全 文 ：植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2014, 49 (2): 167–172, www.chinbullbotany.com
doi: 10.3724/SP.J.1259.2014.00167
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收稿日期: 2013-10-09; 接受日期: 2013-12-11
基金项目: 广东省科技攻关项目 (No.2004B33001018)
* 通讯作者。E-mail: wangxj@scnu.edu.cn
红厚壳茎段丛生芽诱导与植株再生
许德成, 王小菁*
华南师范大学生命科学学院, 广东省植物发育生物工程重点实验室, 广州 510631
摘要 红厚壳(Calophyllum inophyllum)为藤黄科红厚壳属多年生木本植物, 有很高的药用价值。该研究以红厚壳带节茎段
为外植体, 探讨生长调节剂对腋芽萌发及丛生芽诱导、伸长和试管苗生根的影响。研究结果表明, 外植体腋芽萌发和丛生
芽诱导效果最好的培养基是MS+NAA1.0+TDZ0.5, 在此条件下培养21天后, 转入添加0.5 g·L–1活性炭且无生长调节剂的MS
培养基, 可有效促进不定芽的伸长。将带不定芽的外植体先在附加1.0 mg·L–1NAA的1/2MS培养基上进行生根诱导4周, 之
后转入附加1.0 g·L–1活性炭的无激素培养基进行根的伸长培养, 这样的两步生根法能有效促进红厚壳生根。
关键词 丛生芽, 诱导与伸长, 红厚壳, 两步生根法
许德成, 王小菁 (2014). 红厚壳茎段丛生芽诱导与植株再生. 植物学报 49, 167–172.
红厚壳 (Calophyllum inophyllum)又名海棠果 ,
为藤黄科(Guttiferae)红厚壳属(Calophyllum)多年生
木本植物, 在我国海南岛以及东南亚、印度和非洲等
热带地区均有分布, 具有很高的药用价值和经济价值
(陶忠良等, 2003; Cechinel Filho et al., 2009)。在我
国民间, 红厚壳被用作治疗眼病、外伤出血、风湿骨
痛和跌打损伤(梅文莉等, 2006)。从红厚壳中提取的
海棠果素(calophyllolide)属于香豆素类化合物, 具有
抗炎作用, 还能降低毛细血管的通透性, 可保护毛细
血管; 香豆素类化合物Calanolide A、Calanolide B及
其次生代谢物 inophylloms能够抑制HIV逆转录酶
(HIV reverse transcriptase, HIV-RT)活性, 具有抗
HIV的功能(阳辛凤等, 2001; Itoigawa et al., 2001;
纳智, 2005; Malarvizhi and Ramakrishnan, 2011;
Tsai et al., 2012)。在国际上, 红厚壳深加工产品种类
很多, 经济效益较高。如红厚壳油脂中的主要脂肪酸
是亚油酸(约占32.5%), 精炼后可食用, 也可用于制
皂、润滑油和润发油, 还可提炼出环氧十八酸丁酯和
聚氯乙烯塑料增塑剂等(纳智, 2005; Pawar et al.,
2011)。从红厚壳中提取的芳香油是一种名贵香料,
经济效益很高。红厚壳木材纹理交错、结构细密、质
地坚硬、不易霉变、耐磨损及海水侵蚀, 是制造船只、
高级家具、枕木、桥梁和农具的理想材料(阳辛凤等,
2001)。
目前, 红厚壳大都处于野生或半野生状态, 产量
低且株间差异大, 依靠野生的红厚壳已远远不能满足
市场及研究的需要。红厚壳繁殖以种子萌发为主, 繁
殖系数低, 尚未见红厚壳组织培养的报道。利用现代
生物技术进行红厚壳快速繁殖将是解决问题的方法之
一。本研究以红厚壳带节茎段为材料, 进行丛生芽诱
导和植株再生, 为保护、开发和利用红厚壳资源提供
基础, 具有潜在的应用前景。
1 材料
本实验以采自海南省海口市琼山区龙塘镇的红厚壳
(Calophyllum inophyllum L.)种子为材料, 无菌条件
下萌发后取带节茎段作为外植体。
2 培养基成分与培养条件
2.1 丛生芽诱导
在无菌条件下, 取萌发20天的无菌苗上1 cm的带节
茎段, 接种在以MS为基本培养基, 附加6-苄氨基嘌
呤(6-benzylaminopurine, 6-BA)、萘乙酸(1-naphtha-
leneacetic acid, NAA)和噻二唑苯基脲(thidiazuron,
TDZ)三种不同浓度生长调节剂的诱导腋芽萌发的培
养基上, 采用3因素4水平正交实验方案(表1)。在腋芽
·技术方法·
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表1 不同浓度的NAA、6-BA和TDZ对红厚壳腋芽萌发和伸长的影响
Table 1 Axillary bud propagation and elongation of Calophyllum inophyllum on the medium containing different concentrations
of NAA, 6-BA and TDZ
Medium* Multiple shoot clumps (%) Elongating shoots (%) Abnormal shoots (%)
MS+NAA1.0+TDZ0.5 10.0 65.0 15.0
MS+NAA1.0+6-BA2.0+TDZ0.2 14.8 44.4 11.1
MS+NAA0.25+6-BA4.0+TDZ0.5 16.7 30.0 10.0
MS+NAA0.5+6-BA6.0+TDZ0.1 30.8 26.9 11.5
MS+6-BA2.0+TDZ0.1 40.0 25.0 35.0
MS+NAA0.25+TDZ0.1 0 25.0 0
MS+NAA0.25+6-BA2.0 25.0 25.0 0
MS+NAA0.5+6-BA4.0 35.0 20.0 0
MS+NAA1.0+6-BA4.0+TDZ0.1 24.0 12.0 28.0
MS+NAA0.5+TDZ0.2 20.0 10.0 0
MS+6-BA4.0+TDZ0.2 15.0 10.0 40.0
MS+NAA1.0+6-BA6.0 34.8 8.7 0
MS+NAA0.25+6-BA6.0+TDZ0.2 50.0 5.0 10.0
MS+NAA0.5+6-BA2.0+TDZ0.5 10.0 5.0 20.0
MS 0 0 0
MS+6-BA6.0+TDZ0.5 7.7 0 10.0
*下标为浓度(单位: mg·L–1)。NAA: 萘乙酸; TDZ: 噻二唑苯基脲; 6-BA: 6-苄氨基嘌呤
*Subscript indicates the concentration (unit: mg·L–1). NAA: 1-naphthaleneacetic acid; TDZ: Thidiazuron; 6-BA: 6-benzylaminopurine


诱导培养基上培养21天后, 转入不含生长调节剂的
MS培养基上培养。所有培养基的pH值均为5.8–6.0,
培养温度为(25±0.5)°C, 以白色荧光灯作为光源, 光
照周期为12小时光照 /12小时黑暗 , 光照强度为25
μmol·m–2·s–1。每个处理至少接种20个外植体, 35天
后统计多芽率(多芽率=诱导出多芽的外植体数/外植
体总数×100%)、伸长芽率(伸长芽率=伸长芽数/外植
体总数×100%)和畸形芽率(畸形芽率=畸形芽数/外植
体总数×100%)。
研究活性炭对红厚壳腋芽生长的影响时, 将带节
茎段接种到上述方法筛选出的合适生长调节剂配比
的培养基上; 培养21天后分别转入附加0.5 g·L–1活性
炭的MS培养基中; 继续培养19天后统计伸长芽率和
畸形芽率。每个处理至少接种20个外植体。
2.2 两步生根法生根
切取2 cm左右的不定芽, 先在附加NAA的1/2MS培
养基上诱导生根4周; 然后将已诱导生根的芽转入附
加活性炭的1/2 MS培养基中, 4周后观察生根效果。选
取根系良好的红厚壳组培苗, 在培养室内逐步打开瓶
盖; 完全打开瓶盖后移栽到基质中, 用塑料薄膜覆
盖; 第2周逐渐打开薄膜, 并注意保持基质湿度。
3 结果
3.1 生长调节剂对诱导腋芽萌发和伸长的影响
将红厚壳带节茎段接种到腋芽诱导培养基上, 经过
35天培养后统计结果(表1)。在无生长调节剂的MS培
养基上的外植体未见腋芽萌发; 培养在含有6-BA、
TDZ和NAA培养基上的外植体约1周后腋芽萌发, 萌
发率达100%, 同时外植体基部开始膨大, 并有褐色
物质渗透到培养基中, 之后腋芽逐渐形成丛生芽, 每
个外植体平均有4个丛生芽。本文将形成5个以上芽的
丛生芽统计为多芽(multiple shoot clumps); 长度达
到1 cm以上的正常芽称为伸长芽(elongating shoots)
(图1B); 叶片卷曲、狭长且茎节极度缩短等形态发生
异常变化的芽称为畸形芽(abnormal shoots)(图1C)。
从方差分析结果(表2)可以看出, 实验所安排的3个因
素对红厚壳诱导多芽率的影响无显著差异, NAA、
6-BA和TDZ三种生长调节剂对诱导多芽率的影响以
6-BA为最大, 诱导多芽率高的培养基都含有较高浓
度的6-BA(6.0或4.0 mg·L–1), 说明6-BA能促进红厚
许德成等: 红厚壳茎段丛生芽诱导与植株再生 169


图1 红厚壳茎段丛生芽的诱导和生根
(A) 带节茎段外植体; (B) 丛生芽; (C) 畸形芽; (D) 在附加NAA的培养基上生根的试管苗; (E) 两步法生根的试管苗; (F) 移栽成活
的植株

Figure 1 Axillary bud propagation and rooting from stem segment explants in Calophyllum inophyllum
(A) Explant of the stem segments with a node; (B) Multiple shoot clumps; (C) Abnormal shoots; (D) Plantlet with the root induced
by NAA; (E) Plantlet with two-step induced roots; (F) Transplanted seedling


壳不定芽的诱导。在培养基中附加NAA能有效促进红
厚壳不定芽的伸长生长。6-BA和TDZ可能会导致畸形
芽的发生。不同浓度的6-BA、TDZ和NAA组合对诱导
红厚壳腋芽萌发的效应不同(表1)。在16个处理中以
MS+NAA1.0+TDZ0.5组合的萌发效果较好, 尽管多芽
率只有10%, 但伸长芽率最高为65%。在我们的实验
中, 能够伸长的芽最终才能正常生长并生根。木本植
物植株再生比较好的方式是不通过愈伤组织而直接
诱导丛生芽, 以保证母体的遗传特性得以保持。而诱
导丛生芽通常采用合适的细胞分裂素与生长素比例
(Husain et al., 2007; Vengadesan and Pijut, 2009)。
3.2 活性炭对腋芽伸长的影响
活性炭是植物组织培养中一种常用的添加物, 由于在
腋芽萌发和伸长时会出现褐色分泌物, 因此将红厚壳
外植体先接种到MS+NAA1.0+TDZ0.5培养基上, 培养
170 植物学报 49(2) 2014
表2 NAA、6-BA和TDZ对红厚壳诱导多芽率、伸长芽率和畸形芽率的方差分析
Table 2 The variance analysis of axillary bud propagation, elongation and abnormal shoots of Calophyllum inophyllum on the
medium containing different concentrations of NAA, 6-BA and TDZ
Variation
source
Sum of
squares
Degree of
freedom
Mean square F-value Significance
level
Multiple shoot clumps rate NAA 64.56 2 21.68
6-BA 383.85 3 135.02 1.90 0.17
TDZ 377.03 3 126.61 2.01 0.16
Error 2 363.63 33 71.63
All 6 898.57
Elongating shoots rate NAA 1 832.41 3 608.22 4.19 0.03
6-BA 212.86 3 67.02 0.47 0.76
TDZ 93.07 3 32.74 0.20 0.98
Error 2 336.54 17 156.93
All 7 302.32
Abnormal shoots rate NAA 82.37 3 27.34 0.35 0.88
6-BA 356.20 3 112.16 1.46 0.32
TDZ 140.73 3 49.50 0.56 0.71
1 269.00 17 85.23 Error
All 3 496.29

NAA、6-BA和TDZ同表1。NAA, 6-BA and TDZ see Table 1.

21天后再分别转入添加或不添加0.5 g·L–1活性炭的
MS培养基进行继代培养。结果(图2)表明, 继代培养
基中添加活性炭对红厚壳的芽伸长有显著促进作用,
伸长芽率明显增高, 达到83.3%; 而不含活性炭的培
养基伸长芽率仅为60%; 添加活性炭对畸形芽率则无
明显影响。
3.3 试管苗生根
生根实验结果表明, 试管苗在1/2MS附加NAA(0.5–2
mg·L–1)的培养基上生长4周后, 可以诱导生根1–2个,
生根率为86.7%, 但根短而粗且基部膨大(图1D), 移
栽后无法成活。无生长调节剂的1/2MS培养基加入
1.0–2.0 g·L–1活性炭也可诱导生根, 生根率为84.6%,
根细长且生根速度慢, 培养8周后才开始出根, 12周
后才可移栽。我们采用两步生根法, 即先在附加1.0
mg·L–1NAA的1/2MS培养基上诱导4周, 之后转接到
附加1.0 g·L–1活性炭的MS培养基中培养, 第8周试管
苗具有正常可移栽的根(图1E), 带根试管苗移栽后可
正常成活(图1F), 移栽成活率达到86.0%。因此两步
法与活性炭培养的一步法相比加快了根的生长且效
果好。


图2 活性炭对红厚壳不定芽伸长的影响

Figure 2 The effect of active carbon on the shoot elonga-
tion of Calophyllum inophyllum

4 结论
木本植物器官发生过程中, 细胞分裂素和生长素对芽
的诱导和生长发育均起着重要作用。本实验设计的各
种浓度的细胞分裂素(6-BA、TDZ)与生长素(NAA)组
合都能诱导红厚壳腋芽萌发, 诱导效果最好的组合是
MS+NAA1.0+TDZ0.5。TDZ具有极高的细胞分裂素活
许德成等: 红厚壳茎段丛生芽诱导与植株再生 171
性。Nair和Seeni(2003)以红厚壳以及Ahmad和Anis
(2007)以荆条(Vitex negundo)为材料的研究表明, 低
浓度TDZ能有效促进不定芽的分化与生长。Ahmad
和Anis(2007)、Husain等(2007)以及Dhavala和Ra-
thore(2010)则认为, TDZ虽然可有效促进不定芽分
化, 但是培养时间过长会导致形成簇生芽而不能伸长
生长, 不同植物所需的浓度不同。6-BA是植物组织培
养常用的细胞分裂素, 高浓度6-BA会抑制一些木本
植物不定芽的生长。张存旭等(2004)研究表明, 低浓
度的6-BA能促进栓皮栎(Quercus variabilis)芽的分
化, 提高浓度则产生丛状芽, 并抑制节间伸长。在本
实验中, 不同浓度的细胞分裂素(TDZ和6-BA)与生长
素(NAA)组合能有效诱导腋芽萌发, 使外植体基部出
现膨大, 并且不定芽的生长明显受到抑制形成簇生
芽。为了解决这一问题, 我们将红厚壳带节茎段首先
在附加TDZ、6-BA和NAA的MS培养基上诱导出不定
芽, 然后转入附加活性炭的MS培养基上进行伸长生
长, 取得了较好的效果, 这种培养方式在印度紫檀
(Pterocarpus marsupium)和白花酸藤(Embelia rib-
es)中也有报道(Husain et al., 2007; Dhavala and
Rathore, 2010)。
木本植物生根是离体培养的关键步骤(Siddique
and Anis, 2009)。张存旭等(2004)认为, 单独使用
NAA生根率低, 茎段基部愈伤组织大, 且多为愈伤
根, 这种从愈伤组织处产生的根系难以与分化芽的输
导系统相通, 其吸收功能比皮层直接生根弱, 不利于
芽苗的生长, 移栽时容易受损伤, 也不利于移栽。在
我们的实验中, 采取两步生根法, 即先在附加NAA的
培养基上进行根的发生, 然后转接到附加活性炭的培
养基上进行根的伸长生长, 有效促进了红厚壳生根。
这种方法在香合欢(Albizia odoratissima)和山楂(Cra-
taegus pinnatifida var. major)中也有报道 (Rajes-
wari and Paliwal, 2006; Dai et al., 2007)。此方法成
功的原因可能是根原基的形成需要生长素的刺激, 而
在根原基形成后再给予高浓度的生长素反而起到抑
制生长的作用。
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Axillary Bud Propagation and Regeneration from Stem Segment
Explants in Calophyllum inophyllum
Decheng Xu, Xiaojing Wang*
Guangdong Provincial Key Laboratory of Biotechnology for Plant Development, School of Life Sciences, South China Normal
University, Guangzhou 510631, China
Abstract Calophyllum inophyllum is an important medicinal tree belonging to the Guttiferae family. We used stem
segments with a node as explants for bud propagation and plantlet regeneration and examined the effects of plant growth
regulators on axillary bud germination, propagation, bud elongation and rooting from adventitious buds. The suitable me-
dium for axillary bud germination and propagation was MS supplemented with NAA1.0 and TDZ0.5. Culture of explants on
this medium for 21 days and then transfer to hormone-free medium supplied with 0.5 g·L–1 active carbon promoted the
elongation of adventitious buds. We developed a two-step method for rooting. The explants with adventitious buds were
first cultured on 1/2 MS medium with 1 mg·L–1NAA for 4 weeks, then on hormone-free medium supplied with 1.0 g·L–1
active carbon. This two-step rooting method accelerated rooting efficiently.
Key words axillary bud, propagation and regeneration, Calophyllum inophyllum, two-step rooting
Xu DC, Wang XJ (2014). Axillary bud propagation and regeneration from stem segment explants in Calophyllum ino-
phyllum. Chin Bull Bot 49, 167–172.
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* Author for correspondence. E-mail: wangxj@scnu.edu.cn
(责任编辑: 孙冬花)