全 文 ：植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2010, 45 (4): 466–471, www.chinbullbotany.com
doi: 10.3969/j.issn.1674-3466.2010.04.010

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收稿日期: 2010-01-18; 接受日期: 2010-03-25
* 通讯作者。E-mail: xiuew@njau.edu.cn
普通小麦品种Alondras遗传转化体系的建立
李明浩1, 2, 陈炜1, 邢莉萍1, 肖进1, 王海燕1, 曹爱忠1, 王秀娥1*
1 南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室, 南京 210095
2 中国科学院合肥物质科学研究院, 合肥 230031
摘要 小麦(Triticum aestivum)幼胚愈伤组织的诱导和分化再生有高度依赖基因型特征。为了建立和优化Alondra’s的高效
再生及遗传转化体系, 为小麦遗传转化提供更多的受体基因型, 以Alondra’s的幼胚为外植体, 研究了培养基种类、不同激
素配比等对其幼胚愈伤组织诱导及再生的影响。结果表明, 在使用N6培养基时, 添加3 mg·L–1的2,4-D并附加1 000 mg·L–1
的CH对愈伤组织的诱导效果较好; 添加4 mg·L–1的ZT、不附加IAA对愈伤组织的分化效果最好。通过构建植物表达载体
pCAMBIA1301-220.6, 利用基因枪法将HYG基因导入Alondra’s幼胚愈伤组织中, 以建立Alondra’s的高效遗传转化体系。
结果在含100 mg·L–1潮霉素的选择培养基上进行筛选、分化, 获得了30棵抗性植株。经PCR检测, 其中5株为阳性转基因植
株, 转化率为0.5%。Alondras遗传转化体系的建立丰富了小麦遗传转化的基因型, 为小麦品种的转基因改良和在不同背景
下研究基因的功能奠定了良好的基础。
关键词 愈伤诱导, 幼胚, 高效再生, 小麦
李明浩, 陈炜, 邢莉萍, 肖进, 王海燕, 曹爱忠, 王秀娥 (2010). 普通小麦品种Alondras遗传转化体系的建立. 植物学报
45, 466–471.
小麦(Triticum aestivum)赤霉病是我国小麦主产
区最主要的病害之一, 特别是在长江中下游一些多雨
地区, 更是赤霉病的高发区。它不仅可以造成小麦大
面积的严重减产, 而且其病原菌可以产生一种毒素,
严重危害人畜健康。培育抗赤霉病的小麦品种, 可直
接防控病害, 是最经济的一种措施(陈佩度等, 1996)。
分离、克隆小麦抗赤霉病相关基因, 阐明小麦抗赤霉
病的分子机制对于小麦抗赤霉病的遗传改良具有重
要意义。
近年来, 利用组织培养和基因工程技术改良小麦
品种已经取得了较大进展(Vasil et al., 1992; 吴丽芳
等, 2000; 王永勤等, 2002)。以小麦幼胚、幼穗作为
外植体进行组织培养, 不仅愈伤组织诱导率较高, 而
且分化成苗能力也较强(乔亚科等, 2002; 宋国琦等,
2003; 覃建兵等, 2005)。小麦幼胚培养植株再生过程
往往表现出明显的基因型差异(林毅等, 2003)。基因
型、培养基及培养基和基因型的相互作用对小麦愈伤
组织的形成及植株再生具有重要影响 (伍碧华等 ,
2001; 余桂荣等, 2003)。不同的培养基与激素配比对
小麦幼胚愈伤组织形成及再生也有着很大的影响(安
海龙等, 2002)。目前的转基因小麦一般仅局限于扬麦
158、Bobwhite等品种, 因此建立适于不同基因型小
麦幼胚高效愈伤诱导和植株再生体系对于利用基因
工程研究基因功能和遗传改良有重要意义。
小麦种质资源Alondras由墨西哥国际玉米(Zea
mays)、小麦改良中心选育, 具有农艺性状较好、株
型较紧凑、茎秆粗壮不易倒伏、结实多且籽粒饱满, 以
及对锈病和白粉病有较好的抗性等优点, 但重感赤霉
病, 在赤霉病抗性遗传研究和抗性QTL定位群体中常
被用作感病亲本。本实验以Alondras的幼胚为外植
体, 探讨在不同培养基种类及激素水平下其愈伤组织
的诱导和再生情况, 阐明上述条件对愈伤诱导及分化
的影响, 并建立高效愈伤诱导和再生体系。在此基础
上, 以Alondra’s为受体进行遗传转化体系的研究, 为
进一步利用基因工程进行抗赤霉病遗传改良奠定
基础。
·技术方法·
李明浩等: 普通小麦品种 Alondras 遗传转化体系的建立 467
1 材料与方法
1.1 实验材料
实验材料为普通小麦 (Triticum aestivum L.)品种
Alondras, 种植于南京农业大学江浦试验基地。基因
枪 遗 传 转 化 采 用 植 物 表 达 载 体 pCAMBIA1301
-220.6(图1)。该表达载体的植物选择标记基因为潮霉
素抗性基因HYG。
1.2 培养基成分
诱导愈伤以MSB(B5有机)、NB(B5有机)、N63种培养
基为基本培养基 , 添加2,4-D(2,4-dichlor-phenoxy
acetic acid)、6-BA(6-benzylaminopurine)、CH (cas-
ein hydrolysate)(表1); 植株再生以MS为基本培养
基, 分别添加玉米素(zeatin, ZT)、吲哚乙酸(indole
acetic acid, IAA)(表2)。pH值均为5.8。
1.3 实验方法
1.3.1 取样和幼胚培养
将实验材料播种于南京农业大学江浦试验基地, 待所
需材料开花时对其进行挂牌。开花后12–15天、幼胚
大小为1 mm时取穗。在实验室将种子剥出, 用70%
乙醇表面消毒1分钟, 0.1%HgCl2浸泡消毒8分钟, 然



图1 载体pCAMBIA1301-220.6结构图

Figure 1 The vector pCAMBIA1301-220.6



表1 诱导愈伤L9(34)正交实验的因素和水平
Table 1 Factors and levels of L9(34) orthogonal test for
callus induction
表2 植株再生实验设计的各因素和水平
Table 2 Factors and levels designed for regeneration test
ZT: 玉米素; IAA: 吲哚乙酸
ZT: zeatin; IAA: indole acetic acid


后用无菌水冲洗4–5次。用解剖刀挖出幼胚盾片, 朝
上放置在诱导培养基上, 25°C黑暗培养。每个处理重
复3次。

1.3.2 基因枪法转化Alondra’s幼胚
取预培养7天的Alondra’s的幼胚愈伤组织作为受体进
行遗传转化, 轰击前在高渗培养基上预处理4–5小时,
轰击后在高渗培养基上继续培养16小时, 轰击参数
依照王华忠等(2007)的方法进行设置。将轰击后的愈
伤组织转移至恢复培养基上暗培养2周, 再将其转移
至含有潮霉素的筛选培养基上, 筛选培养2周。然后
将具有抗性的愈伤组织转移到分化培养基中进行分
化, 待分化芽长至2–4 cm时将其转移至生根培养基
中。至再生苗长约8 cm、根系较健壮时, 即可开管炼
苗1–2天, 最后洗去根系携带的培养基残渣便可移栽
入盆钵。

1.3.3 转基因植株的分子鉴定
采用SDS法分别提取转化植株和未转化植株幼嫩叶
片的基因组DNA。PCR反应扩增HYG基因片段的引
物 为 : hyg-F, 5’-ATGTTGGCGACCTCGTATT-3’;
hyg-R, 5’- ATCGTTATGTTTATCGGCACT-3’。PCR
扩增体系为20 μL。反应程序为: 94°C变性3分钟;
94°C变性1分钟, 56°C退火45秒, 72°C延伸90秒, 33
个循环; 72°C延伸10分钟。取PCR产物10 μL在1%琼
脂糖凝胶上进行电泳检测。
1.4 数据处理
数据处理和作图均采用SPSS17.0软件。利用以下公
式计算愈伤出愈率和绿点率。
愈伤出愈率(%)=(形成愈伤数/接种胚数)×100%
绿点率(%)=(绿点数/愈伤数)×100
Factor
Level
ZT (mg·L–1) IAA(mg·L–1)
1 2 0
2 4 0.5
3 6 1
Factor
Level
Medium
2,4-D
(mg·L–1)
6-BA
(mg·L–1)
CH
(mg·L–1)
1 MSB 2 0 0
2 NB 3 0.5 500
3 N6 4 1 1 000
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表3 不同培养基及激素配比对Alondras幼胚愈伤组织诱导的影响
Table 3 Effect of different media, hormone and CH constitution on the callus induction of immature embryo of Alondra’s
Treatment
No.
Medium 2,4-D
(mg·L–1)
6-BA
(mg·L–1)
CH
(mg·L–1)
Percentage of callus
induction (%)*
Quality of
callus**
1 MSB 2 0 0 91a ++
2 MSB 3 0.5 500 91ab +
3 MSB 4 1 1 000 95abc +
7 N6 2 1 500 95bc +++
4 NB 2 0.5 1 000 96cd ++
9 N6 4 0.5 0 97cd +++
6 NB 4 0 500 98cd ++++
5 NB 3 1 0 100d ++
8 N6 3 0 1 000 100d ++++
* 不同小写字母表示处理间差异显著; ** 愈伤质量: ++++ 最好; +++ 较好; ++ 一般; + 最差。
* Different small letters indicate significant diffence; ** Callus quality: ++++ Best; +++ Better; ++Good; + Worst.


2 结果与讨论
2.1 不同培养基成分对Alondras愈伤组织诱导
的影响
由表3可以看出, 虽然不同处理愈伤组织的诱导率均
达到91%以上, 但是方差分析结果(表4)表明, 不同处
理间Alondra’s愈伤组织诱导率差异达极显著水平。不
同处理形成愈伤组织的质量差异也较大, 而对愈伤组
织的评价不仅仅局限于高诱导率, 最为关键的是愈伤
的质量。由表3可以看出, 应用处理6或处理8的培养
体系, 愈伤诱导率高, 而且诱导出的愈伤组织较为致
密, 颜色淡黄(图2A), 不论是出愈率还是愈伤的质量
都处于最优水平; 处理2不仅愈伤的诱导率最低, 而
且形成的愈伤组织质量较差, 形成的愈伤较小而且水
渍化严重(图2B)。
2.2 不同培养基成分对Alondras分化再生的影响
将在MS培养基诱导出的生长状况较为一致的愈伤组
织, 接种在不同处理的分化培养基上。结果表明, 不
同激素配比、特别是ZT对愈伤分化再生的影响较大。
当ZT浓度为4 mg·L–1且不添加IAA时, 不论是愈伤组
织形成的绿点数还是其再生芽数均为最高(图3A)。
如图3所示, 不同培养基成分对绿点数的形成及
丛生芽的分化均产生严重的影响。处理6尽管绿点数
较高, 但最终产生的丛生芽数却较少(图3C); 而处理

表4 Alondra’s愈伤组织出愈率实验结果的方差分析
Table 4 The analysis of variance (ANOVA) for callus induc-
tion of Alondra’s
Variation
source
DF Sum of
squares
(SS)
Mean
square
(MS)
F P
Treatment 8 0.025 0.003 5.912 0.001
Error 18 0.010 0.001
Total 26 0.035




图2 不同处理诱导愈伤组织的质量(处理编号同表3)
(A) 处理8; (B) 处理2

Figure 2 The callus quality of different treatments (The
treatment No. see Table 3)
(A) Treatment 8; (B) Treatment 2

2不仅绿点数高, 且丛生芽数最多(图3B)。因为再生植
株是由这些丛生芽分化而来, 所以处理2的分化再生
效果最好。
李明浩等: 普通小麦品种 Alondras 遗传转化体系的建立 469



图3 不同处理的愈伤分化再生情况
(A) 9个处理的愈伤再生状况比较; (B) 处理2再生芽; (C) 处理6再生芽
处理1–9编号同表3。

Figure 3 Comparison of the callus regeneration of different treatments
(A) A column chart showing the regeneration of the 9 treatments; (B) Regenerative bud of treatment 2; (C) Regenerative bud of
treatment 6
Treatment 1–9 No. see Table 3.

2.3 Alondra’s的遗传转化和转基因植株的鉴定
利用基因枪法共转化Alondra’s幼胚愈伤组织约1 000
块。轰击后的愈伤组织经恢复培养后 , 在含100
mg·L–1潮霉素的筛选培养基上进行筛选, 共获得抗性
愈伤组织420个, 抗性愈伤率为42%。将抗性愈伤组
织转移到筛选分化培养基上, 共获得分化芽82个。将

分化芽转移至生根培养基上进行培养, 共获得49棵
抗性再生植株, 再生率为59.8%。待苗长至8 cm左右
时, 开瓶口炼苗2天, 然后移栽至温室花盆中, 移栽
苗成活30株(图4A–E)。

________________________________________________
←
图4 Alondra’s幼胚愈伤的基因枪遗传转化和再生
(A) 幼胚形成的愈伤组织; (B) 抗性愈伤组织筛选; (C) 愈伤组
织分化; (D) 再生植株; (E) 移栽成活的再生植株; (F) 部分转化
植株HYG基因的PCR鉴定。M: DNA分子量标准; 1: H2O对照; 2:
阴性对照(未转基因Alondra’s); 3: 阳性对照(载体质粒); 4–8:
转基因植株。

Figure 4 Transformation of the callus of immature embryo
of Alondra’s by shotgun method and regeneration of trans-
genic plants
(A) Callus from immature embryos: (B) Selection for resistant
callus; (C) Differential culture of the callus; (D) Regenerated
plants; (E) Transplanted plants; (F) PCR analysis for HYG
gene of transgenic plants. M: DL2000 DNA marker; 1: H2O; 2:
Non-transgenic plants of Alondra’s as negative control; 3:
Vector plasmid as positive control; 4–8: Transgenic plants.

470 植物学报 45(4) 2010
分别提取转化植株和未转化植株的基因组DNA,
以质粒为阳性对照、未转化植株为阴性对照, 进行
PCR反应。潮霉素基因用其特异引物hyg-F和hyg-R。
从图4F的电泳结果可以看出, 转基因植株DNA可以
扩增出与质粒DNA相同的特异性条带, 大小为503
bp, 而阴性对照及H2O对照中均没有扩增出特异性条
带, 证明HYG标记基因已成功转入小麦基因组中。
2.4 讨论
研究表明, 小麦幼胚基因型、培养基、激素等是影响
小麦组培特性的最主要因素(Scott et al., 1990; 林毅
等, 2003)。已有研究表明, 不同培养基类型影响小麦
幼胚愈伤的形成及再生分化能力(Mathias, 1990)。本
实验以Alondras幼胚为材料, 分析了不同培养基及
激素配比对Alondras幼胚愈伤诱导及再生分化的影
响, 发现诱导愈伤时不同处理间愈伤组织形成的质量
存在差异。以N6为基本培养基, Alondras愈伤诱导率
及产生的愈伤质量状况均为最好。添加适当浓度的
CH, 对产生的愈伤质量有明显的改善作用。李忠光和
龚明(2006)也发现在MS培养基中添加CH, 可以有效
提高烟草(Nicotiana tabacum)愈伤组织的诱导率, 甚
至可以极大地改善愈伤质量。
本研究还表明, 在相同培养基条件下添加不同激
素对Alondras愈伤组织的分化再生有很大影响。当
ZT浓度为4 mg·L–1且不添加其它激素时, Alondras愈
伤组织的分化效果最好。
本实验室利用本文建立的Alondra’s幼胚愈伤诱
导及高效再生体系进行小麦抗赤霉病相关基因遗传
转化研究, 获得具有潮霉素抗性的再生植株30株, 经
PCR鉴定证实其中5株为阳性植株。下一步我们将利
用该遗传转化体系转化本实验室克隆的抗赤霉病相关
基因, 这将为研究这些基因的功能和作用机理以及今
后进行抗赤霉病转基因育种提供良好的材料。
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李明浩等: 普通小麦品种 Alondras 遗传转化体系的建立 471
Establishment of High-efficiency Genetic Transformation System
for the Wheat Variety Alondras
Minghao Li1, 2, Wei Chen1, Liping Xing1, Jin Xiao1, Haiyan Wang1, Aizhong Cao1, Xiue Wang1*
1National Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095,
China; 2Hefei Institutes of Physical Science, Chinese Academy of Sciences, Hefei 230031, China
Abstract Callus induction and regeneration of wheat is highly genotype dependent. To establish an optimal system for
callus induction, regeneration and highly efficient genetic transformation of the wheat variety Alondra’s, we studied the
effects of culture medium, hormones on the callus induction and plant regeneration of immature embryos. Use of the N6
medium, 3 mg·L–1 2,4-D, together with 1 000 mg·L–1 CH, achieved the best callus induction, and use of 4 mg·L–1 ZT
without indoleacetic acid had the highest regeneration frequency. The vector pCAMBIA1301-220.6 was constructed and
transformed into Alondra’s by particle bombardment. Thirty hygromycin-resistant plants were selected by use of 100
mg·L–1 hygromycin and regenerated. Among them, 5 plants were identified to be positive by PCR, with transformation
frequency of 0.5%. This system has further enriched the wheat variety Alondra’s for transformation and will be helpful for
both genetic improvement and gene function analysis in various backgrounds by genetic transformation.
Key words callus induction, immature embryo, regeneration, Triticum aestivum
Li MH, Chen W, Xing LP, Xiao J, Wang HY, Cao AZ, Wang XE (2010). Establishment of high-efficiency genetic trans-
formation system for the wheat variety Alondras. Chin Bull Bot 45, 466–471.
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* Author for correspondence. E-mail: xiuew@njau.edu.cn
(责任编辑: 白羽红)