全 文 ：植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2010, 45 (3): 379–383, www.chinbullbotany.com
doi: 10.3969/j.issn.1674-3466.2010.03.010

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收稿日期: 2010-01-04; 接受日期: 2010-03-18
基金项目: 国家自然科学基金(No.30670208)、河南省教育厅基础项目(No.2007180027)、河南师范大学博士启动基金(No.080403)和河
南师范大学大学生创新性实验计划项目(No.2008197)
* 通讯作者。E-mail: limingjun2002@263.net
Δ现工作单位: 河南省安阳市第二中学
怀山药种质资源的包埋玻璃化超低温保存与植株再生
李海兵1, 周娜1Δ, 赵姣1, 李翔2, 冯秋妍1, 赵喜亭1, 3, 李明军1, 3*
1河南师范大学生命科学学院, 新乡 453007; 2河南师范大学体育学院, 新乡 453007
3河南省高校道地中药材保育及利用工程技术研究中心, 新乡 453007
摘要 通过对怀山药(Dioscorea opposita)种质资源的包埋玻璃化超低温保存与植株再生进行研究, 结果表明: 将低温下锻
炼7天的怀山药试管苗带芽茎段放入预培养基中, 低温下培养3天, 然后在室温下用3%的海藻酸钠和0.5 mol·L–1 CaCl2包
埋, 包埋珠用MS+0.2 mol·L–1蔗糖+2 mol·L–1甘油+50 g·L–1二甲基亚砜在0°C下装载60分钟, 用30%甘油+15%乙二醇
+10%二甲基亚砜+15%聚乙二醇+0.4 mol·L–1蔗糖在0°C下脱水60分钟, 迅速投入液氮, 24小时后立即用40°C水浴快速化
冻, 再用MS+0.5 mol·L–1蔗糖溶液洗涤2次, 转入再生培养基中培养, 可获得再生植株。再生植株成活率因基因型而异, 铁
棍山药、太谷山药、怀庆1号山药和B号山药的成活率分别为64.29%、49.21%、13.11%和39.81%。
关键词 超低温保存, 怀山药, 包埋玻璃化, 再生植株
李海兵, 周娜, 赵姣, 李翔, 冯秋妍, 赵喜亭, 李明军 (2010). 怀山药种质资源的包埋玻璃化超低温保存与植株再生. 植物
学报 45, 379–383.
怀山药(Dioscorea opposita Thunb.)为薯蓣科
(Dioscoreaceae)薯蓣属(Dioscorea)多年生缠绕性藤
本植物, 是我国道地中药材和著名的四大怀药之一,
主产于河南温县、武陟和沁阳等地。怀山药药食兼优,
具有降糖降脂、增强人体免疫力及抗衰老等功能, 素
有“怀参”之称, 其产品畅销国内外。目前, 传统的
山药种质资源保存仍采用大田种植的方法, 不仅需要
大量的人力、物力和财力, 而且还不可避免地受到各
种自然灾害(如病虫害、干旱、低温等)和人为失误(疏
于管理、挂错标签等)的影响, 最终可能造成特有种质
的遗失或混杂。因此, 探索怀山药种质资源离体保存
的方法具有十分重要的意义。
包埋玻璃化超低温保存是20世纪90年代中期兴
起的一种新的超低温保存技术(Matsumoto et al.,
1995)。该技术兼具玻璃化和包埋脱水超低温保存的
优点, 具有对材料的毒害性小、所需设备简单、易于
操作、脱水时间短、恢复生长快等优点, 在植物种质
资源保存上显示出巨大的应用潜力(吴雪梅和汤浩茹,
2005)。目前该技术已应用于苹果(Malus domestica)
(Paul et al., 2000)、枳橙(Poncirus trifoliate) (Wang et
al., 2002)、甘薯(Ipomoea batatas) (Hirai and Sakai,
2003)、非洲紫罗兰(Saintpaulia lonantha) (Moges et
al., 2004)、葡萄(Vitis spp.)(Wang et al., 2004)、悬钩
子 (Rubus idaeus)(Wang et al., 2005)、怀地黄
(Rehmania glutinosa)(李明军等, 2008)、铁皮石斛
(Dendrobium candidum)和黄独 (Dioscorea bulbif-
era)(Yin and Hong, 2009, 2010)等植物上。近年来, 本
实验室对怀山药种质玻璃化超低温保存进行了系统的
研究(李明军等, 2006; Li et al., 2009), 在此基础上又
进一步探索包埋玻璃化超低温保存技术及应用, 旨在
为怀山药种质资源的离体保存提供一条新的途径。
1 材料与方法
1.1 材料
供试材料为铁棍山药(Dioscorea opposita ‘Tiegun’)、
·技术方法·
380 植物学报 45(3) 2010
太谷山药 (D. opposita ‘Taigu’)、怀庆1号山药 (D.
opposita ‘Huaiqing No.1’)和B号山药 (D. opposita
‘No.B’) 4种基因型怀山药继代培养60天的试管苗。
1.2 方法
1.2.1 低温锻炼
怀山药试管苗于低温下分别炼苗0、3、5、7、15和
30天。

1.2.2 预培养
在无菌条件下 , 切取带芽茎段 , 放入含MS+0.1
mol·L–1 蔗糖(Suc)+0.1 mol·L–1 甘油(Gly)培养基中,
低温下预培养3天。

1.2.3 包埋
将材料切成2 mm左右的带芽茎段, 室温下与含3%海
藻酸钠和0.2 mol·L–1 Suc的MS培养基混合, 将混合
液滴入含有0.5 mol·L–1 CaCl2和0.2 mol·L–1 Suc的
MS培养基中进行包埋, 获得球形包埋珠。每个包埋珠
含1个材料。

1.2.4 装载
将包埋珠分别放入3种不同的装载液中, 装载液配比
分别为MS+0.2 mol·L–1 Suc+2 mol·L–1 Gly、MS+0.2
mol·L–1 Suc+2 mol·L–1 Gly+30 g·L–1甘露醇(Man)和
MS+0.2 mol·L–1 Suc+2 mol·L–1 Gly+50 g·L–1二甲基
亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)。于0°C下装载60分
钟。

1.2.5 脱水
用玻璃化保护剂 (30% Gly+15%乙二醇 (EG)+10%
DMSO+15%聚乙二醇(PEG)+0.4 mol·L–1 Suc)在0°C
下脱水60分钟。

1.2.6 冷冻保存
每10个处理过的包埋珠放入1个冻存管中, 滴加新的
玻璃化保护剂, 然后将冻存管迅速置于液氮中保存
24小时。

1.2.7 化冻洗涤
从液氮中取出冻存管, 分别放入温度为37°C、38°C、
40°C和42°C的水浴中化冻, 化冻时间为1–3分钟。解
冻后, 用含0.5 mol·L–1Suc的洗涤液洗涤包埋珠2次,
每次洗涤10分钟。

1.2.8 恢复培养
将包埋珠转入再生培养基(MS+ 2 mg·L–1 KT + 0.02
mg·L–1 NAA)中, 先暗培养14天, 再转到光下培养。
培养温度为(25±2)°C, 光照时间为每天14小时。记录
成活率及恢复生长的时间。成活率=(包埋玻璃化超低
温保存后成活的茎段数 )/(保存的总茎段数 )×
100%。

1.2.9 数据处理
本实验设计为单因子实验。每次处理25个带芽茎段,
实验重复3次。实验数据用平均值±标准差表示。采用
Excel和SPSS11.5软件进行方差分析。与对照比较采
用t检验和F检验, 多重比较采用LSD法检验。
2 结果与讨论
2.1 低温锻炼时间对超低温保存的影响
从表1可以看出, 经过一定时间的低温锻炼, 成活率
有显著提高。低温锻炼时间较短时, 随着低温锻炼时
间的延长, 成活率逐渐增高。低温锻炼时间为7天时,
成活率达到最大值。超过7天, 成活率基本保持不变,
虽稍有下降, 但未达到显著水平。可见, 适当的低温
锻炼有利于提高超低温保存后材料的成活率。
2.2 装载液对超低温保存的影响
从表2可以看出, 装载液成分显著影响保存材料的成
活率。用配比为MS+0.2 mol·L–1 Suc+2 mol·L–1
Gly+50 g·L–1 DMSO的装载液装载, 成活率最高; 而
用配比为MS+0.2 mol·L–1 Suc+2 mol·L–1 Gly和
MS+0.2 mol·L–1 Suc+2 mol·L–1 Gly+30 g·L–1 Man的
装载液装载, 成活率较低且效果相似。
2.3 化冻温度对超低温保存的影响
从表3可以看出, 化冻温度显著影响超低温保存后材
料的成活率。随着化冻温度的提高, 冻存后材料的成
活率也有显著提高。其中化冻温度为40°C时, 成活率
达到最高值。低于或高于40°C时, 成活率均下降。
李海兵等: 怀山药种质资源的包埋玻璃化超低温保存与植株再生 381
表1 低温锻炼时间对怀山药带芽茎段包埋玻璃化超低温保存
的影响
Table 1 The effect of cold-hardening time on cryopreserva-
tion of stem with axillary bud of Dioscorea opposita by
encapsulation-vitrification
Cold-hardening time (d) Survival rate (%)
0 0 ± 0 dC
3 4.35 ± 2.90 cC
5 31.59 ± 4.40 bB
7 52.17 ± 3.04 aA
15 50.57 ± 5.68 aA
30 49.28 ± 3.51 aA
不同小写字母表示差异显著(P<0.05); 不同大写字母表示差异
极显著(P<0.01)
Different small letters indicate significant difference (P<0.05);
and different capital letters indicate extremely significant
difference (P<0.01)


表2 不同装载液对怀山药带芽茎段包埋玻璃化超低温保存的影响
Table 2 The effect of different loading solution on cryopre-
servation of stem with axillary bud of Dioscorea opposita by
encapsulation-vitrification
The composition of loading solution Survival rate (%)
MS+0.2 mol·L–1 Suc+2 mol·L–1 Gly 41.82 ± 4.69 bB
MS+0.2 mol·L–1 Suc+2 mol·L–1
Gly+30 g·L–1 Man
41.48 ± 2.25 bB
MS+0.2 mol·L–1 Suc+2 mol·L–1
Gly+50 g·L–1 DMSO
54.75 ± 7.52 aA
不同小写字母表示差异显著(P<0.05); 不同大写字母表示差异
极显著(P<0.01)。Suc: 蔗糖; Gly: 甘油; Man: 甘露醇; DMSO:
二甲基亚砜
Different small letters indicate significant difference (P<0.05);
and different capital letters indicate extremely significant
difference (P<0.01). Suc: Sucrose; Gly: Glycerol; Man: Man-
nitol; DMSO: Dimethyl sulfoxide


表3 化冻温度对怀山药带芽茎段包埋玻璃化超低温保存的影响
Table 3 The effect of thawing temperature on cryopreser-
vation of stem with axillary bud of Dioscorea opposita by
encapsulation-vitrification
Thawing temperature (°C) Survival rate (%)
37 6.93 ± 2.16 cC
39 31.31 ± 7.70 bB
40 48.41 ± 3.70 aA
42 4.41 ± 2.07 cC
不同小写字母表示差异显著(P<0.05); 不同大写字母表示差异
极显著(P<0.01)
Different small letters indicate significant difference (P<0.05);
and different capital letters indicate extremely significant
difference (P<0.01)
表4 不同基因型对怀山药带芽茎段包埋玻璃化超低温保存的
影响
Table 4 The effect of genotype on cryopreservation of stem
with axillary bud of Dioscorea opposita by encapsulation-
vitrification
Genotypes of Dioscorea opposita Survival rate (%)
D. opposita ‘Tiegun’ 64.29 ± 9.52 aA
D. opposita ‘Taigu’ 49.21 ± 3.86 abB
D. opposita ‘Huaiqing No.1’ 13.11 ± 7.92 cD
D. opposita ‘No.B’ 39.81 ± 9.71 bcC
不同小写字母表示差异显著(P<0.05); 不同大写字母表示差异
极显著(P<0.01)
Different small letters indicate significant difference (P<0.05);
and different capital letters indicate extremely significant
difference (P<0.01)



图1 铁棍山药包埋玻璃化超低温保存后植株的再生
(A) 包埋珠的萌发(光照下培养10天); (B) 再生植株(光照下培
养60天)

Figure 1 Regeneration of stems with one axillary bud from
Dioscorea opposita ‘Tiegun’ after encapsulation-vitrification
cryopreservation
(A) Buding of the beads after cryopreserved by encapsula-
tion-vitrification (cultured for 10 d under light); (B) Regener-
ated plantlets (cultured for 60 d under light)

2.4 基因型对超低温保存的影响
不同基因型怀山药经包埋玻璃化超低温保存后均能
获得再生植株, 但成活率因基因型而异(表4), 且不同
基因型之间差异显著。铁棍山药的成活率最高, 达
64.29%; 怀庆1号山药的成活率最低, 仅13.11%。图
1显示超低温保存后的铁棍山药带芽茎段在再生培养
基上的萌发(图1A)和再生植株的形成(图1B)。
2.5 讨论
低温锻炼时间对包埋玻璃化超低温保存后材料的成
382 植物学报 45(3) 2010
活率有重要影响。在苹果茎尖超低温保存中发现, 随
着低温锻炼时间的延长, 成活率增加, 但4周之后成
活率基本保持不变(刘云国和王晓云, 2002)。本研究
也发现随着低温锻炼时间的延长, 怀山药带芽茎段包
埋玻璃化超低温保存后的成活率也逐渐升高, 7天时
成活率达到最高, 之后基本保持不变。这可能与低温
锻炼提高了植物体内脯氨酸和多胺的含量以及胞液
的渗透势, 从而增加了植物的抗冻性有关。
装载时用较低浓度的玻璃化保护剂浸润细胞, 可
促进玻璃化保护剂的渗透效果, 并能防止将细胞直接
投入高浓度的玻璃化保护剂时造成的渗透伤害。但装
载液的成分和浓度因植物材料而异。例如铁皮石斛的
类原球茎包埋玻璃化超低温保存时用MS+1 mol·L–1
Suc+2 mol·L–1 Gly作为其装载液 (Yin and Hong,
2009); 悬钩子茎尖包埋玻璃化超低温保存中选用
MS+0.8 mol·L–1 Suc+2 mol·L–1 Gly作为其装载液
(Wang et al., 2005)。本实验以MS+0.2 mol·L–1
Suc+2 mol·L–1 Gly+50 g·L–1 DMSO作为装载液, 可
极显著提高材料的成活率。
化冻方式是超低温保存技术的关键, 贮藏于液氮
中的样品, 缓慢升温时细胞内会再次结冰, 其温度危
险区域大概在–50–10°C。因此, 在解冻时须迅速通过
此温度区域, 避免细胞再次结冰而造成伤害。长春花
(Catharanthus roseus)胚性悬浮细胞超低温保存后
在37°C化冻1.5分钟效果最好(Fatima et al., 2009)。
塞尔维亚云杉(Picea omorika)胚性组织超低温保存
后在42°C化冻2分钟成活率达到最高 (Hazubska-
Przyby et al., 2010)。本研究结果表明, 材料的成活
率随化冻温度的升高而增高, 当化冻温度为40°C时,
成活率最高。
超低温保存后材料的成活率因基因型而异。王子
成和邓秀新(2002)在对柑橘(Citrus sinensis) 3个基
因型的原生质体进行玻璃化超低温保存时发现, 不同
基因型之间成活率有一定的差异。本研究也发现, 不
同基因型的怀山药包埋玻璃化超低温保存后的成活
率存在显著差异。这种差异可能与不同品种取材的生
长状况有关, 也可能与材料的生理特性不同有关。
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Cryopreservation and Plantlet Regeneration of Germplasm Re-
sources of Dioscorea opposita by Encapsulation-vitrification
Haibing Li1, Na Zhou1, Jiao Zhao1, Xiang Li2, Qiuyan Feng1, Xiting Zhao1, 3, Mingjun Li1, 3*
1College of Life Science, Henan Normal University, Xinxiang 453007, China
2 College of Physical Education, Henan Normal University, Xinxiang 453007, China
3Engineering Technology Research Center of Nursing and Utilization of Genuine Chinese Crude Drugs, University of Henan
Province, Xinxiang 453007, China
Abstract We studied the cryopreservation of germplasm resources of Dioscorea opposita Thunb. by encapsula-
tion-vitrification. D. opposita plantlets of different cultivars were cold-hardened for 1 week at low temperature, then stems
with one axillary bud were excised and pre-cultured at low temperature for 3 days. Stems with axillary buds suspended in
Murishige and Skoog (MS) inorganic medium supplemented with 3% Na-alginate were placed in MS inorganic medium
supplemented with 0.5 mol·L–1 CaCl2 solution. Beads were loaded with MS medium co-mixed with 0.2 mol·L–1 sucrose, 2
mol·L–1 glycerol and 50 g·L–1 dimethyl sulfoxide (DMSO) for 60 min at 0°C, then were dehydrated with a highly concen-
trated vitrification solution (30% glycerol+ 15% ethylene glycol+10% DMSO+ 15% polyethylene glycol+0.4 mol·L–1 su-
crose) for 60 min at 0°C and plunged into liquid nitrogen quickly. After 24 hours, the beads were rapidly thawed in a water
bath at 40°C for 1–3 min. The beads were washed twice with MS medium supplemented with 0.5 mol·L–1 sucrose, then
transferred to regeneration medium (MS+2 mg·L–1 KT +0.02 mg·L–1 NAA +3% sucrose+0.5% agar). Stems with one axil-
lary bud could lead to regenerated plantlets with regeneration culture, but the survival rates of cultivars differed: 64.29%,
49.21%, 13.11% and 39.81% for D. opposita ‘Tiegun’, D. opposita ‘Taigu’, D. opposita ‘Huaiqing No.1’ and D. opposita
‘No.B’, respectively.
Key words cryopreservation, Dioscorea opposita, encapsulation-vitrification, regenerated plantlets
Li HB, Zhou N, Zhao J, Li X, Feng QY, Zhao XT, Li MJ (2010). Cryopreservation and plantlet regeneration of germ-
plasm resources of Dioscorea opposita by encapsulation-vitrification. Chin Bull Bot 45, 379–383.
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* Author for correspondence. E-mail: limingjun2002@263.net
(责任编辑: 白羽红)