隆数目达到一定量 ,才
能对文库中优势类群进行有效检测。
以 ARDRA 分析过程中所累计的酶切类型
数目作为已分析的 16S rDNA 克隆子的函数 ,分
析 ARDRA 酶切类型在克隆子中的分布情况 ,不
仅可以对克隆子挑取过程中的随机性进行判断 ,
还可以对检测的分析强度进行评价[ 7] 。本试验
发现 ,文库 C7中包含大量的稀有酶切类型 ,较文
库 C6丰富。可见 ,同样挑取约 90 个的克隆子进
行 ARDRA 分析 ,在分析强度上 C6文库要优于
C7文库;如以含有更多稀有酶切类型的 C1或 C3
文库同 C6文库进行比较 ,分析强度差异则更为
显著 。
由于环境样品的微生物组成极其丰富 ,而各
种方法在具体应用中都会存在这样或那样的缺
陷 ,目前任何方法都不能穷尽对其中微生物的认
识;但是 ,这些方法的应用却使新微生物类群不
断被发现 ,所以各种方法的有效结合也必然会使
人们对环境微生物的了解更加深入。ARDRA 方
法的应用不仅可以对传统的研究结果进行验证 ,
而且可拓宽和加深对堆肥这一复杂生境中微生
物的认识 。
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[本文编辑] 于荣利
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