全 文 ：植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2015, 50 (3): 354–362, www.chinbullbotany.com
doi: 10.3724/SP.J.1259.2015.00354
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收稿日期: 2014-11-15; 接受日期: 2015-01-27
基金项目 : 国家高技术研究发展计划重点项目 (No.2012AA101204)、国家自然科学基金 (No.31000029)、海南省自然科学基金
(No.ZDFD 20120765)、海南省引进集成应用专项(No.YJJC2011004)、海南省研究生创新科研课题(No.Hyb2011-4)和海南省重大科技项
目(No.ZDZX2013023-1)
* 通讯作者。E-mail: sunhaiyan@itbb.org.cn; pengming@itbb.org.cn
地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶基因的克隆、烟草
瞬时表达及转化拟南芥的研究
李潇1, 孙海彦1, 2*, 阮孟斌2, 王霈虹3, 彭明2*
1海南大学, 海口 570228; 2中国热带农业科学院热带生物技术研究所, 海口 571101
3北京市科学技术情报研究所, 北京 100048
摘要 从地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)中克隆到耐高温α-淀粉酶基因全长, 构建了原核表达载体, 转入大肠杆菌
(Escherichia coli)中, 使用IPTG于28°C诱导6小时后, 通过SDS-PAGE检测到目的蛋白, 分子量约为55 kDa, 并通过酶活
力检测实验证明该蛋白具有耐高温α-淀粉酶活性。同时构建了该基因融合GFP的植物表达载体 , 通过农杆菌(Agro-
bacterium tumefaciens)介导瞬时转化烟草(Nicotiana tabacum)下表皮细胞并在荧光显微镜下观察, 发现在烟草下表皮细
胞的细胞质和液泡中均有绿色荧光。使用I2-KI溶液对乙醇脱色后的烟草叶片进行染色, 显色反应表明在烟草中表达的耐高
温α-淀粉酶具有酶活性。最后, 采用农杆菌介导的花蕾浸泡法将重组载体转化到拟南芥(Arabidopsis thaliana)中, 筛选到稳
定遗传的耐高温α-淀粉酶基因的拟南芥纯合子。研究结果为后期开展表达耐高温α-淀粉酶的转基因植物的相关研究奠定了
实验基础。
关键词 地衣芽孢杆菌, 耐高温α-淀粉酶基因, 烟草瞬时表达, 拟南芥
李潇, 孙海彦, 阮孟斌, 王霈虹, 彭明 (2015). 地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶基因的克隆、烟草瞬时表达及转化拟南芥的研
究. 植物学报 50, 354–362.
耐高温α-淀粉酶(thermostable α-amylase)是一
种在食品、发酵和淀粉工业中广泛应用的淀粉水解酶
(王春铭等, 2007), 其主要作用是在淀粉液化过程中
将淀粉水解成短链糊精。该酶普遍存在于细菌、真菌
和植物体内。地衣芽孢杆菌产生的耐高温α-淀粉酶具
有耐高温、活力高和易大规模生产等优良特性, 因而
成为目前工业上应用的耐高温α-淀粉酶的主要来源
(王慧超等, 2010)。由于地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉
酶具有广泛的应用价值, 近年来国内外学者开展了
一系列的相关研究, 例如产酶菌株的筛选诱变、发酵
条件的优化、淀粉酶基因的克隆、原核与真核的表达、
酶的纯化与性质研究及酶的应用研究等 (林剑等 ,
2002; 潘风光等, 2004; 杜承等, 2010; Liu et al.,
2010; 秦亚楠等, 2011; 林必博, 2011)。尽管上述研
究取得了一定的进展, 但是多局限于从地衣芽孢杆
菌生产耐高温α-淀粉酶, 然后将其添加到淀粉原料
中应用。随着微生物法生产该酶技术的日益成熟, 单
纯从微生物发酵技术角度来提高酶的生产技术水平,
以达到降低工业成本的方法已不具优势 (林剑等 ,
2003), 必须从新的思路进行研究和技术开发。随着
近年来基因工程技术的发展, 一些微生物来源的基
因已经在植物中进行了成功表达并实现了产业化应
用。例如将来源于苏云金芽孢杆菌的bt基因转化到棉
花(Gossypium spp.)中得到bt抗虫棉(文学和张宝红,
2000); 将来源于曲霉的植酸酶基因转化到玉米(Zea
mays)中得到含有植酸酶的玉米 (姚斌和范云六 ,
2000)。木薯(Maninot esculenta)是一种热带亚热带
特色作物, 新鲜块根中淀粉含量约30%, 干片中淀粉
含量约70%, 有“淀粉之王”和“地下粮仓”之称, 是
目前生产乙醇的一种重要原料。因此, 将地衣芽孢杆
菌耐高温α-淀粉酶转化到木薯中, 实现耐高温α-淀
粉酶在木薯块根中的直接表达, 获得的含有耐高温
·研究报告·
李潇等: 地衣芽孢杆菌耐高温 ɑ-淀粉酶基因的克隆、烟草瞬时表达及转化拟南芥的研究 355

α-淀粉酶的木薯淀粉原料再用于生产中, 可减少加
工过程中加入耐高温α-淀粉酶, 降低生产成本(赵淑
娟等, 2000; Lin et al., 2008)。本研究从一株高产耐
高温α-淀粉酶的地衣芽孢杆菌中克隆得到的耐高温
α-淀粉酶基因为全长, 通过序列比对、原核表达和对
酶功能进行验证, 确认克隆到的序列为耐高温α-淀
粉酶全长。把该基因在模式植物烟草(Nicotiana ta-
bacum)中瞬时表达, 通过烟草叶柄环割对叶片中淀
粉运输途径进行阻断, 使得叶片中淀粉含量积累至
可检测范围后, 经乙醇脱色并使用I2-KI进行染色, 实
验结果证实了本研究克隆到的地衣芽孢杆菌耐高温
α-淀粉酶可以在烟草中进行表达, 并通过亚细胞定
位确认了该酶的合成位置及活性。拟南芥 (Arabi-
dopsis thaliana)作为转基因模式植物, 不仅基因转
化技术比较成熟, 而且生长周期短, 容易培养。通过
比对克隆得到的耐高温α-淀粉酶基因与拟南芥全基
因组序列, 发现拟南芥自身不含有耐高温α-淀粉酶
基因。因此, 本研究通过将构建的耐高温α-淀粉酶基
因转入拟南芥中来验证该基因能否转入植物并进行
稳定遗传, 以期为今后进一步将耐高温α-淀粉酶基
因转入木薯, 获得含有耐高温α-淀粉酶的转基因木
薯新品种奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
地衣芽孢杆菌菌种、根癌农杆菌LBA4404、原核表达
载体pET-22b及植物GFP融合表达载体G1300, 由中
国热带农业科学院热带生物技术研究所彭明课题组
保存。大肠杆菌 (Escherichia coli)表达菌株BL21
(DE3)、大肠杆菌克隆菌株DH5α以及T载体零背景快
速连接载体购自天根生化科技有限公司。抗生素3号
培养基(antibiotic medium 3)购自DIFCO公司。农杆
菌侵染重悬液(MES、MgCl2和乙酰丁香酮), 121°C高
温灭菌20分钟, pH5.6。普通质粒小提试剂盒和琼脂
糖凝胶DNA回收试剂盒购自中科瑞泰生物技术有限
公司。FastQuant cDNA第1链合成试剂盒购自天根生
化科技有限公司。感受态的制法和转化等参照分子克
隆实验指南。引物合成及相关测序工作由华大基因公
司完成。
1.2 方法
1.2.1 地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶的酶活及其耐
高温稳定性检测
将地衣芽孢杆菌保藏菌种在含1%淀粉抗3培养基上
划线, 分离能产生耐高温α-淀粉酶的单菌落, 配制浓
度为1.8%的抗3培养基, 121°C高温灭菌30分钟, 将
分离得到的单菌落接种于培养基中, 220 rpm, 37°C
培养16小时。吸取2 mL菌液至发酵培养基中, 220
rpm, 37°C发酵5天。将发酵液离心, 回收上清, 于
100°C分别保温0、10、20、30、40、50和60分钟后,
参照GB8275-2009中所述方法, 检测耐高温α-淀粉
酶的酶活。

1.2.2 耐高温α-淀粉酶基因的获得
根据已报道的耐高温α-淀粉酶的基因序列(GenBank
登录号 : AY630336.1)设计 1对引物 , 上游引物 :
5-ATGAAACAACAAAAACGG-3, 下游引物: 5-CT-
ATCTTTGAACATAAAT-3。以本实验室保存的地衣
芽孢杆菌为模板, 进行菌落PCR。PCR反应程序: 预
变性94°C3分钟 ; 变性94°C30秒 , 退火50°C30秒 ,
延伸72°C2分钟, 35个循环; 72°C10分钟。使用琼脂
糖凝胶DNA回收试剂盒 , 按照DNA提取纯化操作
手册回收目的DNA片段 , 按零背景快速连接试剂
盒使用说明书进行连接反应, 构建重组质粒pZero-
Back-α。挑取阳性克隆送华大基因公司测序, 并用
DNAMAN软件对测序结果进行分析。

1.2.3 原核表达载体和植物GFP融合表达载体的构建
根据原核表达载体和植物GFP表达载体质粒图谱设
计2对引物, pET-22b上游引物: 5-CGGGATCCGAT
GAAACAACAAAAACG-3, 下游引物 : 5-CCGCTC
GAGTCTTTGAACATAAATTGA-3, 酶切位点为XhoI
和BamHI; G1300上游引物: 5-GCTCTAGAATGAA
ACAACAAAAACGG-3, 下游引物 : 5-CGGGATC
CTCTTTGAACATAAATTGA-3, 酶切位点为BamHI
和XbaI。以1.2.2中构建的重组质粒pZeroBack-α为模
板, 分别使用上述引物按照1.2.2中方法进行PCR扩
增并回收2条目的片段; 按零背景快速连接试剂盒使
用说明书进行连接反应, 分别构建重组质粒pZero-
Back-pET-22b-α和pZeroBack-G1300-α。按照DNA
356 植物学报 50(3) 2015

提取纯化操作手册提取上述2种质粒并进行双酶切,
回收目的片段后与经过同样方法酶切回收的表达载
体连接, 构建原核表达载体pET-22b-α和植物GFP融
合表达载体G1300-α, 并转化DH5α受体菌。挑取阳性
克隆送华大基因公司测序, 并使用DNAMAN软件进
行分析。

1.2.4 重组原核表达菌株的筛选及其透明圈鉴定
参照DNA提取纯化操作手册提取1.2.3中构建的原核
表达载体pET-22b-α, 转化BL21 (DE3)受体菌。 挑取
阳性克隆BL21 (DE3)/pET-22b-α, 在含有淀粉的LB
培养基上分3个区域划线。区域1为耐高温α-淀粉酶成
品酶 , 区域2为BL21 (DE3)/pET-22b-α, 区域3为
BL21 (DE3)/pET-22b (CK), 37°C培养2–3天, 在平
板中加I2-KI染色后观察透明圈的情况。

1.2.5 耐高温α-淀粉酶在大肠杆菌中的表达
将鉴定后的阳性重组菌株BL21 (DE3)/pET-22b-α加
入LB培养基振荡培养4小时, 检测菌液OD600达到0.8
后, 加入0.1 mmol·L–1 IPTG, 28°C低转速诱导6小时,
离心收集菌体。使用PBS缓冲液重悬后, 在冰浴环境
下超声破碎, 将破碎前发酵液、破碎后沉淀、破碎后
上清以及BL21 (DE3)/pET-22b (CK)菌体加考马斯亮
蓝染色液后沸水浴10分钟, 进行SDS-PAGE电泳分
析(诸葛健和唐是雯, 1994)。

1.2.6 重组植物GFP表达菌株的筛选
参照DNA提取纯化操作手册提取1.2.3中构建的植物
GFP融合表达载体, 转化农杆菌LBA4404, 在含有
kan+、rif+和chl+三抗LB平板上筛选阳性克隆LBA-
4404/G1300-α。

1.2.7 农杆菌侵染下烟草叶片下表皮细胞的瞬时表达
挑取1.2.6中筛选到的阳性克隆LBA4404/G1300-α以
及含有空白载体的农杆菌LBA4404/G1300 (CK), 置
于加入抗生素kan+、rif+和chl+的LB液体培养基中 ,
28°C振荡过夜培养后接种于新鲜培养基上, 4小时后
使用分光光度计在600 nm波长下测定农杆菌的菌液
浓度 , 离心后用MgCl2重悬液重悬菌体 , 使最终
OD600为1.2, 将重悬菌液于室温放置4小时或过夜后
注射烟草叶片下表皮, 2–4天后进行显微检测。
1.2.8 GFP绿色荧光观察
在共聚焦荧光显微镜下观察, 用蓝色激发光以观察
GFP蛋白所发出的绿色荧光, 并利用计算机拍摄储
存。

1.2.9 烟草叶片环割
为在烟草叶片中积累淀粉, 使用环割方法, 限制叶片
中合成的临时淀粉向其它位置转移, 用刀片在1.2.7
所侵染的叶片茎秆部位剥除表皮, 深至筛管, 切断
向外运输的途径, 并在伤口处涂抹凡士林防止水分
流失导致组织细胞死亡(Dai and Dong, 2011)。由于
在高等植物中, 光合作用产物通常在白天以临时淀
粉的形式储存于叶片中, 在夜晚通过筛管向下运输
至其它组织(Lin et al., 2008), 故环割时间选取上午
较为合适。

1.2.10 瞬时表达烟草叶片的染色
将1.2.9中处理的烟草叶片放入乙醇中煮3–5分钟脱
色, 用清水洗去叶片表面的乙醇后放入培养皿中, 用
稀释5倍的I2-KI (3 g碘化钾、1 g碘和100 mL水)溶液
对其进行染色, 观察叶片的颜色变化。

1.2.11 重组载体的拟南芥转化
使用1.2.6中LBA4404/G1300-α, 通过花蕾浸泡(flor-
al dip) (Clough and Bent, 1998)法转化拟南芥。将转
化后收获的拟南芥T0代种子经无菌处理后, 均匀铺于
含有潮霉素的MS培养基平板上, 于光照培养箱中培
养10–14天, 筛选出已转入G1300-α重组质粒的拟南
芥植株, 单株收集T1代种子后使用潮霉素对转基因拟
南芥植株进行筛选, 直至得到纯合株系。

1.2.12 拟南芥转化植株的PCR鉴定
称取0.1–0.3 g转基因拟南芥纯合株系的嫩叶, 采用
CTAB法提取总RNA, 使用FastQuant cDNA第1链合
成试剂盒对提取的RNA进行反转录, 获得转基因拟
南芥纯合株系cDNA。分别使用目的基因引物、潮霉
素引物以及GFP引物对其进行PCR扩增, 验证外源
基因的整合情况并进行凝胶电泳分析。

1.2.13 转基因拟南芥叶片中淀粉酶的酶活染色检测
将转基因拟南芥纯合株系叶片按照1.2.10中所述的方
李潇等: 地衣芽孢杆菌耐高温 ɑ-淀粉酶基因的克隆、烟草瞬时表达及转化拟南芥的研究 357

法处理后染色, 观察叶片的颜色变化。
2 结果与讨论
2.1 地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶的酶活检测及
耐高温的稳定性
将地衣芽孢杆菌在含1%淀粉的抗3培养基上划线, 使
用I2-KI溶液对平板进行染色, 结果如图1A所示。从图
1A可以看出, 由于地衣芽孢杆菌合成了耐高温α-淀
粉酶, 淀粉被水解, 产生透明圈。按照1.2.1中方法处
理发酵液后, 参照GB8275-2009所述方法测定耐高
温α-淀粉酶的活性, 结果见表1。表1显示, 耐高温α-
淀粉酶的初始酶活性为1 533 U·mL–1, 经60分钟
100°C保温后, 酶活性降低至1 373 U·mL–1, 但仍保
持89.6%, 由此可以确定耐高温α-淀粉酶具有耐高温
稳定性。
2.2 耐高温α-淀粉酶的全长扩增
使用1.2.3中设计的引物对地衣芽孢杆菌进行菌落
PCR, 对其产物进行凝胶电泳分析, 结果如图1B所
示。结果显示, 在1 500 bp处出现了明显的特异性扩
增条带, 且符合目的片段的大小。将测序结果使用
DNAMAN软件进行分析, 并与GenBank上的同源序
列进行比对, 比对结果显示回收后获得的1 539 bp目
的片段, 与同源序列一致性达100%。序列由+1位Ala
至+18位Asp与先前报道的成熟淀粉酶基因N端序列
一致, 由此判断地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶前体物
质包含一段含有29个氨基酸序列的信号肽, 且该信
号肽可以被大肠杆菌识别(蔡恒等, 2008)。根据测序
结果 , 回收的目的片段含有ATG起始密码子以及
TAG终止密码子。由此推断扩增得到的是地衣芽孢杆
菌耐高温α-淀粉酶基因的完整阅读框, 可以翻译出具
有生物学功能活性的耐高温α-淀粉酶。
2.3 原核表达载体pET-22b-α及植物GFP表达载
体G1300-α的鉴定
根据DNA提取纯化操作手册中所述方法提取1.2.3中
构建的2种表达载体质粒 , 使用XhoI和BamHI对
pET-22b-α进行双酶切, 用BamHI和XbaI对G1300-α
进行双酶切, 电泳结果如图1B所示。从图1B可以看
出, 第3泳道有长度约为5.5 kb和1 500 bp的2个条带,
分别是pET-22b载体和目的DNA; 第5泳道有长度约
为10 kb和1 500 bp的2个条带, 分别是G1300载体和
目的DNA, 由此证明目的片段成功插入了两载体并
转入DH5α中。
2.4 原核表达菌株在含淀粉培养基中的透明圈鉴定
使用I2-KI溶液对1.2.4中平板进行染色, 由图1C可观
察到, 区域1因涂有耐高温α-淀粉酶成品酶, 淀粉被
水解, 产生透明圈。区域2为BL21 (DE3)/pET-22b-α
阳性菌株, 可以表达具有活性的耐高温α-淀粉酶, 因
此淀粉被水解, 产生透明圈。区域3为BL21 (DE3)/
pET-22b (CK), 无法表达能够水解淀粉的耐高温α-淀
粉酶, 故无透明圈产生。由此判断, BL21 (DE3)/pET-
22b-α可以分泌具活性的耐高温α-淀粉酶至胞外。
2.5 重组目的蛋白的SDS-PAGE分析
按照1.2.5中的操作方法, SDS-PAGE结果显示, 在
55 kDa处1、3泳道均出现明显条带, 与4泳道中条带
对比有明显差异, 且大小与预期效果相符, 证明BL-
21 (DE3)/pET-22b-α经IPTG诱导6小时后表达了目
的蛋白耐高温α-淀粉酶(图1D)。泳道1中出现目的蛋
白条带, 进一步证明耐高温α-淀粉酶经过诱导表达后
可以分泌至胞外。
2.6 烟草瞬时表达
图2A左图为注射含有空白载体农杆菌LBA4404/
G1300 (CK)的烟草叶片下表皮细胞的显微成像, 可
以看出在细胞核和细胞壁中有绿色荧光; 右图为注射
含有目的载体农杆菌LBA4404/G1300-α的烟草叶片
下表皮细胞的显微成像, 可见其绿色荧光信号与对照
相比在亚细胞定位上有明显的区别, 且细胞核无荧光
出现。由此判断耐高温α-淀粉酶基因在烟草下表皮细
胞中成功表达。
2.7 瞬时表达烟草叶片的染色检测
图2B上图为未染色的侵染叶片, 其中叶片1为LBA-
4404/G1300 (CK)侵染叶片, 叶片2为LBA4404/
G1300-α侵染叶片, 经脱色后使用稀释I2-KI染色, 结
果如图2B下图所示。从图2B下图可以看出, 两叶片颜
色有明显差异, 染色后的叶片1颜色明显深于表达淀
粉酶基因的叶片2 (因淀粉酶降解叶片中的淀粉)。
358 植物学报 50(3) 2015


图1 耐高温α-淀粉酶基因的PCR扩增及酶活性鉴定
(A) 地衣芽孢杆菌的淀粉水解圈; (B) 地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶基因的PCR扩增片段及重组质粒的酶切验证(M: 15 000–2 000
marker; 1: 耐高温α-淀粉酶基因; 2: pET-22b-α重组载体; 3: pET-22b-α酶切验证/BamHI/XhoI; 4: G1300-α重组载体; 5: G1300-α酶
切验证/BamHI/XbaI); (C) BL21 (DE3)/pET-22b-α淀粉透明圈(1: 耐高温α-淀粉酶商品酶; 2: BL21 (DE3)/pET-22b-α; 3: BL21
(DE3)/pET-22b (CK)); (D) BL21 (DE3)/pET-22b-α诱导6小时后的SDS-PAGE (M: PageRulerTM Plus Prestained Protein Ladder; 1:
破碎前发酵液; 2: 破碎后上清; 3: 破碎后沉淀; 4: BL21 (DE3)/pET-22b菌体(对照))

Figure 1 PCR product of thermostable α-amylase from Bacillus licheniformis and identification of the activity of amylase
(A) The transparent zone of Bacillus licheniformis on an Antibiotic Medium 3 plate containing 1% soluble starch; (B) PCR product
of thermostable α-amylase from Bacillus licheniformis and identification of the recombinant plasmid (M: 15 000–2 000 marker; 1:
The gene of thermostable α-amylase; 2: Recombinant plasmid pET-22b-α; 3: Identification of enzyme digestion of pET-22b-α by
BamHI and XhoI; 4: Recombinant plasmid G1300-α; 5: Identification of enzyme digestion of G1300-α by BamHI and XbaI); (C)
The transparent zone of BL21 (DE3)/pET-22b-α on a LB plate containing 1% soluble starch (1: Commercial thermostable α-
amylase; 2: BL21 (DE3) with pET-22b-α; 3: BL21 (DE3) with pET-22b (CK)); (D) SDS-PAGE analysis of BL21 (DE3)/pET-22b-α
after induction for 6 hours (M: PageRulerTM Plus Prestained Protein Ladder; 1: Untreated fermentation liquid; 2: Superna-
tant after ultrasonication; 3: Precipitate after ultrasonication; 4: Bacterium solution of BL21 (DE3)/pET-22b (CK))

表1 高温处理后耐高温α-淀粉酶的酶活性变化
Table 1 The change of enzyme activity of thermostable α-amylase after high-temperature treatments
Treatment time (min) 0 10 20 30 40 50 60
Enzyme activity (U·mL–1) 1 533 1 538 1 528 1 509 1 489 1 458 1 373
李潇等: 地衣芽孢杆菌耐高温 ɑ-淀粉酶基因的克隆、烟草瞬时表达及转化拟南芥的研究 359

图2B上图显示叶片2大部分显露农杆菌侵染后的黄色
菌斑, 仅边缘为深绿色未被侵染; 而图2B下图叶片2
可以明显观察到与图2B上图叶片2形状一致的显色差
别, 说明被菌液侵染的部分有淀粉酶合成, 导致淀粉
降解, 未被侵染的部分则受到较小的影响。综合2.5
中所得结果判断, 耐高温α-淀粉酶在烟草叶片中不仅
表达, 而且具有相应的生物学功能活性。
2.8 重组载体的拟南芥转化
将经花蕾浸泡法转化后得到的拟南芥T0代种子消毒,
铺于含潮霉素抗性的MS培养基上 , 筛选得到转入
G1300-α重组质粒的T1代拟南芥植株, 如图2C上图
所示。经移栽收种后, 将种子铺于含潮霉素抗性的MS
培养基上 , 筛选抗性与非抗性植株比例为391:131
(约2.98:1), 符合单拷贝基因分离比。将其中一部分抗
性植株移栽收种后, 将其种子铺于含潮霉素抗性的
MS培养基上, 结果如图2C下图所示。所得T3代植株
全部为抗性植株, 由此判断T3代为纯合株系。
2.9 拟南芥转化植株的PCR鉴定
采用CTAB法提取2.8中获得的转基因拟南芥纯合株
系总RNA, 按照FastQuant cDNA第1链合成试剂盒
使用说明书对其进行反转录, 获得转基因拟南芥纯合
株系cDNA。分别使用目的基因引物、潮霉素引物以
及GFP引物对其进行PCR扩增, 凝胶电泳检测结果
如图2D上图所示。从图2D上图可以看出, 在第1泳道
1 700 bp左右、第2泳道750 bp左右及第3泳道750 bp
左右分别发现目的条带, 表明重组载体中基因不仅转
入拟南芥, 而且能在拟南芥中表达。
2.10 转基因拟南芥叶片中耐高温α-淀粉酶的酶
活性染色检测
图2D下图左侧为野生型拟南芥叶片, 右侧为转基因
拟南芥叶片, 叶片中耐高温α-淀粉酶的表达使得淀粉
被降解, 经I2-KI染色后, 野生型拟南芥叶片明显变蓝,
而转基因拟南芥叶片仅有很小部分变蓝。由此可以判
断在转基因拟南芥中表达的耐高温α-淀粉酶具有正
确的淀粉酶活性。
2.11 讨论
耐高温α-淀粉酶在工业中的应用已越来越广泛, 基因
工程的发展为作物育种提供了新的技术手段。鉴于苏
云金芽孢杆菌中的bt基因和曲霉中的植酸酶基因等
来源于原核及真核微生物的基因在转基因植物中的
成功表达和应用, 把耐高温α-淀粉酶基因转入高淀粉
含量的薯类作物将成为该工业酶未来新的发展方向。
本研究首先对地衣芽孢杆菌进行发酵培养, 之后处理
发酵液并检测其酶活性, 结果显示, 该酶在100°C保
温60分钟后, 仍保持89.6%的酶活性, 由此确定其耐
高温具稳定性。利用PCR从原核微生物地衣芽孢杆菌
中扩增得到耐高温α-淀粉酶的基因全长, 通过测序确
认所得序列为一段大小为1 539 bp且包含ATG起始
密码子、TAG终止密码子以及29个氨基酸组成的信号
肽的完整开放阅读框, 与Rivera等(2003)报道的序列
一致。转化大肠杆菌后, 通过淀粉平板进行酶活检测
以及SDS-PAGE凝胶电泳分析, 在55 kDa处发现目
的条带, 证实了耐高温α-淀粉酶在大肠杆菌中的表达
及活性。通过烟草瞬时表达系统, 在烟草下表皮细胞
中观察到GFP融合蛋白绿色荧光, 由此可以确认耐
高温α-淀粉酶在烟草中的表达位置。此外, 通过乙醇
脱色及使用I2-KI溶液对烟草叶片中的淀粉进行染色,
结果显示, 经LBA4404/G1300-α侵染后的叶片, 在
菌斑处染色无变化, 而边缘未被侵染的叶片部分染成
蓝色, 对比LBA4404/G1300 (CK)侵染后的叶片, 可
以认定在烟草叶片中表达的耐高温α-淀粉酶具有酶
活性。该实验结果与Pen等(1992)的报道有所不同,
分析原因可能有2点, 一是由于后者未进行烟草叶柄
环割处理, 故光合作用产物临时淀粉转运出叶片而导
致含量过低无法染色至肉眼可见; 二是瞬时表达结果
显示, 荧光亚细胞定位检测到该酶合成位置在细胞质
和液泡中, 乙醇脱色时, 经煮沸后细胞破裂, 导致耐
高温α-淀粉酶在高温条件下可以接触到叶绿体中的
淀粉粒并迅速反应降解。本实验结合显微与瞬时表达
技术, 进一步确认了耐高温α-淀粉酶的合成位置及酶
活性质。
为研究克隆得到的耐高温α-淀粉酶基因能否转
入植物体内, 本实验将重组载体通过农杆菌介导的花
蕾浸泡法转入模式植物拟南芥, 经筛选获得T3代纯合
子转基因株系, 以T3代植株cDNA为模板, 通过PCR
扩增, 证明重组载体已经转入拟南芥中表达, 并可以
稳定遗传。为验证转入拟南芥中的耐高温α-淀粉酶是
否具有活性, 将叶片用乙醇脱色后使用I2-KI溶液染
360 植物学报 50(3) 2015



图2 耐高温α-淀粉酶在真核植物中的表达
(A) 绿色荧光融合蛋白在烟草表皮细胞中的表达(左图为LBA4404/G1300侵染烟叶(对照); 右图为LBA4404/G1300-α侵染烟叶); (B)
用I2-KI溶液对瞬时表达烟草叶片染色(上图为未染色叶片(1: LBA4404/G1300侵染烟叶(对照); 2: LBA4404/G1300-α侵染烟叶); 下
图为I2-KI染色后叶片(1: LBA4404/G1300侵染烟叶(对照); 2: LBA4404/G1300-α侵染烟叶)); (C) 转基因拟南芥的筛选(上图为转基
因拟南芥T1代, 下图为转基因拟南芥T3代); (D) 转基因纯合子株系cDNA的PCR检测及I2-KI溶液对叶片染色(上图为转基因纯合子株
系cDNA的PCR检测(M: 2 000 marker; 1: 耐高温α-淀粉酶基因的目的条带; 2: Hyg基因的目的条带, 3: GFP基因的目的条带); 下图
为野生型和转基因拟南芥叶片)

Figure 2 The expression of thermostable α-amylase in plants
(A) Expression of fluorescent fusion proteins in tobacco epidermal cells (Tobacco epidermal cells infected by LBA4404/G1300
(CK) (left); Tobacco epidermal cells infected by LBA4404/G1300-α (right); (B) I2-KI dyeing of the tobacco leaf of transient ex-
pression with I2-KI solution (Leaf without dyeing (above) (1: Tobacco leaf infected by LBA4404/G1300 (CK); 2: Tobacco leaf
infected by LBA4404/G1300-α); Leaf dyed with the I2-KI solution (below) (1: Tobacco leaf infected by LBA4404/G1300 (CK); 2:
Tobacco leaf infected by LBA4404/G1300-α)); (C) Screening of transgenic Arabidopsis (Transgenic Arabidopsis of T1 generation
(above); Transgenic Arabidopsis of T3 generation (below); (D) The analysis of PCR amplification for the cDNA of homozygous
transgenic lines and the leaf of Transgenic Arabidopsis dyed with I2-KI solution (The analysis of PCR amplification for the cDNA
of homozygous transgenic lines (above) (M: 2000 marker; 1: The objective band of thermostable α-amylase genes; 2: The ob-
jective band of Hyg; 3: The objective band of GFP); The leaf of wild type and transgenic Arabidopsis dyed with I2-KI (below))
李潇等: 地衣芽孢杆菌耐高温 ɑ-淀粉酶基因的克隆、烟草瞬时表达及转化拟南芥的研究 361

色, 通过对比, 可观察到转基因拟南芥叶片中的淀粉
被降解, 由此确认在转基因拟南芥中表达的耐高温α-
淀粉酶具有正确的酶活性。Rubio等(2014)认为, 淀粉
酶的表达量与葡萄糖打破春化存在一定的联系。因此,
表达耐高温α-淀粉酶基因的转基因拟南芥纯合株系
将为今后继续研究耐高温α-淀粉酶对植物生长以及
代谢途径的影响提供帮助。
本研究通过原核表达及酶活力检测, 验证了来源
于地衣芽孢杆菌的耐高温α-淀粉酶基因可以在大肠
杆菌中表达, 并证实了所得基因的准确性。另外, 通
过注射烟草叶片瞬时表达, 验证了耐高温α-淀粉酶基
因可以在真核植物中被转录并翻译成蛋白质, 经I2-KI
染色实验, 证实该蛋白具有正确的酶功能活性; 并通
过转化拟南芥, 证明了该基因可以在拟南芥中表达并
稳定遗传, 且具有淀粉酶活性。这些研究为下一步利
用基因工程手段构建含有耐高温α-淀粉酶的转基因
植物新品种奠定了基础。
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362 植物学报 50(3) 2015

Studies of the Transient Expression and Transformation of Cloned
Thermostable α-Amylase Genes from Bacillus licheniformis in
Tobacco and Arabidopsis
Xiao Li 1, Haiyan Sun 1, 2*, Mengbin Ruan 2, Peihong Wang 3, Ming Peng 2*
1Hainan University, Haikou 570228, China; 2Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology, Chinese Academy of
Tropical Agricultural Sciences, Haikou 571101, China; 3Beijing Institute of Science and Technology
Information, Beijing 100048, China
Abstract The full-length thermostable α-amylase gene from a Bacillus licheniformis strain was cloned in a prokaryotic
expression vector and a plant expression vector with GFP as reporter gene. Thermostable α-amylase was overexpressed
in Escherichia coli by IPTG induction for 6 h at 28°C, protein bands at 55 kDa were detected with SDS-PAGE, and activity
of the enzyme was confirmed by amylolysis experiments. The plant expression vector was transformed into tobacco via
Agrobacterium tumefaciens mediated transformation. GFP expression was observed both in cytoplasm and vacuoles of
the lower epidermis of tobacco by fluorescence microscopy. Staining of the tobacco leaf by I2-KI revealed that the ther-
mostable α-amylase expressed in tobacco leaf had enzyme activity. Finally, the gene was introduced into Arabidopsis by
the floral dip method and homozygous transgenic plants expressing α-amylase gene were identified. The results of this
research provide further information for overexpression of thermostable α-amylase in transgenic plants.
Key words Bacillus licheniformis, thermostable α-amylase gene, tobacco transient expression, Arabidopsis
Li X, Sun HY, Ruan MB, Wang PH, Peng M (2015). Studies of the transient expression and transformation of cloned
thermostable α-amylase genes from Bacillus licheniformis in tobacco and Arabidopsis. Chin Bull Bot 50, 354–362.
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* Authors for correspondence. E-mail: sunhaiyan@itbb.org.cn; pengming@itbb.org.cn
(责任编辑: 孙冬花)