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摇 摇 摇 摇 摇 生 态 学 报
摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 (SHENGTAI XUEBAO)
摇 摇 第 31 卷 第 21 期摇 摇 2011 年 11 月摇 (半月刊)
目摇 摇 次
基于景观格局理论和理想风水模式的藏族乡土聚落景观空间解析———以甘肃省迭部县扎尕那村落为例
史利莎,严力蛟,黄摇 璐,等 (6305)
……
……………………………………………………………………………
武夷山风景名胜区景观生态安全度时空分异规律 游巍斌,何东进,巫丽芸,等 (6317)…………………………
旅游地道路生态持续性评价———以云南省玉龙县为例 蒋依依 (6328)…………………………………………
城市空间形态紧凑度模型构建方法研究 赵景柱,宋摇 瑜,石龙宇,等 (6338)……………………………………
丹顶鹤多尺度生境选择机制———以黄河三角洲自然保护区为例 曹铭昌,刘高焕,徐海根 (6344)……………
西南喀斯特区域水土流失敏感性评价及其空间分异特征 凡非得,王克林,熊摇 鹰,等 (6353)…………………
流域尺度海量生态环境数据建库关键技术———以塔里木河流域为例 高摇 凡,闫正龙,黄摇 强 (6363)………
雌雄异株植物鼠李的生殖分配 王摇 娟,张春雨,赵秀海,等 (6371)………………………………………………
长白山北坡不同年龄红松年表及其对气候的响应 王晓明,赵秀海,高露双,等 (6378)…………………………
不同高寒退化草地阿尔泰针茅种群的小尺度点格局 赵成章,任摇 珩,盛亚萍,等 (6388)………………………
残存银杏群落的结构及种群更新特征 杨永川,穆建平,TANG Cindy Q,等 (6396)……………………………
濒危植物安徽羽叶报春两种花型的繁育特性及其适应进化 邵剑文,张文娟,张小平 (6410)…………………
神农架海拔梯度上 4 种典型森林的乔木叶片功能性状特征 罗摇 璐,申国珍,谢宗强,等 (6420)………………
不同植被恢复模式下煤矸石山复垦土壤性质及煤矸石风化物的变化特征
王丽艳,韩有志,张成梁,等 (6429)
………………………………………
……………………………………………………………………………
火烧对黔中喀斯特山地马尾松林分的影响 张摇 喜,崔迎春,朱摇 军,等 (6442)…………………………………
内蒙古高原锦鸡儿属植物的形态和生理生态适应性 马成仓,高玉葆,李清芳,等 (6451)………………………
古尔班通古特沙漠西部梭梭种群退化原因的对比分析 司朗明,刘摇 彤,刘摇 斌,等 (6460)……………………
白石砬子国家级自然保护区天然林的自然稀疏 周永斌,殷摇 有,殷鸣放,等 (6469)……………………………
黑龙江省东完达山地区东北虎猎物种群现状及动态趋势 张常智,张明海 (6481)………………………………
基于 GIS的马铃薯甲虫扩散与河流关系研究———以新疆沙湾县为例 李摇 超,张摇 智,郭文超,等 (6488)……
2010 年广西兴安地区稻纵卷叶螟发生动态及迁飞轨迹分析 蒋春先,齐会会,孙明阳,等 (6495)……………
B型烟粉虱对寄主转换的适应性 周福才,李传明,顾爱祥,等 (6505)……………………………………………
利用 PCR鄄DGGE方法分析不同鸡群的盲肠微生物菌群结构变化 李永洙,Yongquan Cui (6513)………………
鸡粪改良铜尾矿对 3 种豆科植物生长及基质微生物量和酶活性的影响
张摇 宏,沈章军,阳贵德,等 (6522)
…………………………………………
……………………………………………………………………………
铜绿微囊藻对紫外辐射的生理代谢响应 汪摇 燕,李珊珊,李建宏,等 (6532)……………………………………
10 种常见甲藻细胞体积与细胞碳、氮含量的关系 王摇 燕,李瑞香,董双林,等 (6540)…………………………
冬季太湖表层底泥产毒蓝藻群落结构和种群丰度 李大命,孔繁翔,于摇 洋,等 (6551)…………………………
城市机动车道颗粒污染物扩散对绿化隔离带空间结构的响应 蔺银鼎,武小刚,郝兴宇,等 (6561)……………
新疆城镇化与土地资源产出效益的空间分异及其协调性 杨摇 宇,刘摇 毅,董摇 雯,等 (6568)…………………
山东潍坊地下水硝酸盐污染现状及 啄15N溯源 徐春英,李玉中,李巧珍,等 (6579)……………………………
增温对宁夏引黄灌区春小麦生产的影响 肖国举,张摇 强,张峰举,等 (6588)……………………………………
一种估测小麦冠层氮含量的新高光谱指数 梁摇 亮,杨敏华,邓凯东,等 (6594)…………………………………
黄河上游灌区稻田 N2O排放特征 张摇 惠,杨正礼,罗良国,等 (6606)…………………………………………
专论与综述
植物源挥发性有机物对氮沉降响应研究展望 黄摇 娟,莫江明,孔国辉,等 (6616)………………………………
植物种群更新限制———从种子生产到幼树建成 李摇 宁,白摇 冰,鲁长虎 (6624)………………………………
研究简报
遮荫对两个基因型玉米叶片解剖结构及光合特性的影响 杜成凤,李潮海,刘天学,等 (6633)…………………
学术信息与动态
科学、系统与可持续性———第六届工业生态学国际大会述评 石海佳,梁摇 赛,王摇 震,等 (6641)……………
期刊基本参数:CN 11鄄2031 / Q*1981*m*16*340*zh*P* ￥ 70郾 00*1510*37*
室室室室室室室室室室室室室室
2011鄄11
封面图说: 鹤立———丹顶鹤是世界 15 种鹤数量极小的一种,主要栖息在沼泽、浅滩、芦苇塘等湿地,以捕食小鱼虾、昆虫、蛙蚧、
软体动物为主,也吃植物的根茎、种子、嫩芽。 善于奔驰飞翔,喜欢结群生活。 丹顶鹤属迁徙鸟类,主要在我国的黑
龙江、吉林,俄罗斯西伯利亚东部、朝鲜北部以及日本等地繁殖。 在长江下游一带越冬。 在中国文化中有“仙鹤冶之
说。 被列为中国国家一级重点保护野生动物名录,濒危野生动植物种国际贸易公约绝对保护的 CITES 附录一物种
名录。
彩图提供: 陈建伟教授摇 国家林业局摇 E鄄mail: cites. chenjw@ 163. com
第 31 卷第 21 期
2011 年 11 月
生 态 学 报
ACTA ECOLOGICA SINICA
Vol. 31,No. 21
Nov. ,2011
http: / / www. ecologica. cn
基金项目:山东省教育厅科技计划项目(J06K58);临沂大学博士科研启动基金(BS07011);日本学生支援机构归国外国留学生短期研究制度基
金项目(JP22GR037)
收稿日期:2011鄄01鄄28; 摇 摇 修订日期:2011鄄09鄄01
*通讯作者 Corresponding author. E鄄mail: riyongzhu@ yahoo. com. cn
李永洙,Yongquan Cui.利用 PCR鄄DGGE方法分析不同鸡群的盲肠微生物菌群结构变化.生态学报,2011,31(21):6513鄄6521.
Li Y Z,Yongquan_Cui. Structural change analysis of cecal bacterial flora in different poultry breeds using PCR鄄DGGE. Acta Ecologica Sinica,2011,31
(21):6513鄄6521.
利用 PCR鄄DGGE方法分析不同鸡群的
盲肠微生物菌群结构变化
李永洙1,Yongquan Cui2
(1. 临沂大学生命科学学院,山东临沂摇 276005;2. 国立冈山大学自然科学研究科,日本冈山摇 700鄄8530)
摘要:研究不同品种、饲养阶段的健康和不良鸡群对盲肠细菌种群结构和多样性的影响。 使用基于 16S rDNA的 PCR鄄DGGE技
术,结合割胶回收 DNA进行克隆和测序,分别以 4、6、10、16、20、40 周龄蛋鸡及 1、2、4、6、7、8 周龄肉鸡健康、不良鸡群盲肠内容
物为样本,研究其中特定细菌类群的 16S rDNA序列片段指纹图谱,并进行聚类分析,鉴定特异性和共性种群。 在两品种健康鸡
群盲肠内容物的细菌群落中,Lactobacillus属菌株的相似性均高于不良鸡群,并且在不同饲养阶段的健康、不良鸡群间指纹图谱
平均条带数差异显著(P<0. 05);而 Bacteroides属菌株在健康鸡群盲肠内容物细菌的相似性与不良鸡群较为相近,健康、不良鸡
群间平均条带数差异显著(P<0. 05);Clostridium属菌株在蛋鸡 20、40 周龄的平均条带数差异不显著(P>0. 05),但肉鸡各周龄
健康、不良鸡群间的平均条带数差异显著(P<0. 05)。 序列测序结果,在蛋鸡产蛋期健康、不良鸡群样本中均检测到能动乳杆菌
(Lactobacillus agilis),而育雏和育成期中均检测到鸟乳杆菌(Lactobacillus aviaries)和不可培养细菌;两品种的健康、不良鸡群样
本中均检测到 Bacteroides属的生酸拟杆菌(Bacteroides acidifaciens)、不可培养物细菌(Uncultured bacterium);而健康、不良蛋鸡
群样本中均检测到 Clostridium 属不可培养的变形菌(Uncultured proteobacterium),健康肉鸡群中检测到索氏志贺菌(Shigella
sonnei),而两品种不良鸡群中均缺乏此类菌种。 结果显示,不同品种、饲养阶段的鸡群,其盲肠细菌群落的组成差异显著,并且
细菌种群结构对鸡群的生长发育影响较大。
关键词:蛋鸡;肉鸡;变性梯度凝胶电泳(DGGE);盲肠菌落
Structural change analysis of cecal bacterial flora in different poultry breeds using
PCR鄄DGGE
LI Yongzhu1,Yongquan Cui2
1 College of Life Science, Linyi University, Linyi 276005, China
2 Laboratory of Animal Genetics Okayama University, Okayama,700鄄8530,Japan
Abstract: This study investigated the effects of normal and slow poultry development on the structural diversity of cecal
bacterial flora using different chicken breeds and feeding stages. Cecal samples were collected from normal and slow
developing, 4, 6 10, 16, 20, and 40鄄week鄄old commercial layers, and 1, 2, 4, 6, 7, and 8鄄week鄄old broilers chickens.
Polymerase chain reaction and denaturing gradient gel electrophoresis ( PCR鄄DGGE ) of bacterial 16S ribosomal
deoxyribonucleic acid ( rDNA) was used, in combination with cloning and sequencing of amplified fragments to produce
bacterial flora DNA fingerprints. Cluster analysis was further used to identify the specific and common community members.
Lactobacillus species were more similar in normal chickens of both breeds than in slow developing chickens. A significant
difference (P<0. 05) in the average 16S rDNA PCR鄄DGGE fingerprint band number was observed between normal and slow
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developed chickens of the same breed at different ages. Bacteroides fingerprints indicated similar cecal bacteria in the two
breeds of normal and slow developing chickens. Average band numbers for the 16S rDNA PCR鄄DGGE fingerprints of the two
breeds at different ages were not significantly different (P>0. 05), while band numbers between normal and slow developed
chickens was significant (P<0. 05). Clostridium specific fingerprints were not significantly different between 20鄄week and
40鄄week鄄old commercial layers (P>0. 05), and significantly different between healthy and poor broiler chickens of different
ages (P<0. 05). Lactobacillus agilis was most abundant in both normal and slow developing commercial layers during the
laying period, while Lactobacillus aviaries and an unculturable bacteria were abundant during the brooding and rearing
periods. Lactobacillus animalis, Bacteroides acidifaciens and an unculturable Bacteroides sp. , along with unculturable
Clostridium were common in both chicken breeds undergoing normal and slow development. Unculturable proteobacteria
were also abundant in commercial layers. Shigella sonnei was prevalent in normal broiler chickens, but absent in the slow
developing chickens. Substantial differences in the cecal bacterial community composition exist between different chicken
breeds at different developmental stages. Furthermore, bacterial population structure potentially has a major influence on
chicken growth.
Key Words: broiler; chicken; Denaturing Gradient Gel electrophoresis; cecal bacterial flora
家禽肠道是一个复杂而多样的生态环境,其体内微生物超过 400 种,这些微生物对宿主的正常发育和营
养物质的消化吸收起着重要的作用。 长期以来,由于微生物形态过于简单,缺乏明显的外部特征,随着基于
16S rDNA分子技术发展,更全面更深入的了解微生物菌落结构,其中 DGGE / TGGE 技术被用于检测人类[1]、
猪[2]、鸡[3]等动物胃肠道主要细菌的结构和多样性,但 DGGE 方法只能检测到样品中含量在 1%以上的细
菌[4]。 目前,对宿主与肠道微生物之间相互作用的了解非常有限,对肠道微生物是否会导致动物肠道紊乱等
相关研究十分迫切[5]。 肠道菌群失调会引发机体对营养物质的吸收,降低机体免疫力,削弱肠道的屏障功
能,影响家畜的生长和健康。 家禽品种、饲养环境以及饲养方式影响肠道菌群,使肠道菌群的研究很难标准
化,倪学勤[6]等利用 PCR鄄DGGE 技术分析蛋鸡 MHC 基因与商品蛋鸡对肠道细菌种群结构的影响,结果显示
不同宿主基因影响蛋鸡不同周龄、不同肠段细菌种群的结构。 Lovanh[7]等运用 PCR鄄DGGE 技术对鸡舍中不
同位置的 44 个鸡粪样本进行了分析,结果显示革兰氏阳性菌乳杆菌目、芽孢杆菌目和放线菌类在鸡粪微生物
种群结构中占主导地位。 但有关家禽健康、不良鸡群对肠道菌群的影响,未见相关报道。 本文通过特定细菌
物种专一性引物 PCR鄄DGGE方法,对饲养管理和饲养条件相同的依莎褐蛋鸡和艾维茵肉鸡健康、不良鸡群盲
肠内容物菌群 16S rDNA V3区进行 PCR鄄DGGE指纹图谱比较分析,研究不同品种、饲养阶段的健康和不良鸡
群的盲肠细菌种群结构和多样性的变化,旨在为研制微生态制剂提供理论依据。
1摇 材料与方法
1. 1摇 样品的采集和处理
试验利用饲养在山东省临沂某饲养场不同养殖分场依莎褐蛋鸡和艾维茵肉鸡(饲养环境、饲料条件相
同),分别在无菌的状态下 4、6、10、16、20、40 周龄蛋鸡(育雏 4、6 周、育成 10、16 周、产蛋 20、40 周)及 1、2、4、
6、7、8 周龄肉鸡(育雏 1、2 周、育成 4、6 周、育肥 7、8 周)健康、不良鸡群(体重与正常鸡群偏低 20%以下)盲
肠内容物为样本,并将相同 5 羽鸡的盲肠内容物均匀混合,然后按 0. 2 g /管分装到 2 mL离心管,置-20 益保
存备用。
1. 2摇 主要试剂和仪器
Taq DNA聚合酶及 PCR反应缓冲液购自 Takara(Japan,Tokyo);PCR引物由 Laboratory of Animal Genetics
Okayama University of Guelph 合成;DGGE 成套试剂购自 Bio鄄Rad 公司( Japan Tokyo);QIAamp誖 DNA Stool
Mini Kit和 QIAprep誖 Spin Miniprep Kit购自 QIAGEN公司;TOPO TA Cloning誖 Kit 购自 Biodynamics Laboratoy
Inc公司;银染药品和试剂购自 Thermo Fisher Scientific K. K 公司。 310 型 DNA 测序仪(ABI PRISM誖 310
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Genetic Analyzer,Laboratory of Animal Genetics Okayama University Japan Okayama)。
1. 3摇 细菌总 DNA的提取
参照文献[8],采用 QIAamp誖 DNA Stool MiniKit,按照操作手册提取细菌总 DNA。 用核酸浓度测定仪测定
总 DNA浓度,置-20 益保存备用。
1. 4摇 基因组总 DNA 16S rDNA V3区特异性扩增片段
引物设计参照文献[9](HDA1鄄GC 和 HDA2),PCR 反应体系参照文献[10](50 滋L):10伊缓冲液 5 滋L (15
mmol / L MgCl2),dNTP(10mmol / 滋L) 4 滋L,引物(10pmol / 滋L) 1 滋L,模板 DNA1. 0 滋L,TaqDNA 聚合酶(5U /
滋L) 0. 5 滋L,ddH2O补足 50 滋L。 PCR扩增条件(Touchdown)见表 2。 PCR产物用 1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测
片段大小和浓度。
表 1摇 特异性引物序列
Table 1摇 Specific sequence of primers
引物名称
Primer name
引物序列
Primer sequence
引物位置
Primer position
片段大小
Product size (bp)
HDA1鄄GC[9]
F:5忆鄄CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACG
GGGGGACTCCTACGGGAGGCAGCAG T鄄3忆 339—396(57 mer)
HDA1[9] F:5忆鄄CCTACGGGAGGCAGCAG鄄3忆 339—356(17 mer) 161鄄201
HDA2[9] R:5忆鄄GTA TTA CCG CGGCTGCTG GCAC鄄3忆 539—556(17 mer)
Lactobacillus[11] F:5忆鄄GGAAACAGRTGCTAATACCG鄄3忆 156—176(20 mer) 518—522
R:5忆鄄CACCGCTACACATGGAG鄄3忆 677鄄694(17 mer)
Bacteroides[12] F:5忆鄄GAAGGTCCCCCACATTG鄄3忆 303—320(17 mer) 406—407
R:5忆鄄CAATCGGAGTTCTTCGTG鄄3忆 708鄄726(18 mer)
Bifidobacterium[13] F:5忆鄄GGGTGGTAATGCCGGATG鄄3忆 164—182(18 mer) 438—440
R:5忆鄄TAAGCCATGGACTTTCACACC鄄3忆 601鄄622(21 mer)
Clostridum[14] F:5忆鄄AAAGGRAGATTAATACCGCATAA鄄3忆 150—173(23 mer) 538—541
R: 5忆鄄TTCTTCCTAATCTCTACGCA鄄3忆 690-710(20 mer)
表 2摇 PCR反应程序
Table 2摇 PCR reaction program
名称
Name
预变性
Initial denaturation
变性
Denaturation
退火
Annealing
延伸
Extension
循环
Cycle
最后延伸
Last extension
Touchdown[10] 94益 10min 93益 30s 65益 30s 72益 1min 10 72益 1min
93益 30s 60益 30s 72益1min 10 72益 1min
93益 30s 55益 30s 72益1min 10 72益 1min
Lactobacillus[11] 94益 2min 94益 30s 61益1min 68益 1min 35 68益 5min
Bacteroides[12] 94益 5min 95益 1min 56益1min 72益 45s 35 72益 5min
Bifidobacterium[13] 94益 5min 95益 1min 59益1min 72益 45s 35 72益 5min
Clostridum[14] 95益 3min 95益 45s 57益 45s 72益 2min 35 72益 3min
Cloning 95益 8min 95益 1min 55益 1min 72益 1min 30 72益 8min
ByeDye25 98益 2min 96益 10s 50益 5s 60益 4min 25 60益 2min
1. 5摇 基因组总 DNA 16S rDNA V3区扩增片段变性梯度凝胶电泳
利用已获得的 DNA 16S rDNA V3区扩增片段产物,用相应的微卫星引物和 PCR 扩增条件[11鄄14]进行 PCR
扩增。 PCR产物用 1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测片段大小和浓度。 参照文献[15],使用 Bio鄄Rad Dcode 进行
DGGE凝胶电泳。 8%的聚丙烯酰胺胶上进行分离,变性剂梯度范围为 20%—60% (100%的变性剂包含 7
mol / L尿素和 40%去离子甲酰胺)。 电泳在恒温 60 益下 1伊TAE 缓冲液中进行,电压 150V,时间 12 h。 电泳
结束后进行 SYBRgreen I(100伊)染色,用 UVI成像系统检测照相。 将 DGGE图谱上的差异条带和共性条带分
5156摇 21 期 摇 摇 摇 李永洙摇 等:利用 PCR鄄DGGE方法分析不同鸡群的盲肠微生物菌群结构变化 摇
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别回收,从凝胶上小心切下 DGGE条带,放入 1. 5 mL灭菌离心管中,加入 10 滋L无菌水,在暗处 4 益中放置过
晚。 用相应的微卫星引物(HDA1 和 HDA2)进行二次 PCR 扩增。 PCR 产物用 1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测片
段大小和浓度。
1. 6摇 基因组总 DNA 16S rDNA V3区扩增片段琼脂糖凝胶电泳割胶回收、纯化与载体的连接、测序
用无菌手术刀将琼脂糖凝胶电泳割胶回收。 回收产物用 Wizard PCR Prep sDNA Purification System 进行
纯化,纯化产物采用 DynaExpressTA PCR Cloning Kit ( TaKaRa),构建克隆文库,用 QIAamp 誖 DNA Stool
MiniKit,抽提质粒,经 PCR和电泳确证克隆片段的正确性。 将筛选后的细菌 DNA应用 PCR的 ByeDye25 法全
域增幅。 PCR产物经处理后在 310 型 DNA 测序仪。 所得结果在 GenBank (http: / / www. ncbi. nlm. nih. gov)
数据库中进行检索,确定细菌的种类和名称,寻找亲缘关系最近的细菌或克隆。
1. 7摇 数据统计分析
盲肠微生物菌群的数据分析使用分析软件 BioNumerics 3. 0 (Applied Maths,Sint鄄Martens鄄Latem,Belgium)
对 PCR鄄DGGE指纹图谱进行条带计数,用 Dice 方法计算相似性指数 Cs,用 UPGMA(unweighted pair group
mean average) 进行聚类分析。
2摇 结果与分析
2. 1摇 蛋鸡和肉鸡盲肠内容物中的特定菌群分析
盲肠内容物的特定菌群分析表明,Lactobacillus、Bacteroides特异引物扩增中 24 个样本中均得到 16S rDNA
V3区片段,但 Bifidobacterium扩增中末获得 16S rDNA V3区片段,Clostridium 扩增中 20、40 周龄蛋鸡和 4、6 周
龄肉鸡发育不良鸡群以及 1、2、8 周龄健康肉鸡群共 7 个样本中获得 16S rDNA V3区片段,利用上述已得到片
段 16S rDNA V3区进行 PCR鄄DGGE指纹图谱和聚类分析。 图 1 为 Lactobacillus 属菌株分析结果,尽管 2 个截
然不同品种均有一些共性条带,在两品种健康鸡群盲肠内容物的细菌群落中,Lactobacillus 属菌株的相似性均
高于不良鸡群;同一品种不同周龄的健康、不良鸡群间指纹图谱平均条带数差异显著(P<0. 05)。 两品种育雏
期细菌种类均最丰富,分别为 14—18 和 9—14 条,育成期分别为 11—15 和 9—14 条,产蛋期(育肥)细菌种类
比较少,分别为 7—11 和 7—12 条。
? ?从DGGE 胶中洗脱回收的16S rDNA特异性和共性条带
L-4-HL-4-P
L-6-P
L-6-H
L-10-H
L-10-H
L-16-H
L-16-P
L-20-H
L-20-P
L-40-PL-40-H
B-1-P
B-1-H
B-2-P
B-2-H
B-4-P
B-4-HB-6-H
B-6-PB-7-P
B-7-HB-8-HB-8-P
100908070605040302010
12
3 45 67 8 9 101112 13 141516 1718
蛋鸡 肉鸡
H:健康 P:不良 W:周龄
4w6w 16w10w 40w20w 2w1w 6w4w 8w7wH HP PH HP PH HP P H HP PH HP PH HP P
a b
H:健康 P:不良 L:蛋鸡 B:肉鸡
2
4
13 141516
图 1摇 不同周龄蛋鸡和肉鸡盲肠微生物细菌 16S rDNA V3 区 Lactobacillus特异性 PCR鄄DGGE指纹图谱(a)和聚类分析(b)
Fig. 1摇 Lactobacillus Specificity PCR鄄 DGGE DNA profiles of the Caeca and dendrogram of the V3 region of 16S rDNA (a) of bacteria in
Ceacal digesta obtained at different age(b)
6156 摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 31 卷摇
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图 2 为 Bacteroides属菌株分析结果,健康、不良鸡群盲肠内容物的细菌群落中,Bacteroides 属菌株的相似
性较为相近;两品种均具有较多共性条带,蛋鸡和肉鸡在不同周龄指纹图谱的平均条带数差异均不显著(P>
0. 05),但健康、不良鸡群间平均条带数差异显著(P<0. 05)。
L-4-H
L-4-P
L-6-H
L-6-PL-10-P
L-10-H
L-16-H
L-16-P
L-20-H
L-20-P
L-40-P
L-40-H
B-1-H
B-1-P
B-2-P
B-2-HB-4-H
B-4-P
B-6-P
B-6-H
B-7-P
B-7-H
B-8-H
B-8-P
100908070605040302010
1
2 3 4
5 6
7 89 1011
12 1314 15
4w 6w 16w10w 40w20w 2w1w 6w4w 8w7wH HP PH HP PH HP P H HP PH HP PH HP P
蛋鸡 肉鸡a b
? ?从DGGE 胶中洗脱回收的16S rDNA特异性和共性条带H: 健康 P:不良 W:周龄 H: 健康 P:不良 L:蛋鸡 B:肉鸡
1
2 3
5
8
11
12
15
a
图 2摇 不同周龄蛋鸡和肉鸡盲肠微生物细菌 16S rDNA V3 区 Bacteroides特异性 PCR鄄DGGE指纹图谱(a)和聚类分析(b)
Fig. 2摇 Bacteroides Specificity PCR鄄DGGE DNA profiles of the Caeca and dendrogram of the V3 region of 16S rDNA ( a) of bacteria in
Ceacal digesta obtained at different age(b)
图 3 中可知,Clostridium属菌株在不良鸡群的 20、40 周龄间蛋鸡平均条带数差异不显著(P>0. 05),但肉
鸡不同周龄的健康、不良群间平均条带数差异显著(P<0. 05)。 蛋鸡不良鸡群产蛋期细菌种类最丰富,电泳条
带分别为 12 和 14 条;而育雏期和育肥期健康肉鸡群,电泳条带数分别为 17—19 和 8 条,生长期不良鸡群,电
泳条带数 11—24 条。
2. 2摇 蛋鸡和肉鸡盲肠内容物中的菌群组成分析
图 4 中可知,不同品种、饲养阶段的健康和不良鸡群对盲肠细菌群落的组成影响显著。 即蛋鸡的育雏、育
成期和产蛋期 Lactobacillus 属菌株相似性指数分别为 65. 13%—67. 50% 、54. 17%—64. 17%和 36. 67%—
43郾 56% ;而肉鸡育雏、生长期和育肥期分别为 50. 48%—53. 09% 、42. 22%—47. 79%和 55. 00%—56. 25% 。
菌群相似性指数是测量群落间或样方间相似程度指数指标。 相似性指数的高低说明不同饲养阶段的健康、不
良鸡群间群落相似程度。 相似性指数的高低间接地说明共性菌群以外的菌群情况。 上述结果中可知,产蛋期
对盲肠细菌组成的影响最大,育雏期对盲肠细菌组成的影响较小;而肉鸡生长期对盲肠细菌组成的影响最大,
育肥期对盲肠细菌组成的影响最小。 Bacteroides 属菌株相似性指数在蛋鸡育雏期对盲肠细菌组成的影响最
大,相似性指数为 41. 05%—45. 41% ,其次为育成期,相似性指数为 48郾 68%—49. 78% ,产蛋期对盲肠细菌的
影响较小,相似性 55. 56%—56. 45% ;而肉鸡生长期对盲肠细菌组成的影响最大,相似性指数为 32. 75%—
48郾 68% ,其次育雏期,相似性指数为 53. 74%—56. 86% ,育肥期影响最小,相似性 57. 78%—60. 27% 。
2. 3摇 蛋鸡和肉鸡盲肠内容物中各细菌菌群的物种多样性分析
指纹图谱中分别割胶回收测序结果见表 3。 Lactobacillus 属在产蛋期健康、不良鸡群中均检测到 Lactobac
illus agilis;而育雏、育成期中检测到 Lactobacillus aviaries、Uncultured bacterium(第 8 条带)。 在两品种健康、不
良鸡群中均检测到 Uncultured Weissella sp、Lactobacillus animalis。 另外,20、40 周龄蛋鸡和 4、6 周龄肉鸡的不
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周龄
P 4020 21 64 8HP P PH H
蛋鸡 肉鸡
12
3
546
7
1
8
9
10 1112
L-20-P
L-40-P
B-2-H
B-1-H
B-4-P
B-6-P
B-8-H
1009080706050403020
a b
? ?从DGGE 胶中洗脱回收的16S rDNA特异性和共性条带
H: 健康 P:不良 W:周龄 H:健康 P:不良 L:蛋鸡 B:肉鸡
P
蛋鸡a 肉鸡
图 3摇 不同周龄蛋鸡和肉鸡盲肠微生物细菌 16S rDNA V3 区 Clostridium特异性 PCR鄄DGGE指纹图谱(a)和聚类分析(b)
Fig. 3摇 Clostridium Specificity PCR- DGGE DNA profiles of the Caeca and dendrogram of the V3 region of 16S rDNA (a) of bacteria in
Ceacal digesta obtained at different age (b)
15
30
45
60
75
4 6 10 16 20 40 1 2 4 6 7 8
蛋鸡 LactobacilussBacroides
周龄 Weeks
肉鸡
相似
性指
数
Simi
larity
dice
/%
图 4摇 盲肠微生物 DNA鄄DGGE的相似性指数分析
Fig. 4摇 Similarity Profiles of the cae ca
良鸡群以及 1、2、8 周龄健康肉鸡群共 7 个样本中均检
测到 Uncultured bacterium (第 12 条带),而末检测到
Lactobacillus johnsonii(第 14 条带)。 Clostridium 属在两
品种健康、不良鸡群中均检测到 Uncultured bacterium
(第 3 条带);其中蛋鸡中检测到 Uncultured proteobacte鄄
rium(第 1 条带),而肉鸡群检测到 Uncultured bacterium
(第 9 条带);健康肉鸡群中检测到 Shigella sonnei(第 5
条带),而两品种不良鸡群均缺乏此类菌种。 两品种健
康、不良鸡群中均检测到 Bacteroides 属的 Bacteroides
acidifaciens、Uncultured bacterium。 在 45 个测序结果中,
与 GenBank数据库中微生物的同源性绝大多数均大于
98% ,有的同源性甚至达到 100% ,但是 Lactobacillus属条带 8 和 14 与已鉴定物的相似性仅为 93%和 90% ,而
与之亲缘关系最近的已鉴定的微生物的同源性仅为 90%和 84% ,因此该序列所代表的微生物为新的不可培
养微生物;条带 2 和 17 与已鉴定的菌中相似性仅为 95%和 94% ,而同源性仅为 91%和 89% ,说明该条带代
表的微生物是加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)和德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)的新种。 Bacteroides 属
条带 7、9、13、14 与已鉴定的菌中相似性仅为 94% 、90% 、94% 、91% ,而同源性仅为 90% 、85% 、91% 、87% ,因
此该序列所代表的微生物为新的不可培养微生物;条带 10 和 12 与已鉴定的菌中相似性仅为 92%和 91% ,而
同源性仅为 86%和 83% ,说明该条带代表的微生物是溃疡拟杆菌(Bacteroides helcogenes)和卵形拟杆菌(Bac鄄
teroides ovatus)的新种。 Clostridium属条带 1 与已鉴定的菌中相似性仅为 92% ,而同源性仅为 86% ,因此该序
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列所代表的微生物为新的不可培养微生物。
表 3摇 PCR鄄DGGE共性条带和特异性条带的基因片段序列的比对结果
Table 3摇 Comparison of genomic sequences in common bands and special bands by sequencing and BLAST analysis
条带
Band
相近菌种
Similar lactic acid bacteria species
碱基数(bp)
Number of bases(bp)
相似率 / %
Similarity
GenBank 登记号
Registration number
Lactobacillus Specific PCR鄄DGGE
1 Uncultured bacterium 710 98 FJ836331
2 Lactobacillus gasseri 684 95 GU417927
3 Uncultured bacterium 194 99 HQ396113
4 Lactobacillus amylovorus 543 99 HQ384286
5 Uncultured bacterium 747 100 HM575083
6 Uncultured bacterium 223 99 HQ314997
7 Weissella. Cibaria 560 100 GU369787
8 Uncultured Weissella sp 198 93 AB536789
9 Lactobacillus agilis 508 98 AB300519
10 Lactobacillus salivarius 534 99 HQ384292
11 Lactobacillus acidophilus 966 100 GU344709
12 Lactobacillus aviaries subsp 691 99 AB289044
13 Lactobacillus animalis 1360 99 HQ293062
14 Lactobacillus johnsonii 747 99 HQ384294
15 Uncultured bacterium 187 90 GU578810
16 Lactobacillus johnsonii 1471 100 HM162410
17 Lactobacillus delbrueckii 192 94 EF015468
18 Uncultured bacterium 702 99 FJ834503
Bacteroides Specific PCR鄄DGGE
1 Uncultured bacterium 571 97 EU506108
2 Uncultured bacterium 781 95 HQ321794
3 Uncultured bacterium 545 98 HQ320782
4 Uncultured bacterium 1495 100 EU791191
5 Uncultured bacterium 547 98 AY668237
6 Bacteroides ovatus 1459 98 AB510705
7 Uncultured bacterium 700 94 FJ557165
8 Bacteroides acidifaciens 1490 99 AB510696
9 Uncultured Bacteroidales bacterium 461 90 HM079683
10 Bacteroides helcogenes 1473 92 AB510707
11 Uncultured bacterium 499 95 AJ419037
12 Bacteroides ovatus 1459 91 AB510705
13 Uncultured bacterium 699 94 HQ321414
14 Uncultured Bacteroidales bacterium 805 91 MH104791
15 Bacteroides sp. S-17 1487 91 AB470334
Clostridium Specific PCR鄄DGGE
1 Uncultured proteobacterium 636 92 EF697608
2 Erwinia sp. 728MF 722 100 DQ904614
3 Uncultured bacterium 1407 100 FJ683891
4 Uncultured bacterium 745 99 FJ163926
5 Shigella sonnei 1224 100 HQ407271
6 Uncultured Escherichia sp. 717 99 DQ856885
7 Uncultured bacterium 1515 98 AB506188
8 Uncultured bacterium 877 100 GU171201
9 Uncultured bacterium 884 100 GU060393
10 Clostridium sartagoforme 1420 100 FJ384380
11 Clostridium sp. CM鄄C81 1420 100 EU869238
12 Swine fecal bacterium RF3E鄄Xyl6 1431 100 FJ753844
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3摇 讨论
家禽的生长发育受遗传、营养、饲养管理和疾病等因素的影响,许多疾病会导致饲料利用效率下降,使之
正常发育受阻。 肠道微生物可通过养分的利用和胃肠道系统的发育来影响宿主的营养、健康和生长性能。 肠
道微生物菌群的组成,会对宿主的健康和生长产生积极或消极的影响[16]。 对人类[1]、猪[2]、鸡[3]等的研究结
果均证实不同个体肠道菌群指纹图谱有差异,即使是饲养于相同环境,饲喂相同饲料,相互接触的同龄肉鸡,
都会表现出不同的带谱,说明宿主因素对肠道菌群的组成影响很大[17]。 本试验结果显示,Lactobacillus 菌属
在产蛋期健康鸡群盲肠内容物的细菌种类比不良鸡群丰富;肉鸡育成末期后健康鸡群的细菌种类比不良鸡群
丰富。 Bacteroides菌属在两品种具有较多的共性条带,健康与不良鸡群盲肠内容物的细菌菌株的相似性较为
相近,育雏期健康鸡群与不良比较细菌种类较少。 本结果证实 Lactobacillus菌属在不同宿主的健康、不良鸡群
在相同饲养环境条件下影响盲肠细菌种类,特别在育成后期开始尤为明显,说明肠道内环境(如 pH值、营养、
氧气含量等) 的影响逐渐增强。
光冈知足[18]等对家禽盲肠内的正常菌群和优势菌群进行过研究。 研究证明,正常情况下,成年鸡肠道内
正常菌群是处于生态平衡状况,肠道内各菌类间也有稳定的比例关系,这种生态平衡能抑制外界病原菌的入
侵。 新生雏鸡 4 日龄后卵黄抗体逐渐消失,肠内细菌群尚未形成稳定的区系、可能是造成 9—21 日龄雏鸡消
化道疾病高发期的原因。 因而,尽早确立肠道优势菌群的优势地位,建立平衡的肠道菌群,是预防雏鸡消化道
疾病的重要条件。 Vaahtovuo等采用气液色谱法测定鼠粪样菌群,发现 4 个品种小鼠的粪样菌群有差异,尤其
是在 17—19 周龄,菌群差异最明显,证实基因型的作用与年龄有关[19]。 本试验中蛋鸡和肉鸡不同饲养阶段
对盲肠细菌种群的影响均存在年龄(周龄)效应。 本试验结果显示,Lactobacillus属菌株在蛋鸡幼雏、育成期细
菌种类比产蛋期丰富;而肉鸡幼雏期比育成、育肥期细菌种类丰富。 Bacteroides 属菌株在蛋鸡产蛋期盲肠细
菌种类比育雏期丰富;而肉鸡育雏期与育成、育肥期比较细菌种类较少。 本试验结果与倪学勤[6]等研究结果
相同,证实基因型对菌群的影响与年龄有关。
Ley R E[20]等研究证明宿主基因型可影响肠道主要正常菌群,宿主因素决定细菌在不同个体中的定植能
力,肠内正常菌群平衡是相对的。 饲料种类、抗菌药物、疾病、气候变化以及日龄等因素,均可影响菌群数量和
种类的变动,研究比较雏鸡、育成鸡和成年鸡肠道后段菌群变化,发现雏鸡随日龄增长双歧杆菌与大肠杆菌明
显增加。 本试验测序的盲肠优势菌群与前者研究结果相似,但本试验无法鉴定双歧杆菌,原因尚不清楚,还有
待深入研究。 另外,倪学勤[21]等研究证明蛋鸡消化道前段的优势细菌三得利乳杆菌、索氏梭菌和大肠杆菌等
在盲肠中没有相应条带,说明它们在盲肠中的含量比较少或不能在盲肠定植。 本试验结果,索氏梭菌(Clos鄄
tridium)仅在 7 个样品中所取得扩增片段,说明其他个体中肠中的含量比较少或不能在盲肠内容物样本中检
测。 Lactobacillus、Clostridium 属菌株盲肠内的特异性条带很多,Bacteroides 属菌株共性条带很多,而测序结果
也证实大多数是至今尚不可培养的细菌。 Ley R E[22]等研究显示,肥胖和瘦弱寄主拥有不同结构的微生物群
系,对微生物发酵的效率和微生物的组成结构进行对比分析,可建立最佳的可促进人类健康的微生物群系模
型;而在畜牧养殖方面,可建立育肥微生物群系和提高瘦肉率的微生物群系模型等,从而根据畜禽的特点进行
投喂,以提高畜禽的生产性能。 至于本研究中发现的 Lactobacillus johnsonii(第 14 条带)末出现指纹图谱的
20、40 周龄蛋鸡和 4、6 周龄肉鸡的不良鸡群以及 1、2、8 周龄健康肉鸡群共 7 个样本与 Clostridium 属 Shigella
sonnei(第 5 条带)间菌种互作作用以及其菌种对家禽生长发育作用,提取菌种后需要进一步添加验证,筛选
有利于促进健康生长的优势菌群,为研制微生态制剂提供理论依据。
4摇 结论
利用 PCR鄄DGGE指纹图谱技术分析健康和不良的蛋鸡、肉鸡的盲肠部位决定菌群结构和多样性。 该研
究结果对特异引物定向分离培养蛋鸡、肉鸡盲肠优势细菌,调控盲肠菌群平衡,提高家禽生长发育以及生产性
能提供科学依据,为家禽微生态制剂的研究开辟了一条更为有效的途径。
致谢:感谢 Nishino naoki教授及 Wang Chao博士对本研究给予的帮助。
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1256摇 21 期 摇 摇 摇 李永洙摇 等:利用 PCR鄄DGGE方法分析不同鸡群的盲肠微生物菌群结构变化 摇
ACTA ECOLOGICA SINICA Vol. 31,No. 21 November,2011(Semimonthly)
CONTENTS
Landscape spatial analysis of a traditional tibetan settlement based on landscape pattern theory and feng鄄shui theory:the case of
Zhagana, Diebu, Gansu Province SHI Lisha, YAN Lijiao, HUANG Lu, et al (6305)……………………………………………
Temporal鄄spatial differentiation and its change in the landscape ecological security of Wuyishan Scenery District
YOU Weibin,HE Dongjin,WU Liyun,et al (6317)
……………………
…………………………………………………………………………………
Evaluation of eco鄄sustainability of roads in a tourism area: a case study within Yulong County JIANG Yiyi (6328)…………………
Study on the compactness assessment model of urban spatial form ZHAO Jingzhu, SONG Yu, SHI Longyu, et al (6338)……………
A multi鄄scale analysis of red鄄crowned crane忆s habitat selection at the Yellow River Delta Nature Reserve, Shandong, China
CAO Mingchang, LIU Gaohuan, XU Haigen (6344)
…………
………………………………………………………………………………
Assessment and spatial distribution of water and soil loss in karst regions, southwest China
FAN Feide,WANG Kelin,XIONG Ying,et al (6353)
……………………………………………
………………………………………………………………………………
Construction of an eco鄄environmental database for watershed鄄scale data: an example from the Tarim River Basin
GAO Fan, YAN Zhenglong, HUANG Qiang (6363)
……………………
………………………………………………………………………………
Reproductive allocation in dioecious shrub, Rhamnus davurica WANG Juan, ZHANG Chunyu, ZHAO Xiuhai, et al (6371)………
Age鄄dependent growth responses of Pinus koraiensis to climate in the north slope of Changbai Mountain, North鄄Eastern China
WANG Xiaoming, ZHAO Xiuhai, GAO Lushuang, et al (6378)
………
…………………………………………………………………
Fine鄄scale spatial point patterns of Stipa krylovii population in different alpine degraded grasslands
ZHAO Chengzhang, REN Heng, SHENG Yaping, et al (6388)
……………………………………
……………………………………………………………………
Community structure and population regeneration in remnant Ginkgo biloba stands
YANG Yongchuan, MU Jianping, TANG Cindy Q. ,et al (6396)
……………………………………………………
…………………………………………………………………
Reproductive characteristics and adaptive evolution of pin and thrum flowers in endangered species, Primula merrilliana
SHAO Jianwen, ZHANG Wenjuan, ZHANG Xiaoping (6410)
……………
………………………………………………………………………
Leaf functional traits of four typical forests along the altitudinal gradients in Mt. Shennongjia
LUO Lu, SHEN Guozhen, XIE Zongqiang,et al (6420)
…………………………………………
……………………………………………………………………………
Reclaimed soil properties and weathered gangue change characteristics under various vegetation types on gangue pile
WANG Liyan, HAN Youzhi, ZHANG Chengliang, et al (6429)
…………………
……………………………………………………………………
Influence of fire on stands of Pinus massoniana in a karst mountain area of central Guizhou province
ZHANG Xi, CHUI Yingchun, ZHU Jun, et al (6442)
…………………………………
……………………………………………………………………………
Morphological and physiological adaptation of Caragana species in the Inner Mongolia Plateau
MA Chengcang, GAO Yubao, LI Qingfang, et al (6451)
………………………………………
…………………………………………………………………………
A comparative study on reasons of degenerated of Haloxylon ammodendron population in the western part of Gurbantunggut desert
SI Langming,LIU Tong,LIU Bin,et al (6460)
……
………………………………………………………………………………………
Self鄄thinning of natural broadleaved forests in Baishilazi Nature Reserve ZHOU Yongbin, YIN You, YIN Mingfang, et al (6469)…
Population status and dynamic trends of Amur tiger忆s prey in Eastern Wandashan Mountain, Heilongjiang Province
ZHANG Changzhi, ZHANG Minghai (6481)
…………………
………………………………………………………………………………………
The relationship between the occurrence of Colorado Potato Beetle, Leptinotarsa decemlineata, and rivers based on GIS: a case
study of Shawan Country LI Chao, ZHANG Zhi, GUO Wenchao, et al (6488)…………………………………………………
Occurrence dynamics and trajectory analysis of Cnaphalocrocis medinalis Guen佴e in Xing忆an Guangxi Municipality in 2010
JIANG Chunxian, QI Huihui, SUN Mingyang, et al (6495)
…………
………………………………………………………………………
Adaptability of B鄄biotype Bemisia tabaci (Gennadius) to Host Shift ZHOU Fucai, LI Chuanming, GU Aixiang, et al (6505)………
Structural change analysis of cecal bacterial flora in different poultry breeds using PCR鄄DGGE LI Yongzhu,Yongquan Cui (6513)…
Effect of chicken manure鄄amended copper mine tailings on growth of three leguminous species, soil microbial biomass and enzyme
activities ZHANG Hong, SHEN Zhangjun, YANG Guide, et al (6522)…………………………………………………………
Physiological response of Microcystis to solar UV radiation WANG Yan, LI Shanshan, LI Jianhong, et al (6532)……………………
Relationship between cell volume and cell carbon and cell nitrogen for ten common dinoflagellates
WANG Yan,LI Ruixiang,DONG Shuanglin,et al (6540)
……………………………………
……………………………………………………………………………
The community structure and abundance of microcystin鄄producing cyanobacteria in surface sediment of Lake Taihu in winter
LI Daming, KONG Fanxiang,YU Yang, et al (6551)
………
………………………………………………………………………………
Influence of green belt structure on the dispersion of particle pollutants in street canyons
LIN Yinding, WU Xiaogang, HAO Xingyu, et al (6561)
………………………………………………
…………………………………………………………………………
Spatio鄄temporal variation analysis of urbanization and land use benefit of oasis urban areas in Xinjiang
YANG Yu, LIU Yi, DONG Wen, et al (6568)
………………………………
……………………………………………………………………………………
Nitrate contamination and source tracing from NO-3 鄄啄15N in groundwater in Weifang, Shandong Province
XU Chunying, LI Yuzhong, LI Qiaozhen, et al (6579)
……………………………
……………………………………………………………………………
The impact of rising temperature on spring wheat production in the Yellow River irrigation region of Ningxia
XIAO Guoju, ZHANG Qiang, ZHANG Fengju, et al (6588)
…………………………
………………………………………………………………………
A new hyperspectral index for the estimation of nitrogen contents of wheat canopy
LIANG Liang, YANG Minhua, DENG Kaidong, et al (6594)
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The feature of N2O emission from a paddy field in irrigation area of the Yellow River
ZHANG Hui,YANG Zhengli,LUO Liangguo, et al (6606)
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Review and Monograph
Research perspective for the effects of nitrogen deposition on biogenic volatile organic compounds
HUANG Juan, MO Jiangming, KONG Guohui, et al (6616)
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Recruitment limitation of plant population: from seed production to sapling establishment
LI Ning, BAI Bing, LU Changhu (6624)
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Scientific Note
Response of anatomical structure and photosynthetic characteristics to low light stress in leaves of different maize genotypes
DU Chengfeng, LI Chaohai, LIU Tianxue, et al (6633)
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2009 年度生物学科总被引频次和影响因子前 10 名期刊绎
(源于 2010 年版 CSTPCD数据库)
排序
Order
期刊
Journal
总被引频次
Total citation
排序
Order
期刊
Journal
影响因子
Impact factor
1 生态学报 11764
2 应用生态学报 9430
3 植物生态学报 4384
4 西北植物学报 4177
5 生态学杂志 4048
6 植物生理学通讯 3362
7
JOURNAL OF INTEGRATIVE
PLANT BIOLOGY
3327
8 MOLECULAR PLANT 1788
9 水生生物学报 1773
10 遗传学报 1667
1 生态学报 1. 812
2 植物生态学报 1. 771
3 应用生态学报 1. 733
4 生物多样性 1. 553
5 生态学杂志 1. 396
6 西北植物学报 0. 986
7 兽类学报 0. 894
8 CELL RESEARCH 0. 873
9 植物学报 0. 841
10 植物研究 0. 809
摇 绎《生态学报》 2009 年在核心版的 1964 种科技期刊排序中总被引频次 11764 次,全国排名第 1; 影响因
子 1郾 812,全国排名第 14;第 1—9 届连续 9 年入围中国百种杰出学术期刊; 中国精品科技期刊
摇 摇 编辑部主任摇 孔红梅摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 执行编辑摇 刘天星摇 段摇 靖
生摇 态摇 学摇 报
(SHENGTAI摇 XUEBAO)
(半月刊摇 1981 年 3 月创刊)
第 31 卷摇 第 21 期摇 (2011 年 11 月)
ACTA ECOLOGICA SINICA
摇
(Semimonthly,Started in 1981)
摇
Vol郾 31摇 No郾 21摇 2011
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