全 文 ：植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2014, 49 (6): 692–703, www.chinbullbotany.com
doi: 10.3724/SP.J.1259.2014.00692
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收稿日期: 2013-05-07; 接受日期: 2013-11-13
基金项目: 广西自然科学基金(No.2014GXNSFBA118127)和国家公益性行业(农业)科研专项(No.201203021)
* 通讯作者。E-mail: yangxiangyan84412@126.com
菠萝花发育相关基因AcMADS1的克隆与组织表达特性分析
蔡元保1, 杨祥燕1*, 孙光明2, 黄强1, 刘业强3, 李绍鹏4, 张治礼5
1广西壮族自治区亚热带作物研究所, 南宁 530001; 2中国热带农业科学院南亚热带作物研究所, 湛江 524091
3广西壮族自治区农业科学院园艺研究所, 南宁 530007; 4海南大学园艺园林学院, 海口 570228
5海南省农业科学院, 海口 571100
摘要 MADS-box转录因子在植物的发育过程特别是控制花器官的诱导与发育中起关键作用。利用同源克隆结合RACE技
术, 从菠萝(Ananas comosus)花中分离出1个新的菠萝MADS-box基因, 命名为AcMADS1(GenBank登录号为KC257408)。
AcMADS1基因的编码区为726 bp, 编码241个氨基酸, 蛋白质分子量为27.50 kDa, 等电点为9.26。序列比对和系统进化树
分析表明, AcMADS1具有保守的MADS-box及半保守的K区, 属于AGL6亚家族MADS-box蛋白。生物信息学分析表明,
AcMADS1是亲水碱性蛋白, 二级结构主要以α-螺旋、无规则卷曲和折叠延伸链为蛋白质骨架, 三级结构中蛋白核心结构符
合转录因子与DNA结合的常见功能域MADS-box, 而且作为转录因子定位于细胞核中。组织特异性表达分析表明 ,
AcMADS1基因在菠萝果肉以及花器官的雌蕊、花瓣和萼片中均有表达, 但在雄蕊以及营养器官的根、茎和叶中几乎不表达;
且在花器官早期发育过程中大量表达, 后期呈下降趋势。因此推测这个基因可能在菠萝花器官发育和开花诱导过程中起重
要作用。
关键词 菠萝, 花发育, MADS-box基因, 克隆, 基因表达
蔡元保, 杨祥燕, 孙光明, 黄强, 刘业强, 李绍鹏, 张治礼 (2014). 菠萝花发育相关基因AcMADS1的克隆与组织表达特性
分析. 植物学报 49, 692–703.
开花是显花植物个体发育过程的中心环节, 是环
境信号与植物内在遗传机制共同作用的结果。其过程
涉及大量基因的表达和调控, 其中MADS-box基因在
显花植物开花时间调节、花形态建成、根形成与发育、
果实发育与成熟等方面发挥着重要调控作用(Irish,
2003; Jack, 2004; Tapia-López et al., 2008; Smacz-
niak et al., 2012)。
近年来, 参与调控植物花器官特征的MADS-box
基因是植物发育生物学的研究热点。为了揭示植物花
器官发育的分子遗传机制, 根据对拟南芥(Arabidop-
sis thaliana)(Pelaz et al., 2000)、金鱼草(Antirrhinum
majus)(Schwarz-Sommer et al., 1990)和矮牵牛
(Petunia hybrida)(Angenent et al., 1995)等双子叶植
物花同源异型突变体的研究, 最初提出了经典的花器
官发育 ABC 模型 (Coen and Meyerowitz, 1991;
Weigel and Meyerowitz, 1994), 后经进一步深入研
究逐渐发展为现在被广泛接受的ABCDE模型(Thei-
ßen, 2001; Theißen and Saedler, 2001; Ferrario et
al., 2004)。该模型认为, A、B、C、D、E代表了5类
功能不同的花器官特征基因, 单独或联合控制花器官
的发育。其中, A类基因控制萼片的发育, A类和B类基
因共同控制花瓣的发育, B类和C类基因共同控制雄
蕊的发育, C类基因控制心皮的发育, D类基因控制胚
珠的发育, 而E类基因与其余4类基因协同作用对花
器官发育进行调控 ; A类和C类基因相互拮抗。
MADS-box基因在植物(特别是被子植物)的进化过程
中发生了大规模的基因重复事件, 从而形成一个多基
因家族(吕山花和孟征, 2007; 孙红正和葛颂, 2010)。
在长期的进化过程中, MADS-box基因分化为I型和II
型2类。对I型基因的功能报道较少, 调控植物花器官
发育的5类功能基因绝大多数属于II型(Kaufmann et
al., 2005)。植物II型MADS-box基因所编码的转录因
子除高度保守的MADS-box结构域外, 还含有半保守
的能形成卷曲螺旋的K区以及多变的I区和C区, 因此
·研究报告·
蔡元保等: 菠萝花发育相关基因 AcMADS1 的克隆与组织表达特性分析 693

该型基因又称MIKC型MADS-box基因(Kaufmann et
al., 2005)。MIKC型基因可根据I区序列的不同分为
MIKCc和MIKC*两个亚家族, 其中MIKCc基因又可根
据其序列特征和基因功能分为AG、AGL2(SEP)、
AGL6、AP1/FUL(SQUA)和AP3/PI(DEF/GLO)等13
个主要的亚家族(Becker and Theißen, 2003; Smac-
zniak et al., 2012)。不同基因家族之间在花发育过程
中的作用差异较大。这些家族基因编码MADS-box转
录因子, 参与花不同发育时期的调控。它们相互作用
可能构成一个复杂的网络调控系统来决定花原基和
花器官的特征以及调控花发育的整个过程 (Jack,
2004; Liu et al., 2010)。
AGL6亚家族基因广泛分布于种子植物中。根据
基因来源的物种可将该亚家族分为4个类群, 即真双
子叶植物群、单子叶植物群、木兰类植物群和裸子植
物群。其中, 真双子叶植物群又可细分为3个组, 分别
是真双子叶植物基础组、小核心真双子叶植物组和大
核心真双子叶植物组(Rijpkema et al., 2009; Viaene
et al., 2010)。AGL6亚家族也是13个主要的亚家族中
较为原始且功能保守的一个类群, 被认为是控制花发
育基因调节网络的4个中心参与者(SQUA、DEF/-
GLO、AG和AGL6/SEP1亚家族转录因子)之一, 具有
为E类基因提供花同源异型基因的功能(Melzer et al.,
2010)。AGL6亚家族与AP1和SEP亚家族的蛋白互作
模式相似 , 可将这3个亚家族归类为同一个亚家族
(Pařenicová et al., 2003), 而且与其它MADS-box转
录因子通过蛋白的相互作用来实现开花的正负调控
(de Folter et al., 2005)。虽然AGL6亚家族基因广泛
分布于被子植物和裸子植物中, 但目前只有少量的该
亚家族基因从拟南芥、水稻(Oryza sativa)、矮牵牛、
文心兰(Oncidium lexuosum)和小叶买麻藤(Gnetum
parvifolium)等少数植物中获得分离和功能验证
(Viaene et al., 2010; 王珍华等, 2012)。通过对这些
基因的功能研究表明, AGL6亚家族基因在不同物种
中有不同的表达模式, 其在植物生殖器官的发育过程
中起十分重要的作用, 尤其是在不同的被子植物物种
中异位表达会导致早花和花器官的同源转化(Becker
and Theißen, 2003; Reinheimer and Kellogg, 2009;
Smaczniak et al., 2012)。此外, AGL6亚家族基因还
在植物从营养生长向生殖生长转变以及侧生器官的
发育过程中起重要作用(Ma et al., 1991; Koo et al.,
2010)。AGL6亚家族基因的功能很多, 但是该亚家族
基因作用的分子遗传机制仍不清楚。
菠萝 (Ananas comosus)又称凤梨 , 是菠萝科
(Bromeliaceae)菠萝属(Ananas)多年生单子叶草本
植物。其花序集生成圆锥球状, 而且是异花授粉植物,
一般自花不孕, 不同品种的花期不一致, 不同品种间
授粉才能正常结籽。这种花器官结构和开花结籽特性
独特于拟南芥、金鱼草和水稻等模式植物。尽管在这
些植物中对花发育的分子遗传机制有一定的了解, 但
迄今为止, 关于菠萝花发育MADS-box基因的研究报
道较少。本研究采用基因序列同源克隆法结合RACE
技术获得1个AGL6亚家族MADS-box基因的cDNA全
长序列, 通过生物信息学方法对这个基因及其编码的
蛋白进行结构和功能分析, 运用电子表达谱、半定量
RT-PCR和实时荧光定量PCR解析这个基因的组织
表达特异性, 初步阐明该基因在菠萝花发育过程中的
功能, 为揭示菠萝花发育的分子遗传机制提供理论
依据。
1 材料与方法
1.1 植物材料
菠萝(Ananas comosus (L.) Merrill)品种卡因(Smooth
Cayenne)由广西亚热带作物研究所菠萝种质资源圃
保存及提供。分别取花芽原基时期(生长点狭小, 心叶
紧叠不展开, 叶片基部青绿色)、花芽分化期(生长点
宽圆而平, 向上突起延伸, 心叶舒展, 叶片基部黄绿
色)、花芽形成期(生长点周围形成许多小突起, 花序
和小花原始体形成, 叶片随花芽发育膨大而束成一
丛, 叶基部出现淡红色晕圈, 即“红环”)、抽蕾期(小
花苞片分化完成, 冠芽和裔芽原始体形成, 心叶变
红)、初花期(花序基部1–2朵小花开始开放)、盛花期
(花序中部1–2层小花开放; 当气温高时, 3–4层小花
同时开放)和终花期(花序上所有小花全部开完, 花瓣
凋萎、干枯至脱落)共7个不同花期的组织或小花; 在
盛花期分别取萼片、花瓣、雌蕊、雄蕊、根、茎和叶;
在果实成熟期取果肉。将所有材料用液氮速冻后于
–80°C保存, 用于组织表达特异性分析。
1.2 总RNA提取与AcMADS1基因克隆
采用CTAB改良法提取菠萝总RNA, 试材的CTAB裂
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解液中加入1/3体积的8 mol·L–1LiCl, 振荡离心, 沉淀
用异硫氰酸胍变性液溶解 , 加入适量的2 mol·L–1
NaAc(pH4.0)和酚 :氯仿 :异戊醇(25:24:1)振荡离心 ,
其余操作参照杨祥燕等(2009)的方法进行总RNA提取。
cDNA第1链的合成按照M-MLV反转录试剂盒(MBI)
使用说明书进行。根据植物AGL6亚家族典型基因的
保守序列设计简并引物P1(5′-CTCATCATCTTCTC-
MAGCCG-3′) 和 P2(5′-CCWATTTGYARRRWGGG-
TTC-3′), 扩增AcMADS1基因的中间片段, 并进行测
序。根据测序结果设计RACE特异引物RACE5(5′-TA-
ATGTCTTGCTTGTGCCAACG-3′)和RACE3(5′-AT-
CTTGGACCGCTGAGTGTGAA-3′), 参照 RACE 试
剂盒SMART™ RACE cDNA Amplification Kit(Clon-
tech)使用说明书扩增AcMADS1基因cDNA的5′端和
3′端序列, 并进行测序。用DNAMAN 6.0软件进行序
列拼接获得cDNA全长, 设计引物P3(5′-TAATTATA-
TTCCCCTCCCCCGC-3′) 和 P4(5′-GGTTCACAGA-
ACCCAACCAAGC-3′), 对其开放阅读框(ORF)进行
验证, 最终证实获得AcMADS1基因全长序列。引物
合成和基因测序均由上海生工公司完成。
1.3 生物信息学分析
利用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)网站中BLAST
和ORF Finder在线软件进行核苷酸、氨基酸同源序列
比对和ORF预测。使用DNAMAN 6.0软件对AcMA-
DS1同源蛋白进行氨基酸序列比对。利用PROSITE
(http://prosite.expasy.org/) 和 SMART 软 件 (http://
smart.embl-heidelberg.de/)进行保守域预测。利用
COILS软件 (http://embnet.vital-it.ch/software/COIL-
S_form.html)对蛋白质的卷曲螺旋区域(coil)进行预
测分析。采用ClustalX 2.1(http://www.clustal.org/)和
MEGA 5.1 软件 (http://www.megasoftware.net/) 进
行多序列比对和系统进化树构建。其中, 植物MIKCc
型13个主要的MADS-box亚家族共100个代表性蛋白
用于该系统进化树构建(表1)。利用ProtParam软件
(http://web.expasy.org/protparam/)预测蛋白质的分
子量、等电点和疏水性等基本性质。利用PSORT工
具 (http://www.psort.org)进行亚细胞定位预测。用
ProtFun软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/Prot Fun/)
预测蛋白质的功能分类。通过SOPMA软件 (http://
www.expasy.org/)预测蛋白质的二级结构。基于同源
建模原理, 利用Swiss-model软件(http://swissmodel.
expasy.org/)预测蛋白质三维结构, 并用Spdbv软件
(http://swissmodel.expasy.org/spdbv/)的拉氏构象图
(Ramachandran plot)对三维结构进行评价。
1.4 基因表达特性分析
通过NCBI网站UniGene数据库(http://www.ncbi.nlm.
nih.gov/unigene/)中EST表达模式获得AcMADS1同
源基因的电子表达谱。以菠萝18S rRNA为内参基因,
采用半定量 RT-PCR 和实时荧光定量 PCR 检测
AcMADS1基因在不同组织(萼片、花瓣、雌蕊、雄蕊、
根、茎、叶和果肉)和7个不同花期(花芽原基时期、花
芽分化期、花芽形成期、抽蕾期、初花期、盛花期和
终花期)的表达模式。AcMADS1基因的引物P3和P4
以及18S rRNA基因的引物18S-F(5′-CCTGAGAA-
ACGGCTACCACA-3′) 和 18S-R(5′-CCAACACAAT-
AGGACCGAAATC-3′)用于半定量RT-PCR分析。
cDNA模板各取1.0 μL进行PCR扩增。扩增程序为:
94°C预变性3分钟; 94°C变性30秒, 57°C退火30秒,
72°C延伸1分钟, 30个(AcMADS1基因)或27个(18S
rRNA基因)循环; 72°C延伸10分钟。每个反应进行3
次重复。扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳分析。
AcMADS1基因的引物QP1(5′-TCCCCCGCTACC-
CACTTCCT-3′) 和 QP2(5′-TCTCGATCCTCTTCAG-
CTCAAC-3′) 以及 18S rRNA 基因的引物 Q18S-F
(5′-AGTTGGACCTTGGGTTGTGTCG-3′)和Q18S-R
(5′-ATGTATGCAGAGCTTGGGCTTG-3′)用于实时
荧光定量PCR分析。具体操作参照BIO-RAD CFX96
分析仪说明书和SYBR® Premix ExTaqTM试剂盒
(Takara)使用说明书。每个实验重复3次。利用CFX
Manager和Excel软件进行数据分析, 确定AcMADS1
基因的相对表达量。
2 结果与讨论
2.1 AcMADS1基因cDNA全长克隆和序列分析
以菠萝小花cDNA为模板, 使用引物组合P1和P2扩
增获得509 bp的中间特异片段。利用RACE方法分别
获得419 bp的5′端片段和543 bp的3′端片段(图1A)。

蔡元保等: 菠萝花发育相关基因 AcMADS1 的克隆与组织表达特性分析 695

表1 用于构建系统进化树的MADS-box蛋白及其GenBank登录号
Table 1 MADS-box proteins and their GenBank accession numbers for generating the phylogenetic tree
No. Loci Accession No． Species No. Loci Accession No． Species
1 SHP1/AGL1 NP_001078311 Arabidopsis thaliana 51 GhMADS-9 AAU87582 Gossypium hirsutum
2 SHP2/AGL5 NP_850377 Arabidopsis thaliana 52 PMADS9 ABD77426 Petunia hybrida
3 FAR CAB42988 Antirrhinum majus 53 DlAGL15 AEL16646 Dimocarpus longan
4 PLE AAB25101 Antirrhinum majus 54 BnAGL15 ABD77425 Brassica napus
5 STK/AGL11 NP_001078364 Arabidopsis thaliana 55 AGL17 NP_179848 Arabidopsis thaliana
6 FBP7 CAA57311 Petunia hybrida 56 AGL16 AAG37899 Arabidopsis thaliana
7 SEP2/AGL4 NP_186880 Arabidopsis thaliana 57 AGL21 AEE86856 Arabidopsis thaliana
8 SEP3/AGL9 AAB67832 Arabidopsis thaliana 58 ANR1 CAB09793 Arabidopsis thaliana
9 SEP4/AGL3 P29383 Arabidopsis thaliana 59 AGL7/AP1 CAA78909 Arabidopsis thaliana
10 FBP4 AAK21247 Petunia hybrida 60 AGL8/FUL Q38876 Arabidopsis thaliana
11 FBP9 AAK21249 Petunia hybrida 61 SQUA CAA45228 Antirrhinum majus
12 OsMADS45 AAB50180 Oryza sativa 62 TM4 Q40170 Solanum lycopersicum
13 PrMADS2 AAD09207 Pinus radiata 63 FBP26 AAF19164 Petunia hybrida
14 PrMADS3 AAB58907 Pinus radiata 64 PFG AAF19721 Petunia hybrida
15 GpMADS3 BAA85630 Gnetum parvifolium 65 NAP1-2 AAD01422 Nicotiana tabacum
16 GGM9 CAB44455 Gnetum parvifolium 66 AP3 NP_191002 Arabidopsis thaliana
17 GGM11 CAB44457 Gnetum parvifolium 67 DEF P23706 Antirrhinum majus
18 DAL1 CAA56864 Picea abies 68 NtDEF CAA65288 Nicotiana tabacum
19 AcMADS1 AGG68164 Ananas comosus 69 SILKY1 AAF59838 Zea mays
20 HvAGL6 AAS48128 Hordeum vulgare 70 AoDEF BAC75969 Asparagus officinalis
21 ZAG3 AAB00078 Zea mays 71 PI NP_197524 Arabidopsis thaliana
22 OsMADS6 AAB64250 Oryza sativa 72 GLO Q03378 Antirrhinum majus
23 OsMADS17 AAF21900 Oryza sativa 73 FBP1 Q03488 Petunia hybrida
24 pAOM3 AAQ83835 Asparagus officinalis 74 AOGLOA BAD13495 Asparagus officinalis
25 AGL6a ABK35281 Crocus sativus 75 OsMADS2 Q40702 Oryza sativa
26 DlMADS18 AAT37481 Dendrocalamus latiflorus 76 FLC AFU51423 Arabidopsis thaliana
27 HoAGL6 AAT88088 Hyacinthus orientalis 77 FLM/AGL27 Q9AT76 Arabidopsis thaliana
28 MfAGL6A AAP83381 Michelia figo 78 MAF3 ACL93457 Arabidopsis thaliana
29 MfAGL6B AAP83382 Michelia figo 79 MAF2 ACL93419 Arabidopsis thaliana
30 MpMADS3 BAB70738 Magnolia praecocissima 80 FLC3 ADA70732 Brassica rapa
31 MpMADS4 BAB70739 Magnolia praecocissima 81 MFL1 ACL54965 Cichorium intybus
32 RbAGL6 AAP83408 Ranunculus bulbosus 82 TT16/AGL32 AED93144 Arabidopsis thaliana
33 AcGL6 AFX72880 Aquilegia coerulea 83 TT16b ADV03951 Brassica rapa
34 EsAGL6 AEX58638 Epimedium sagittatum 84 TT16a ADV03946 Brassica napus
35 SzAGL6a ADN37695 Saurauia zahlbruckneri 85 TESTA16 AET97614 Brassica napus
36 AcAGL6a ADN37693 Actinidia chinensis 86 SOC1/AGL20 AEC10583 Arabidopsis thaliana
37 SvAGL6 AAP83412 Syringa vulgaris 87 AGL14 AEE83062 Arabidopsis thaliana
38 VvMADS3 AAM21343 Vitis vinifera 88 AGL19 AEE84684 Arabidopsis thaliana
39 AGL6 NP_182089 Arabidopsis thaliana 89 BnSOC1 AFH41826 Brassica napus
40 AGL13 NP_191671 Arabidopsis thaliana 90 BjSOC1 AFH41827 Brassica juncea
41 PhAGL6 BAA94287 Petunia hybrida 91 PmSOC1 AEO20229 Prunus mume
42 McAG6 ABE03878 Momordica charantia 92 SVP AEC07320 Arabidopsis thaliana
43 MdMADS11 CAA04325 Malus domestica 93 AGL24 AEE84922 Arabidopsis thaliana
44 AGL12/XAL1 NP_565022 Arabidopsis thaliana 94 SVP-a CAD48304 Brassica oleracea
45 OsMADS26 Q0J8G8 Oryza sativa 95 SVPL NP_001240951 Glycine max
46 TAGL12 NP_001233764 Solanum lycopersicum 96 SVP1 AFA37963 Actinidia deliciosa
47 GmAGL12 XP_003533515 Glycine max 97 ERAF17 BAB21509 Cucumis sativus
48 FDRMADS3 AAM55472 Oryza sativa 98 CUS3 CAB92396 Cucumis sativus
49 AGL15 AAA65653 Arabidopsis thaliana 99 DEFH7 CAC44080 Antirrhinum majus
50 AGL18 AAG37900 Arabidopsis thaliana 100 TDR8 NP_001234105 Solanum lycopersicum
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图1 AcMADS1基因的核酸序列(A)及其同源蛋白的氨基酸序列(B)比对
(A) AcMADS1基因的核酸序列, 起始密码子和终止密码子用方框标出, 各引物序列用下划线标出; (B) AcMADS1氨基酸序列和其它
AGL6亚家族MADS-box蛋白的序列比对。蛋白登录号 : 菠萝AcMADS1(AGG68164); 油棕AGL6-1(AAW66884); 番红花
AGL6a(ABK35281); 水稻OsMADS6(AAB64250); 玉米ZAG3(AAB00078); 拟南芥AGL6(NP_182089)。MADS-box、I区、K区和C
区分别标出; 方框部分为卷曲螺旋区

Figure 1 Nucleotide sequence of AcMADS1 (A) and alignment of amino acid sequence with its homologous proteins (B)
(A) Nucleotide sequence of AcMADS1, start codon and stop codon are boxed, the primer sequences are underlined; (B) The
amino acid sequence of AcMADS1 is compared with that of other AGL6 clade of MADS-box proteins. Accession numbers of
selected proteins are AcMADS1 (AGG68164) from Ananas comosus; AGL6-1 (AAW66884) from Elaeis guineensis; AGL6a
(ABK35281) from Crocus sativus; OsMADS6 (AAB64250) from Oryza sativa; ZAG3 (AAB00078) from Zea mays; AGL6
(NP_182089) from Arabidopsis thaliana. MADS-box, I domain, K domain, and C domain are marked respectively; coiled-coil
domain is boxed


蔡元保等: 菠萝花发育相关基因 AcMADS1 的克隆与组织表达特性分析 697

将所得3段序列拼接后获得了1条长度为1 104 bp的
菠萝 MADS-box 基因全长序列 , 5′端非编码区
(5′-UTR)长度为221 bp, 3′端非编码区(3′-UTR)长度
为157 bp, ORF长度为726 bp, 编码241个氨基酸残
基。利用引物P3与P4对ORF进行验证, 得到大小为
914 bp的条带, 测序结果与拼接序列相应片段完全
一致(图1A)。将此基因命名为AcMADS1, GenBank
登录号为KC257408。在NCBI网站进行Blast序列比
对, 发现AcMADS1基因cDNA全长序列与其它植物
来源的AGL6亚家族MADS-box基因具有很高的相似
性, 其中与该亚家族基因的油棕(Elaeis guineensis)
AGL6-1 、番红花 (Crocus sativus)AGL6a 和水稻
OsMADS6在核苷酸水平上相似性分别高达83%、
81%和77%; 在氨基酸水平上相似性分别高达84%、
85%和77%。因此, 初步认为克隆所获得的AcMA-
DS1基因为菠萝AGL6亚家族MADS-box基因。
2.2 AcMADS1蛋白的系统演化
同源序列比对分析结果表明, 菠萝AcMADS1蛋白与
其它植物来源的MIKC型AGL6亚家族MADS-box典
型蛋白(AGL6-1、AGL6a、OsMADS6、ZAG3和AGL6)
在氨基酸水平上相似性很高 , 序列相似性均超过
75%(图1B)。蛋白的保守域预测表明, 菠萝AcMADS1
蛋白与这些MADS-box典型蛋白都含有高度保守的
MADS-box结构域、半保守的K区、较不保守的I区和
极不保守的C区, 而且在K区含有明显的卷曲螺旋区
(coiled-coil, COIL)(图1B)。可见, AcMADS1蛋白是典
型的植物MIKC型AGL6亚家族MADS-box蛋白, 而且
该亚家族蛋白在长期的生物进化过程中具有较高的
保守性, 尤其是MADS-box结构域呈高度保守。
为了进一步明确AcMADS1蛋白在植物MADS-
box蛋白家族中的进化地位和关系, 将来源于不同植
物的MIKCc型不同亚家族共100个典型MADS-box基
因的蛋白序列构建系统进化树。系统进化分析结果表
明, 所有植物MIKCc型MADS-box基因可明显分为13
个主要的MADS-box进化分支 , 即AGL6、AGL2
(SEP)、AP1/FUL(SQUA)、SOC1(TM3)、AG、TM8、
FLC 、 AGL15 、 AGL17 、 AGL12(XAL1) 、 TT16
(GGM13)、AP3/PI(DEF/GLO)和SVP(STMADS11)
亚家族(图2)。其中, AGL6亚家族由被子植物和裸子
植物2个进化分支组成, 被子植物进化分支又由单子
叶植物、木兰类植物、真双子叶植物基础组、小核心
真双子叶植物组和大核心真双子叶植物组等进化分
支组成, 但AGL6亚家族基因的进化分类并没有与相
应的物种进化分类相一致(尤其是被子植物)。从系统
进化树(图2)可以看出, AcMADS1蛋白属于AGL6亚
家族单子叶植物群 , 与其它单子叶植物番红花
AGL6a、风信子(Hyacinthus orientalis)HoAGL6和芦
笋 (Asparagus officinalis)pAOM3的亲缘关系最近 ,
与裸子植物的该亚家族成员亲缘关系最远。此外, 从
整个MIKCc型MADS-box基因的系统进化关系中可以
看出, AGL6亚家族只与AP1和SEP亚家族的亲缘关
系接近, 形成于同一个进化分支, 可归类为同一个进
化亚家族; 而且AGL6亚家族与SEP亚家族的关系比
AP1亚家族更为密切(图2)。
2.3 AcMADS1蛋白的基本性质
为深入了解AcMADS1基因所编码蛋白质的多种理化
性质, 经ProtParam软件在线分析表明, AcMADS1蛋
白质分子量为27.50 kDa, 理论等电点为9.26, 总平
均亲水性(GRAVY)为–0.69, 而且该蛋白的氨基酸中
大部分为亲水性氨基酸, 表明该蛋白是亲水性蛋白。
因此, 推测AcMADS1蛋白是一个亲水碱性蛋白。用
PSORT软件和ProtFun软件进行预测 , 表明AcMA-
DS1蛋白定位于细胞核的可能性为88%, 而且具有转
录及转录调控的功能。该预测结果符合转录因子的亚
细胞定位特征和生物学功能。
2.4 AcMADS1蛋白的空间结构
利用SOPMA软件对AcMADS1蛋白的二级结构预测
表明, 该蛋白的二级结构由α-螺旋(蓝色表示)、无规
则卷曲(紫色表示)、折叠延伸链(红色表示)和β-转角
(绿色表示)组成, 所占比例分别为53.94%、28.63%、
12.86%和4.56%(图3A)。可见, α-螺旋、无规则卷曲
和折叠延伸链构成了AcMADS1蛋白二级结构的主要
骨架。已知α-螺旋是最为稳定的蛋白质空间结构, 普
遍存在于各类蛋白质中, 并常常位于蛋白质表面。由
此初步推测, 含有丰富α-螺旋的AcMADS1蛋白的空
间结构和理化性质是比较稳定的。AcMADS1蛋白4
个结构域所对应的二级结构预测结果表明, 高度保守
的MADS-box结构域主要含有α-螺旋和折叠延伸链;
半保守的K区绝大部分由3个α-螺旋(分别为K1、K2和
698 植物学报 49(6) 2014



图2 菠萝AcMADS1蛋白与其它植物MIKCc型MADS-box蛋白的系统进化树
节点处的数字表示1 000次重复的自展值。AGL6亚家族基因来源于裸子植物标注黑心菱形; 来源于单子叶植物标注黑心圆; 来源于
木兰类植物标注空心框; 来源于真双子叶植物基础组标注空心菱形; 来源于小核心真双子叶植物组标注空心圆; 来源于大核心真双
子叶植物组标注黑心框

Figure 2 Phylogenetic tree analysis of AcMADS1 with MIKCc-type MADS-box proteins from other plant species
The numbers next to each node indicate bootstrap support from 1 000 replicate analysis. AGL6-like MADS-box genes from
gymnosperms are indicated with filled diamonds; monocots with filled circles; magnoliids with open squares; basal eudicots with
open diamonds; small core eudicots with open circles; large core eudicots with filled squares


K3)组成; 较不保守的I区含有1个α-螺旋和1个无规则
卷曲; 极不保守的C区主要含有无规则卷曲(图3A)。
MADS-box结构域是MADS-box蛋白N端高度保
守的结构域, 具有结合靶DNA、形成蛋白二聚体和结
合辅助因子的功能(Immink et al., 2002)。为了进一步
了解AcMADS1蛋白核心结构的特征, 选择该蛋白的
第2–73个氨基酸为模拟肽段, 应用Swiss-model软件
进行三维结构的同源建模。经同源比对分析, 以肌细
胞特异增强因子2B(含有MADS-box结构域)的晶体结
构(PDB ID: 1n6jA)为模板, 获得了AcMADS1蛋白核
心结构的三维结构模型(图3B)。该结构模型显示,
MADS-box结构域主要含有1个α-螺旋(alpha helix,
红色)和平行相连的2个折叠延伸链(extended strand,
黄色, 属于β-链), 其中NRQVT序列(NRQVT se-
quence)和VLCDA序列(VLCDA sequence)是其结构
域中可能的DNA结合位点(蓝色)。该蛋白核心结构的
蔡元保等: 菠萝花发育相关基因 AcMADS1 的克隆与组织表达特性分析 699



图3 AcMADS1蛋白的二级结构、三维模型和拉氏构象图
(A) AcMADS1蛋白的二级结构, 竖线从长到短依次为α-螺旋(蓝色)、折叠延伸链(红色)、β-转角(绿色)和无规则卷曲(紫色); (B)
AcMADS1蛋白核心结构的三维模型; (C) 三维模型的拉氏构象图

Figure 3 Secondary structure, three-dimensional structure and Ramachandran plot of AcMADS1 protein
(A) Secondary structure of AcMADS1 protein, the lines from long to short respectively represent alpha helix (blue), extended
strand (red), beta turn (green), and random coil (purple); (B) Three-dimensional structure for the core domain of AcMADS1 pro-
tein; (C) The Ramachandran plot evaluation of three-dimensional structure


三维模型符合转录因子与DNA结合的MADS-box结
构域特征, 即含有1个长α-螺旋和2个β-链(Rounsley
et al., 1995)。此外, 该模型中第60个氨基酸(VAL60)
之后的 I区紧接着 1个 α-螺旋和 1个无规则卷曲
(random coil, 灰白色)。这与二级结构预测结果相一
致。用Spdbv软件对该蛋白核心结构的三维模型进行
检测 , 获得了拉氏构象图。由该图 (图3C)可知 ,
AcMADS1蛋白的α-螺旋(红色点)主要出现在第3象限
的黄色区域, 折叠延伸链(黄色点)主要出现在第2象
限的黄色区域, 而黄色区域是最理想的φ角和ψ角分
布区域。可见, 所构建的AcMADS1蛋白核心结构的
三维模型是合理的, 该蛋白具有稳定的空间结构。
2.5 AcMADS1基因的组织表达特性
在NCBI数据库中搜索与菠萝AcMADS1基因相似性
最高的5个UniGene的EST表达模式(表2), 结果显示
这些UniGene主要在植物的生殖器官中表达, 尤其在
表2 AcMADS1同源基因的电子表达谱
Table 2 EST profile of AcMADS1 homologous genes
UniGene Pool name
Os.
7271
Hv.
21035
Ta.
777
Os.
2236
Ta.
56655
Callus 0 0 0 0
Flower –
Leaf 0 0 0 0 0
Panicle/
inflorescence
–
Root 0 0 0 0
Seed
Stem 0 0 0 0 0
(vegetative)
Meristem 0 0 – 0 –
Pericarp – – – –
Pistil – – – –
Spike – – – –
– 没有描述。– No description
700 植物学报 49(6) 2014

花器官中表达最为强烈, 但在营养器官中几乎不表
达。这暗示了AcMADS1基因也有类似的功能。
为了探明AcMADS1基因的不同组织表达特性,
以菠萝18S rRNA为内参基因, 利用半定量RT-PCR
和实时定量PCR检测AcMADS1基因在不同组织(生
殖器官的果肉、花瓣、萼片、雌蕊和雄蕊, 以及营养
器官的根、茎和叶)中的表达量。结果表明, AcMADS1
基因在果肉及花器官的雌蕊、花瓣和萼片中均有表达,
且在花器官中都有较高的表达量, 但在雄蕊及营养器
官的根、茎和叶中几乎不表达(图4)。可见, AcMADS1
基因具有显著的组织表达特异性, 尤其在花器官中特
异表达, 可能对花器官发育具有重要的调控作用。
为了进一步揭示AcMADS1基因在花器官中的表
达特性, 利用半定量RT-PCR和实时定量PCR检测该
基因在7个不同花期(花芽原基时期、花芽分化期、花
芽形成期、抽蕾期、初花期、盛花期和终花期)的表
达量。结果表明, AcMADS1基因在花芽原基时期几乎
不表达, 在花芽分化后均有较强的表达量, 其中花芽
分化期的表达量最高, 但随着花期的持续表达量逐渐
下降, 终花期的表达量最低(图5)。可见, AcMADS1
基因在花器官发育早期表达量最强, 后期有下降趋
势, 推测其在顶端分生组织的分化中起重要作用。
2.6 讨论
近年来, 随着分子生物学的发展, 有关参与调控植物
花器官特征的基因研究已获得了突破性的进展, 人们
对花器官发育的分子遗传机制也了解得更加深入。继
经典的花器官发育ABC模型到现在被广泛接受的
ABCDE模型, 其中涉及的基因绝大多数属于MIKC型
MADS-box家族基因。MADS-box基因编码一个转录
因子家族, 在调控植物花器官发育过程中起着关键作
用(Irish, 2003; Jack, 2004; Smaczniak et al., 2012)。
本研究通过同源克隆结合R A C E方法获得菠萝
AcMADS1基因, 对其进行同源序列比对和蛋白保守
域预测, 发现该基因含有高度保守的MADS-box、半
保守的K区、多变的I区和C区4个结构域, 属于典型的
MIKC型MADS-box基因。其中, MADS-box和K区是
MADS- box基因家族的典型特征。MADS-box具有结
合靶DNA、形成蛋白二聚体和结合辅助因子的功能
(Immink et al., 2002)。三维模型分析表明, AcMADS1


图 4 菠萝AcMADS1基因在不同组织中的RT-PCR(A)和
qRT-PCR(B)表达分析

Figure 4 Expression analysis of AcMADS1 in different tis-
sues of pineapple by RT-PCR (A) and qRT-PCR (B)



图5 菠萝AcMADS1基因在不同花期中的RT-PCR(A)和qRT-
PCR(B)表达分析
S1: 花芽原基时期; S2: 花芽分化期; S3: 花芽形成期; S4: 抽
蕾期; S5: 初花期; S6: 盛花期; S7: 终花期

Figure 5 Expression analysis of AcMADS1 at different dev-
elopment stages of pineapple flowers by RT-PCR (A) and
qRT-PCR (B)
S1: Flower bud primordium stage; S2: Flower bud differentia-
tion stage; S3: Flower bud forming stage; S4: Bud emergence
stage; S5: Initial flowering stage; S6: Full flowering stage; S7:
Final flowering stage

蔡元保等: 菠萝花发育相关基因 AcMADS1 的克隆与组织表达特性分析 701

蛋白的MADS-box结构域由1个α-螺旋和2个折叠延
伸链组成, 为该结构域行使功能提供合理、稳定的空
间结构。K区能够作为二聚体基元, 具有转录因子结
构特征的卷曲螺旋结构(COIL), 参与介导蛋白-蛋白
相互作用(Yang et al., 2003)。二级结构分析表明,
AcMADS1蛋白的K区由3个α-螺旋(分别为K1、K2和
K3)组成卷曲螺旋结构, 与疏水残基有保守的整齐间
距, 能在蛋白二聚体中形成亲和性螺旋结构, 可能调
节蛋白质之间的相互作用。大多数转录因子为碱性蛋
白, 通过电荷之间的相互作用与带负电荷的靶DNA结
合行使功能。蛋白质基本性质分析表明, AcMADS1是
亲水碱性蛋白, 被预测是转录因子定位于细胞核中。因
此, AcMADS1蛋白可能作为核靶向转录因子, 直接利
用MADS-box与靶DNA结合, 或者利用K区的卷曲螺旋
结构通过蛋白-蛋白互作的方式参与菠萝细胞的调控。
AGL6亚家族与AP1和SEP亚家族的蛋白互作模
式相似, 说明这3个亚家族具有相似的功能, 可归类
为同一个亚家族, 命名为AGL2/AGL6/SQUA(或AP1/
AGL9)亚家族(Parenicová et al., 2003)。从系统进化
树(图2)可以看出, AGL6亚家族与AP1和SEP亚家族
的亲缘关系接近, 形成于同一个进化分支, 可归类为
同一个进化亚家族, 再次验证了该结论。同源序列比
对和系统进化分析表明, 植物MIKCc型MADS-box蛋
白可明显分为13个主要的进化分支, AcMADS1蛋白
被归入AGL6亚家族, 与其它植物的AGL6亚家族典
型蛋白具有很高的相似性, 在花发育过程中具有与E
类基因相似的功能。E类功能基因对所有花器官的发
育都是必需的, 与B、C类功能基因一起形成复合转录
因子, 激活或抑制靶基因的转录和表达(Theißen and
Saedler, 2001)。
AGL6亚家族基因广泛分布于被子植物和裸子植
物中, 但是在蕨类植物中尚未发现, 在开花转变和花
器官发育的调控中发挥重要作用 (Theißen et al.,
2000; Pařenicová et al., 2003)。组织表达模式分析
表明, AcMADS1基因具有显著的组织表达特异性,
尤其在花器官中特异表达, 但在营养器官中几乎不表
达; 而且在花器官发育早期表达量最高, 后期有下降
趋势。这种表达模式与其它被子植物AGL6亚家族基
因相似, 如单子叶植物玉米ZAG3(Thompson et al.,
2009)、水稻OsMADS6(Ohmori et al., 2009; Li et al.,
2010)和风信子HoAGL6(樊金会等, 2007)以及真双子
叶植物拟南芥AGL6(Ma et al., 1991)、葡萄(Vitis vi-
nifera)VvMADS3(Boss et al., 2002) 和 矮 牵 牛
PhAGL6(Rijpkema et al., 2009)。这些AcMADS1同源
基因均在花分生组织和花器官中表达, 却几乎不在营
养器官中表达, 并且在促进开花和调节花器官形成过
程中发挥着不可替代的作用。由此推测, AcMADS1基
因可能在菠萝花器官发育和开花诱导过程中起重要调
控作用。这些花特异的表达模式暗示着AGL6亚家族基
因的基本功能是控制开花时间和花器官发生。AGL6
亚家族基因在拟南芥中异位表达所出现的表型支持了
它们具有这种相似或相同的基本功能。用属于该亚家
族基因的阔花麻竹 (Dendrocalamus latiflorus)DlM-
ADS18(Tian et al., 2005)、风信子HoAGL6(樊金会等,
2007)以及文心兰OMADS1(Hsu et al., 2003)异位转
化拟南芥, 转化植株都出现类似的形态变化, 即AGL6
亚家族基因表现出促进开花诱导、引起提早开花和花
器官同源转化的功能。对AGL6同源基因突变体或异位
表达的深入研究表明, 一些AGL6亚家族基因是通过
控制开花时间的2个关键因子FLC和FT的转录或者激
活SCO1和FT(FLY)来调节开花时间, 促进早花(Hsu
et al., 2003; 樊金会等, 2007; Yoo et al., 2011)。
目前已经从被子植物和裸子植物中克隆获得了
一些AGL6亚家族基因, 但是该亚家族基因的功能和
作用机制仍不清楚。本研究通过RACE技术克隆了调
控菠萝花器官发育的AGL6亚家族基因AcMADS1,
对其亚家族的分属及其功能基序进行了分析, 并初步
分析了该基因的空间表达模式。但有关该基因更全面
的时空表达模式和基因功能, 还有待于利用转基因、
基因敲除和酵母双杂交等技术进行深入研究, 并最终
为阐明菠萝花器官发育的分子调控机理奠定基础。
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Cloning of Flowering-related Gene AcMADS1 and Characterization of
Expression in Tissues of Pineapple (Ananas comosus)
Yuanbao Cai1, Xiangyan Yang1*, Guangming Sun2, Qiang Huang1, Yeqiang Liu3
Shaopeng Li4, Zhili Zhang5
1Guangxi Subtropical Crops Research Institute, Nanning 530001, China; 2South Subtropical Crop Research Institute, Chi-
nese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Zhanjiang 524091, China; 3Horticultural Research Institute, Guangxi
Academy of Agricultural Sciences, Nanning 530007, China; 4College of Horticulture and Landscape Architecture, Hainan
University, Haikou 570228, China; 5Hainan Academy of Agricultural Sciences, Haikou 571100, China
Abstract MADS-box gene is a key transcription factor that plays crucial roles in plant development, especially controlling
the formation and development of floral organs. We cloned the flower-specific gene from floral organs of Ananas comosus,
named AcMADS1 (GeneBank accession no. KC257408), was cloned by homology-based cloning and RACE. The open
reading frame of AcMADS1 was 726 bp, encoding 241 amino acids with molecular weight 27.5 kDa and isoelectric point
9.26. Sequence alignment and phylogenetic tree analysis indicated that the deduced protein AcMADS1 contained a con-
servative MADS-box and semi-conservative K domain and belonged to the AGL6 clade of the MADS-box family. Bioinfor-
matics analysis demonstrated that AcMADS1 was an alkaline and hydrophilic protein; the secondary structure comprised an
α-helix, a random coil and an extended strand; the protein core structure agreed with the transcription factors and the func-
tion of the common DNA combining domain MADS-box in its protein 3D model and was located in the nucleus as a tran-
scription factor. Tissue-specific analysis showed that AcMADS1 was expressed in floral organs (pistils, petals and sepals)
and flesh of pineapple, with nearly no transcription detected in vegetative organs (roots, stems and leaves) and stamens.
Furthermore, the expession of AcMADS1 was higher at the early phase of floral development, then reduced at the late
phase. AcMADS1 may have important roles in floral induction and floral development of pineapple.
Key words pineapple (Ananas comosus), flower development, MADS-box gene, cloning, gene expression
Cai YB, Yang XY, Sun GM, Huang Q, Liu YQ, Li SP, Zhang ZL (2014). Cloning of flowering-related gene AcMADS1 and
characterization of expression in tissues of pineapple (Ananas comosus). Chin Bull Bot 49, 692–703.
———————————————
* Author for correspondence. E-mail: yangxiangyan84412@126.com
(责任编辑: 白羽红)