全 文 ：植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2016, 51 (3): 387–395, www.chinbullbotany.com
doi: 10.11983/CBB15113
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收稿日期: 2015-06-18; 接受日期: 2015-11-01
基金项目: 中央高校基本科研业务费专项资金(No.BLX2013019)和国家自然科学基金(No.31400210)
* 通讯作者。E-mail: xiaojianwei@bjfu.edu.cn
泛素介导的植物膜蛋白转运及其研究方法
苏泊丹, 林金星, 肖建伟*
北京林业大学生物科学与技术学院, 北京 100083
摘要 泛素(Ub)是一类小分子多肽, 可通过赖氨酸残基与靶蛋白结合, 进而决定靶蛋白的去向。泛素分子对靶蛋白进行特
异性修饰的过程称为泛素化。相较于动物和酵母细胞, 植物细胞中泛素介导的蛋白动态循环, 尤其是膜蛋白胞吞动态循环
研究相对滞后。随着生物化学以及显微技术的发展, 人们对泛素介导的植物细胞膜蛋白转运有了新的认识。该文阐述了泛
素及类泛素在蛋白转运中的作用, 总结了泛素化(ubiquitylation)调控膜蛋白转运的分子生物学机制和常用的研究方法, 并
对今后该领域的研究进行了展望。
关键词 膜蛋白转运, 泛素, 泛素化
苏泊丹, 林金星, 肖建伟 (2016). 泛素介导的植物膜蛋白转运及其研究方法. 植物学报 51, 387–395.
生物膜是细胞、细胞器及与环境接界的所有膜结
构的总称, 包括质膜和内膜。质膜作为细胞与外界交
流的窗口, 对维护细胞内环境的相对稳定、同外界环
境进行物质交换以及能量和信息传递等有重要作用。
内膜系统可以将细胞内环境区室化, 保证各种生化反
应所需的特定生理环境。生物膜的功能发挥依赖于膜
蛋白 (membrane proteins)。根据膜蛋白与脂分子
(lipids)的结合方式 , 可分为整合蛋白(integral pro-
tein)、外周蛋白(peripheral protein)和脂锚定蛋白
(lipid-anchored protein)。翻译后修饰对蛋白功能的调
节是必需的, 例如生物体的发育、细胞信号转导以及
蛋白的降解等都需要蛋白的翻译后修饰。这些修饰包
括泛素化(ubiquitylation)、乙酰化(acetylation)及棕榈
酰化(palmitoylation)等。Kölling和Losko等(1997)研
究酵母的泛素化修饰时, 发现泛素化介导的胞吞循
环。在植物细胞中, 无机离子的转运以及膜蛋白的内
化等都是由泛素介导的。最新的研究表明, 泛素化参
与修饰调节植物膜蛋白的转运过程(Barberon et al.,
2011; Lin et al., 2013)。因此, 泛素化修饰在植物膜
蛋白的动态循环中发挥了非常重要的作用。
1 泛素和泛素化
泛素(ubiquitin, Ub)是一段含有76个氨基酸残基的多
肽, 它的主要功能是与靶蛋白共价结合并将其降解
(Goldstein et al., 1975)。泛素化(ubiquitylation)是指
泛素的羧基端在泛素激活酶E1、泛素结合酶E2和泛
素连接酶E3的催化作用下, 与靶蛋白的赖氨酸残基
共价结合的过程(Pickart and Eddins, 2004; Wenzel
et al., 2011)。在泛素化过程中, 泛素连接酶E3可通过
识别和结合特异的靶蛋白序列或降解决定因子
(degron), 从而特异性地调节靶蛋白的降解。主要的
泛素连接酶E3家族可以分为2大类 : RING (really
interesting new gene domain)泛素连接酶和HECT
(homologous to E6-APC terminus domain)泛素连接
酶(Brown et al., 2015)。泛素连接酶E3的活性能被去
泛素化酶(deubiquitinases, DUBs)抑制(Han et al.,
2014)。去泛素化酶能够催化泛素的赖氨酸与异构肽
凹槽处结合, 水解泛素和其底物之间的共价键, 增加
泛素化的灵活性和控制性(Han et al., 2014)。
泛素含有7个赖氨酸位点, 通过不同的连接方式
和构象, 不同的赖氨酸位点可发生不同类型的泛素
化, 一般分为单泛素化(monoubiquitination)、多位点
单泛素化(multiubiquitination)和多聚泛素化(polyubi-
quitination) (Ikeda and Dikic, 2008)。单个的泛素分
子连接到靶蛋白的1个或几个赖氨酸残基上, 称单泛
素化或多位点单泛素化, 而单个的泛素分子重复串联
在1个赖氨酸残基上, 称为多泛素化, 以发生在K48
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或者K63的多泛素化最为常见 (Ikeda and Dikic,
2008)。不同类型的泛素化调控不同的细胞途径, K48
多泛素化修饰的蛋白一般被转运到蛋白酶体降解, 从
而调控蛋白水平; 而K63多泛素化修饰在DNA损伤耐
受、炎症反应、胞吞途径以及核糖体蛋白合成中起重
要作用(Passmore and Barford, 2004; Scott et al.,
2014)。单泛素化则在调节膜蛋白的胞吞、DNA损伤
修复、组蛋白激活以及逆转录病毒出芽中有重要作用
(Mukhopadhyay and Riezman, 2007)。泛素化修饰
参与调控细胞内的许多生命活动, 其中, 关于胞吞作
用、膜蛋白内化信号以及内涵体中蛋白分选的研究最
为广泛(图1) (Scott et al., 2014)。
2 依赖于泛素化修饰的膜蛋白胞吞途径
胞吞作用(endocytosis)是指质膜内陷将所摄取的液
体或颗粒物质包裹, 逐渐成泡, 脂双层融合、断裂,
最后形成细胞内独立小泡的过程(Battey et al., 1999;
Parton and Richards, 2003)。胞吞作用大致分为2类:
1类是Clathrin介导的胞吞途径 (clathrin mediated
endocytosis, CME), 这种途径是迄今为止研究得最
为透彻的1种胞吞作用; 第2类是不依赖Clathrin的胞
吞途径 (nonclathrin mediated endocytosis, NCE)
(Kirkham and Parton, 2005)。Kölling和Losko (1997)
研究酵母的泛素化修饰时, 发现泛素化介导的胞吞。
相对于动物, 植物中泛素化介导的胞吞作用研究较
少, 仅局限于铁与硼等无机元素和激素的转运蛋白,
并且也只发现泛素化在液泡转运过程中起作用
(Barberon et al., 2011; Lin et al., 2013)。直到Martins
等(2015)发现植物中油菜素内酯受体BRI1 (brassi-
nosteroids insensitive 1)的胞吞是由泛素化调控的,
才开启了植物泛素化研究的新篇章。
2.1 泛素化作为膜蛋白内化信号
酵母和动物细胞中都存在K63多泛素化介导的膜蛋白
周转, 如酵母Gap1的周转依赖于K63的多泛素化, 但
在膜上的内化主要通过单泛素化调控(Crapeau et
al., 2014)。1998年, 研究者在研究G蛋白偶联受体(G
protein-coupled receptors, GPCRs)时发现, 泛素除
了介导靶蛋白的降解, 还参与膜蛋白的内化(Terrell
et al., 1998)。Shih等(2000)发现, 作为蛋白内化的信
号分子, 泛素能直接与蛋白的尾部结合以介导蛋白内
化。随后, 在真菌以及动物中都有证据表明单泛素化
能介导膜蛋白的内化(Hicke and Dunn, 2003; Göhre
et al., 2008)。对植物膜蛋白 IRT1 (iron-regulated
transporter 1)和PIN2蛋白的研究证明了植物蛋白内
化同样是由单泛素化修饰起始的, 而多泛素化主要在
囊泡转运和循环上膜过程中起作用(Barberon et al.,
2011; Shin et al., 2013)。因此, 在真核生物中, 单泛
素化和多位点单泛素化在膜蛋白内化过程中以信号
分子的作用调控蛋白的周转(图1)。
膜蛋白的内化机制主要分为2种: 分子伴侣依赖
(chaperone-dependent)的蛋白内化和LID-降解因子
(loop interaction domain-degron)依赖的蛋白内化
(Dores et al., 2012)。在分子伴侣依赖的蛋白内化中,
分子伴侣首先识别需要内化的膜蛋白, 随后被E3泛
素连接酶识别, 发生泛素化(Apaja et al., 2010)。泛素
化的膜蛋白快速发生胞吞, 并通过ESCRT (endoso-
mal sorting complex required for transport)依赖的
MVB (multivesicular body)途径降解。其中, G蛋白偶
联受体内化途径即属于此种途径 (Dores et al.,
2012)。而LID-降解因子依赖的蛋白内化是营养载体
蛋白降解的经典模式(Keener and Babst, 2013)。LID
中含有细胞质环, LID通过氢键与膜蛋白的跨膜域结
合(Weyand et al., 2008), 降解因子能够通过控制蛋
白含量来调节蛋白的功能。当膜蛋白受到非生物胁迫
时, 降解因子发生泛素化, 诱导膜蛋白内化, 随后通
过MVB途径在溶酶体或者液泡中降解 (Ravid and
Hochstrasser, 2008)。
2.2 内涵体中泛素化介导的膜蛋白循环
泛素化的膜蛋白被胞吞作用因子识别, 然后转运至早
期内涵体(Haglund and Dikic, 2012)。在早期内涵体
中, 蛋白有2种分选途径(图1): 通过反面高尔基体网
状结构(trans golgi network, TGN)循环至质膜, 或者
被转运至晚期内涵体中降解(Piper et al., 2014)。虽然
这一过程中的分选机制尚不清楚, 但已有研究表明,
在内涵体中存在泛素化和去泛素化竞争机制, 进而决
定蛋白的去向(Hurley and Stenmark, 2011; Piper et
al., 2014)。
苏泊丹等: 泛素介导的植物膜蛋白转运及其研究方法 389



图1 细胞中泛素介导的蛋白转运
(a)–(d) 泛素化在膜蛋白转运中的作用; (A)–(E) 泛素化在新合成蛋白转运中的作用

Figure 1 Cellular ubiquitin-mediated membrane protein trafficking processes
(a)–(d) Ub-dependent internalization/sorting of membrane protein; (A)–(E) Ub-dependent internalization/sorting of newly syn-
thesized proteins


当泛素化酶活性较高时, 膜蛋白能通过ESCRT
途径降解, ESCRT能使泛素化的膜蛋白进入早期内
涵体中 , 并促进晚期内涵体的形成 (Shields and
Piper, 2011)。ESCRT复合物含有泛素结合结构域
(ubiquitin-binding domains), 能与泛素化的膜蛋白结
合, 并将其分选至管腔内小泡(intraluminal vesicles,
ILVs) (Shields and Piper, 2011)。当泛素化的蛋白进
入ILV后, 泛素从膜蛋白上解离并循环至胞质内再利
用, 而蛋白被转入溶酶体中降解(Amerik et al., 2000;
Luhtala and Odorizzi, 2004)。
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经过ESCRT途径分选后的蛋白, 以及早期内涵
体中待循环上膜的蛋白都可以被分选至反面高尔基
体网状结构(Seaman, 2012)。高尔基体能识别未成熟
及错误折叠的蛋白 , 将其泛素化 (MacGurn et al.,
2012)。泛素化的蛋白与分选受体结合, 随后被转运
至内涵体中(Puertollano and Bonifacino, 2004; Guo
et al., 2014)。在内涵体中, 泛素化的蛋白被分选至
MVB, 最后经过囊泡转运至溶酶体降解。例如酵母中,
错误折叠的Pma1 (plasma membrane ATPase 1)和
Wsc1 (cell wall integrity sensor 1)通过高尔基体分选
至MVB途径最终被降解(Wang et al., 2011)。高尔基
体中折叠正确的蛋白, 通过分选作用被转运至质膜或
者滞留在细胞器中防止降解。
2.3 自噬体中泛素化修饰调节的蛋白质转运
在低养料、非生物胁迫、免疫及炎症反应等不利环境
条件下, 生物通过自噬保证自身的生存(Avila-Ospina
et al., 2014)。自噬是一种能降解自身组分的降解途
径, 其中, 细胞质、大分子以及一些细胞器等都经自
噬泡降解自身组分, 再经溶酶体途径循环利用(Liu
and Bassham, 2012)。自噬体能直接与晚期内涵体以
及溶酶体融合, 随即双层膜结构消失, 降解靶蛋白
(Avila-Ospina et al., 2014)。
自噬一直被认为是一种非选择性的降解途径, 直
到Kirkin等(2009)发现了一种由泛素介导的“选择性
自噬”, 从而揭示了泛素在自噬体蛋白转运中的作用。
因此, 自噬主要有2种途径, 一种是由ATG-8 (auto-
phagy-8)蛋白AIM (ATG-8-interacting motif)识别靶
蛋白并与之结合后, 形成自噬小体(autophagic body)
的自噬途径; 另一种是靶蛋白先发生泛素化, 随后通
过AIM结合 , 形成自噬小体的自噬途径 (Johansen
and Lamark, 2011)。Manzanillo等(2013)进一步证明
了K63以及K27多泛素化修饰在去极化的线粒体选择
性自噬以及在免疫中的重要作用。虽然目前关于植物
细胞自噬机制中泛素化的作用研究已有较大进展, 但
仍有许多机制尚不清楚, 这将成为今后研究的重点。
3 泛素化在新合成蛋白周转过程中的作用
3.1 内质网中泛素调控的蛋白转运
内质网中的调控系统能将不成熟蛋白或者是未完全
折叠的蛋白滞留在内质网中, 以确保只有成熟的、正
确折叠蛋白的精确转运 (Ellgaard and Helenius,
2003)。错误折叠的蛋白通过内质网相关降解途径
(endoplasmic reticulum-associated degradation path-
way, ERAD)转运至细胞质, 并最终通过蛋白酶体降
解(Vembar and Brodsky, 2008; Bagola et al., 2011)
(图1)。ERAD途径是由分子伴侣、调节因子以及泛素
连接酶E3等共同调控的(Fang et al., 2001; Denic et
al., 2006)。附着在内质网膜上的泛素连接酶E3与接
头蛋白Ubx等辅助因子共同作用, 识别错误折叠的蛋
白质, 进而转运至内质网外膜的胞质溶胶面。在内质
网外膜处, 泛素连接酶E3将靶蛋白泛素化, 在AAA
ATP酶和Cdc48蛋白的共同作用下, 靶蛋白被转运至
26S蛋白酶体降解(Hirsch et al., 2009; Lemus and
Goder, 2014)。
植物细胞中, 虽然ERAD的具体机制还不清楚,
但已有研究表明, 油菜素内酯信号途径与ERAD途径
相关(Liu et al., 2011)。HRD3A和HRD1属于植物系
统中ERAD途径的组分, 它们对BRI1蛋白的降解起重
要作用(Liu et al., 2011; Su et al., 2011)。随后, Cui
等(2012)也在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中证实了
泛素连接酶UBC32能通过ERAD途径响应BR信号。
在内质网蛋白转运途径中, 虽然ERAD的调控作用已
被广泛研究, 但作为蛋白转运调节因子其功能还不是
很清楚。有研究表明, ERAD可能是通过降解内质网
滞留因子, 从而实现蛋白从内质网到高尔基体的转运
(Donoso et al., 2005)。
3.2 泛素介导的高尔基体内的蛋白质转运
Cowles等(1997)在研究酵母时发现泛素化调控囊泡
蛋白从高尔基体到内涵体的转运。在随后十几年的研
究中, 研究者们进一步确定了泛素化修饰在蛋白质从
高尔基体到内涵体转运中的作用机制, 即泛素化修饰
对靶蛋白的上膜或是被转运至内涵体中具有决定性
作用(图1) (Marchese, 2015)。
在高尔基体中, 泛素化的蛋白被识别并分选到囊
泡 , 靶蛋白从高尔基体到内涵体的转运多由γ-ear-
containing ARF-结合蛋白或GGA (Golgi localized,
γ-ear-containing, ARF-binding proteins)蛋白介导
(Scheuring et al., 2012)。GGA蛋白定位在高尔基体,
包含4个关键的结构域: VHS (Vps27、Hrs和STAM)
苏泊丹等: 泛素介导的植物膜蛋白转运及其研究方法 391

结构域、GAT (GGA和TOM)结构域、γ-adaptin ear
同源结构域及clathrin结合域(Bonnemaison et al.,
2013)。在酵母和哺乳动物中, 许多靶蛋白从高尔基
体到内涵体的转运都需要GGA蛋白, 而靶蛋白的分
选依赖于VHS结构域与酸性双亮氨酸基序 (acidic
dileucine motifs)的结合, 或GAT结构域与泛素的互
作(Starr et al., 2012)。还有研究发现, GAT结构中的
三螺旋束能与泛素相结合, 进而完成靶蛋白从高尔基
体到内涵体的转运(Bilodeau et al., 2004)。
在高尔基体中, GGA蛋白与磷脂酰肌醇4, 5-二磷
酸(phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate, PIP2)相
互作用, 增强GAT结构域对泛素的亲和力(Demmel
et al., 2008)。Lauwers等(2009)认为, 高尔基复合体
中的一些泛素化靶蛋白会被GGA蛋白识别, 并由网
格蛋白包被小泡分选转运至内涵体。有研究表明, 泛
素化作为蛋白的转运信号, 通过高尔基体调控(Golgi
complex quality control, GQC)途径将未被ERAD途
径识别的靶蛋白转运至内涵体降解 (Hong et al.,
1996)。与内质网和质膜中的蛋白质质控系统相比,
高尔基体对错误折叠蛋白的周转调控还需进一步
研究。
4 类泛素化修饰介导的蛋白转运
近十几年来, 研究者们相继发现了一些序列和三维结
构与泛素相似的蛋白 , 例如 , SUMO (small ubiq-
uitin-related modifier)、NEDD8 (neural precursor
cell expressed developmentally downregulated 8)、
ISG15 (interferon-stimulated gene 15)和Atg8 (auto-
phagy gene 8)等, 这些蛋白统称为类泛素蛋白(ubi-
quitin-like proteins, UBLs) (van der Veen and Ploe-
gh, 2012)。通过类泛素蛋白对目的蛋白进行修饰的过
程称为类泛素化修饰(ubiquitin-like modification)。泛
素化中的很多组分也在UBL的酶促反应中行使功能,
如在泛素连接酶E3的作用下, NEDD8蛋白调控植物
的生长发育(Mergner et al., 2015)。多数的细胞内反
应都有UBL的参与 , 如植物发育和RNA的剪接等
(Mishra et al., 2011)。还有一部分UBL具有双重功能,
如Urm1不仅参与蛋白的修饰 , 而且参与硫的转运
(Petroski et al., 2011)。
随着研究者对类泛素化修饰研究的深入, UBL在
调控蛋白细胞内周转过程中的作用机制也逐渐清晰。
例如, TβRII (transformation growth factor-β type II
receptor)蛋白的Neddylation修饰能调控其胞吞 ,
SUMO化修饰影响G蛋白偶联受体的胞吞等(Wyatt et
al., 2011)。Bar等(2014)发现SUMO化的ATEHD2能
与LeEix2蛋白的胞内域结合, 从而影响LeEix2的胞
吞。对类泛素化修饰在蛋白周转中的作用研究还主要
集中在酵母和动物细胞中, 植物细胞中的类泛素化修
饰仍需进一步研究。
5 泛素介导的植物膜蛋白转运的研究方法
研究蛋白质是否发生泛素化时, 首先通过生物信息学
方法预测泛素化的修饰位点, Auto-Motif等软件可以
对蛋白质的泛素化位点进行预测; 然后通过体外和体
内检测技术, 辅以Western Blot实验, 在特异性抗体
的作用下, 检测蛋白的泛素化; 最后, 定点突变蛋白
的泛素化位点, 通过与野生型进行功能比较确定蛋白
的泛素化功能(表1)。与动物和酵母领域中的研究相


表1 膜蛋白泛素化检测方法的比较
Table 1 Comparison of different methods for detecting the membrane proteins ubiquitination
体内检测 体外检测 检测方法
生物化学法 细胞生物学法 分子与生物化学法
主要步骤 特异性抗体免疫沉淀并富集靶蛋白;
特异性抗体检测蛋白泛素化以及类
型;
质谱分析技术检测蛋白泛素化位点
蛋白链接荧光标签转入植株;
利用显微镜辅以蛋白泛素化抑制剂
处理检测蛋白前后变化;
单分子水平研究蛋白分子的运动与
转运
利用酵母双杂交筛库技术筛出特异性E3
蛋白;
外源表达E1、E2、E3和目标蛋白并孵育;
特异性抗体检测蛋白泛素化以及类型、质
谱分析技术检测蛋白泛素化位点
优点 特异性强, 周期短, 操作简单 活体观察, 简单、直观, 可量化信息 可大量表达蛋白, 周期短
缺点 膜蛋白易降解, 样品纯度不高 周期较长, 用量较多, 需要稳定且
有功能的材料
有“假阴性”结果, 无法精确模拟体内环
境
392 植物学报 51(3) 2016

比, 植物细胞中泛素化介导的蛋白质转运机制尚不清
楚。随着电镜和质谱等技术的迅速发展, 现已对植物
蛋白, 尤其是膜蛋白中泛素介导的转运机制有了较深
的理解。研究者运用抑制剂处理与显微技术结合的方
法, 发现泛素化不仅能使膜蛋白内化、影响蛋白激酶
的活性, 而且能有效调控蛋白的胞吞和转运。在植物
领域研究中, 当突变BRI1的泛素化位点时, 蛋白主要
集中在质膜, 细胞内的胞吞囊泡明显减少(Martins et
al., 2015)。
体外检测泛素化水平是最常用的蛋白泛素化检
测手段, 酵母筛库、免疫印迹以及质谱都是常用的蛋
白泛素化研究方法(表1) (Zhang et al., 2005; Stone
et al., 2006)。然而, 体外检测实验有一定的缺陷, 例
如容易出现“假阳性”以及“假阴性”结果, 而且在
体外并不能准确模拟细胞内的反应环境, 这也使实验
的准确性降低。Zhao等(2013)针对植物建立了一系列
的体外检测蛋白泛素化的方法。在泛素化修饰的过程
中, E2和E3共同决定了靶蛋白的特异性以及泛素化
修饰的类型。因此, 分析E2和E3的功能为检测蛋白泛
素化提供了一种有效的方法。Zhao等(2013)克隆了拟
南芥中所有的E2和E3蛋白家族成员, 通过E2激活实
验、E2连接共轭实验以及E3激活实验并辅以Western
Blot技术验证了蛋白的泛素化, 并证明了E2在体外检
测实验中起主导作用。
体内检测蛋白泛素化是一种新型的研究方法 ,
Liu等(2010)利用农杆菌渗透法完成了蛋白泛素化的
体内检测。农杆菌渗透法即在烟草 (Nicotiana ta-
bacum)中瞬时表达蛋白并在体内检测蛋白是否能发
生泛素化, 效率高且周期短, 弥补了以往方法的不
足, 为以后的泛素化研究提供了新思路。显微镜技术
是近年新型的活体检测蛋白泛素化的方法。Martins
等(2015)在研究BRI1的泛素化时, 将抑制剂处理与
显微技术结合, 快速且直观, 是初步验证蛋白是否发
生泛素化的有效途径(表1)。
6 总结与展望
泛素是一段含有多个赖氨酸残基的小肽, 通过不同的
结合方式形成不同的构象与靶蛋白相互作用。泛素的
这种特性决定了其功能的多样性。例如, 泛素化修饰
不仅能参与蛋白的降解, 而且能作为蛋白胞吞内化的
信号, 进而调控蛋白在不同细胞器内的转运。根据泛
素的不同构象, 泛素化可分为3种类型: 单泛素化、多
位点单泛素化以及多泛素化。不同类型的泛素化修饰
不同的功能。例如, K48和K11的多泛素化一般将蛋白
转运至蛋白酶体中降解, 而单泛素化和K63多泛素化
主要作为蛋白内化及转运的信号。
泛素化介导的膜蛋白胞吞受到越来越多的关注。
在酵母和动物中, 泛素化可作为膜蛋白胞吞的信号,
并调控蛋白在内涵体和溶酶体等细胞器内的转运。植
物中对膜蛋白的泛素化研究也陆续展开。FLS2、
BRI1、PIN2、BOR1以及IRT1的胞吞都受到泛素化
的调控。虽然对泛素介导的膜蛋白或者新合成蛋白的
周转已有很多研究, 但其机制还不是很清楚。此外,
大多数类泛素化过程都有泛素化组分的参与, 因此进
一步研究它们之间的动态平衡与交互关系也将有利
于阐明泛素化介导的胞吞机制。
参考文献
Amerik AY, Nowak J, Swaminathan S, Hochstrasser M
(2000). The Doa4 deubiquitinating enzyme is functionally
linked to the vacuolar protein-sorting and endocytic path-
ways. Mol Biol Cell 11, 3365–3380.
Apaja PM, Xu H, Lukacs GL (2010). Quality control for
unfolded proteins at the plasma membrane. J Cell Biol
191, 553–570.
Avila-Ospina L, Moison M, Yoshimoto K, Masclaux-
Daubresse C (2014). Autophagy, plant senescence, and
nutrient recycling. J Exp Bot 65, 3799–3811.
Bagola K, Mehnert M, Jarosch E, Sommer T (2011). Pro-
tein dislocation from the ER. BBA-Biomembranes 1808,
925–936.
Bar M, Schuster S, Leibman M, Ezer R, Avni A (2014).
The function of EHD2 in endocytosis and defense signal-
ing is affected by SUMO. Plant Mol Biol 84, 509–518.
Barberon M, Zelazny E, Robert S, Conéjéro G, Curie C,
Friml J, Vert G (2011). Monoubiquitin-dependent endo-
cytosis of the iron-regulated transporter 1 (IRT1) trans-
porter controls iron uptake in plants. Proc Natl Acad Sci
USA 108, E450–E458.
Battey NH, James NC, Greenland AJ, Brownlee C (1999).
Exocytosis and endocytosis. Plant Cell 11, 643–659.
Bilodeau PS, Winistorfer SC, Allaman MM, Surendhran
K, Kearney WR, Robertson AD, Piper RC (2004). The
GAT domains of clathrin-associated GGA proteins have
苏泊丹等: 泛素介导的植物膜蛋白转运及其研究方法 393

two ubiquitin binding motifs. J Biol Chem 279, 54808–
54816.
Bonnemaison ML, Eipper BA, Mains RE (2013). Role of
adaptor proteins in secretory granule biogenesis and
maturation. Front Neuroendocrinol 4, 101.
Brown NG, VanderLinden R, Watson ER, Qiao R, Grace
CR, Yamaguchi M, Weissmann F, Frye JJ, Dube P,
Cho SE (2015). RING E3 mechanism for ubiquitin ligation
to a disordered substrate visualized for human ana-
phase-promoting complex. Proc Natl Acad Sci USA 112,
5272–5279.
Cowles CR, Odorizzi G, Payne GS, Emr SD (1997). The
AP-3 adaptor complex is essential for cargo-selective
transport to the yeast vacuole. Cell 91, 109–118.
Crapeau M, Merhi A, André B (2014). Stress conditions
promote yeast Gap1 permease ubiquitylation and down-
regulation via the arrestin-like bul and aly proteins. J Biol
Chem 289, 22103–22116.
Cui F, Liu L, Zhao Q, Zhang Z, Li Q, Lin B, Wu Y, Tang S,
Xie Q (2012). Arabidopsis ubiquitin conjugase UBC32 is
an ERAD component that functions in brassinosteroid-
mediated salt stress tolerance. Plant Cell 24, 233–
244.
Demmel L, Gravert M, Ercan E, Habermann B, Müller-
Reichert T, Kukhtina V, Haucke V, Baust T, Sohrmann
M, Kalaidzidis Y (2008). The clathrin adaptor Gga2p is a
phosphatidylinositol 4-phosphate effector at the Golgi exit.
Mol Biol Cell 19, 1991–2002.
Denic V, Quan EM, Weissman JS (2006). A luminal sur-
veillance complex that selects misfolded glycoproteins for
ER-associated degradation. Cell 126, 349–359.
Donoso G, Herzog V, Schmitz A (2005). Misfolded BiP is
degraded by a proteasorne-independent endoplasmic-
reticulum-associated degradation pathway. B Journal 387,
897–903.
Dores MR, Chen B, Lin H, Soh UJ, Paing MM, Montagne
WA, Meerloo T, Trejo J (2012). ALIX binds a YPX3L
motif of the GPCR PAR1 and mediates ubiquitin-ind-
ependent ESCRT-III/MVB sorting. J Cell Biol 197, 407–
419.
Ellgaard L, Helenius A (2003). Quality control in the endo-
plasmic reticulum. Nat Rev Mol Cell Biol 4, 181–191.
Fang S, Ferrone M, Yang C, Jensen JP, Tiwari S, Weiss-
man AM (2001). The tumor autocrine motility factor re-
ceptor, gp78, is a ubiquitin protein ligase implicated in
degradation from the endoplasmic reticulum. Proc Natl
Acad Sci USA 98, 14422–14427.
Göhre V, Spallek T, Häweker H, Mersmann S, Mentzel T,
Boller T, de Torres M, Mansfield JW, Robatzek S
(2008). Plant pattern-recognition receptor FLS2 is di-
rected for degradation by the bacterial ubiquitin ligase
AvrPtoB. Curr Biol 18, 1824–1832.
Goldstein G, Scheid M, Hammerling U, Schlesinger D,
Niall H, Boyse E (1975). Isolation of a polypeptide that
has lymphocyte-differentiating properties and is probably
represented universally in living cells. Proc Natl Acad Sci
USA 72, 11–15.
Guo Y, Sirkis DW, Schekman R (2014). Protein sorting at
the trans-Golgi Network. Annu Rev Cell Dev Biol 30, 169–
206.
Haglund K, Dikic I (2012). The role of ubiquitylation in re-
ceptor endocytosis and endosomal sorting. J Cell Sci 125,
265–275.
Han L, Yang J, Wang X, Wu Q, Yin S, Li Z, Zhang J, Xing
Y, Chen Z, Tsun A (2014). The E3 deubiquitinase USP17
is a positive regulator of retinoic acid-related orphan nu-
clear receptor γt (RORγt) in Th17 Cells. J Biol Chem 289,
25546–25555.
Hicke L, Dunn R (2003). Regulation of membrane protein
transport by ubiquitin and ubiquitin-binding proteins. Annu
Rev Cell Dev Biol 19, 141–172.
Hirsch C, Gauss R, Horn SC, Neuber O, Sommer T
(2009). The ubiquitylation machinery of the endoplasmic
reticulum. Nature 458, 453–460.
Hong E, Davidson AR, Kaiser CA (1996). A pathway for
targeting soluble misfolded proteins to the yeast vacuole.
J Cell Biol 135, 623–633.
Hurley JH, Stenmark H (2011). Molecular mechanisms of
ubiquitin-dependent membrane traffic. Annu Rev Biophys
40, 119.
Ikeda F, Dikic I (2008). A typical ubiquitin chains: new mo-
lecular signals. EMBO Rep 9, 536–542.
Johansen T, Lamark T (2011). Selective autophagy medi-
ated by autophagic adapter proteins. Autophagy 7, 279–
296.
Kölling R, Losko S (1997). The linker region of the ABC-
transporter Ste6 mediates ubiquitination and fast turnover
of the protein. EMBO J 16, 2251–2261.
Keener JM, Babst M (2013). Quality control and sub-
strate-dependent downregulation of the nutrient trans-
porter Fur4. Traffic 14, 412–427.
Kirkham M, Parton RG (2005). Clathrin-independent en-
docytosis: new insights into caveolae and non-caveolar
lipid raft carriers. Biochim Biophys Acta 1745, 273–286.
394 植物学报 51(3) 2016

Kirkin V, McEwan DG, Novak I, Dikic I (2009). A role for
ubiquitin in selective autophagy. Mol Cell 34, 259–269.
Lauwers E, Jacob C, André B (2009). K63-linked ubiquitin
chains as a specific signal for protein sorting into the mul-
tivesicular body pathway. J Cell Biol 185, 493–502.
Lemus L, Goder V (2014). Regulation of endoplasmic re-
ticulum-associated protein degradation (ERAD) by ubiq-
uitin. Cells 3, 824–847.
Lin WY, Huang TK, Chiou TJ (2013). NITROGEN LIMITA-
TION ADAPTATION, a target of microRNA827, mediates
degradation of plasma membrane-localized phosphate
transporters to maintain phosphate homeostasis in Ara-
bidopsis. Plant Cell 25, 4061–4074.
Liu L, Cui F, Li Q, Yin B, Zhang H, Lin B, Wu Y, Xia R,
Tang S, Xie Q (2011). The endoplasmic reticulum-
associated degradation is necessary for plant salt toler-
ance. Cell Res 21, 957–969.
Liu L, Zhang Y, Tang S, Zhao Q, Zhang Z, Zhang H, Dong
L, Guo H, Xie Q (2010). An efficient system to detect
protein ubiquitination by agroinfiltration in Nicotiana ben-
thamiana. Plant J 61, 893–903.
Liu Y, Bassham DC (2012). Autophagy: pathways for
self-eating in plant cells. Annu Rev Plant Biol 63, 215–
237.
Luhtala N, Odorizzi G (2004). Bro1 coordinates deubiquit-
ination in the multivesicular body pathway by recruiting
Doa4 to endosomes. J Cell Biol 166, 717–729.
MacGurn JA, Hsu PC, Emr SD (2012). Ubiquitin and
membrane protein turnover: from cradle to grave. Annu
Rev Biochem 81, 231–259.
Manzanillo PS, Ayres JS, Watson RO, Collins AC, Souza
G, Rae CS, Schneider DS, Nakamura K, Shiloh MU,
Cox JS (2013). The ubiquitin ligase parkin mediates re-
sistance to intracellular pathogens. Nature 501, 512–516.
Marchese A (2015). Monitoring chemokine receptor traf-
ficking by confocal immunofluorescence microscopy.
Method Enzymol 570, 281–292.
Martins S, Dohmann EM, Cayrel A, Johnson A, Fischer
W, Pojer F, Satiat-Jeunemaître B, Jaillais Y, Chory J,
Geldner N (2015). Internalization and vacuolar targeting
of the brassinosteroid hormone receptor BRI1 are regu-
lated by ubiquitination. Nat Commun 6, 6151.
Mergner J, Heinzlmeir S, Kuster B, Schwechheimer C
(2015). DENEDDYLASE1 deconjugates NEDD8 from non-
cullin protein substrates in Arabidopsis thaliana. Plant Cell
27, 741–753.
Mishra SK, Ammon T, Popowicz GM, Krajewski M, Nagel
RJ, Ares M, Holak TA, Jentsch S (2011). Role of the
ubiquitin-like protein Hub1 in splice-site usage and alter-
native splicing. Nature 474, 173–178.
Mukhopadhyay D, Riezman H (2007). Proteasome-indep
endent functions of ubiquitin in endocytosis and signaling.
Science 315, 201–205.
Parton RG, Richards AA (2003). Lipid rafts and caveolae
as portals for endocytosis: new insights and common
mechanisms. Traffic 4, 724–738.
Passmore L, Barford D (2004). Getting into position: the
catalytic mechanisms of protein ubiquitylation. Biochem J
379, 513–525.
Petroski MD, Salvesen GS, Wolf DA (2011). Urm1 couples
sulfur transfer to ubiquitin-like protein function in oxidative
stress. Proc Natl Acad Sci USA 108, 1749–1750.
Pickart CM, Eddins MJ (2004). Ubiquitin: structures, func-
tions, mechanisms. BBA-Mol Cell Res 1695, 55–72.
Piper RC, Dikic I, Lukacs GL (2014). Ubiquitin-dependent
sorting in endocytosis. Cold Spring Harb Perspect Biol 6,
a016808.
Puertollano R, Bonifacino JS (2004). Interactions of GGA3
with the ubiquitin sorting machinery. Nat Cell Biol 6, 244–
251.
Ravid T, Hochstrasser M (2008). Diversity of degradation
signals in the ubiquitin-proteasome system. Nat Rev Mol
Cell Biol 9, 679–689.
Scheuring D, Künzl F, Viotti C, Yan MSW, Jiang L, Sch-
ellmann S, Robinson DG, Pimpl P (2012). Ubiquitin initi-
ates sorting of Golgi and plasma membrane proteins into
the vacuolar degradation pathway. BMC Plant Biol 12, 164.
Scott D, Oldham NJ, Strachan J, Searle MS, Layfield R
(2014). Ubiquitin-binding domains: mechanisms of ubiq-
uitin recognition and use as tools to investigate ubiq-
uitin-modified proteomes. Proteomics 15, 844–861.
Seaman MN (2012). The retromer complex-endosomal pro-
tein recycling and beyond. J Cell Sci 125, 4693–4702.
Shields SB, Piper RC (2011). How ubiquitin functions with
ESCRTs. Traffic 12, 1306–1317.
Shih SC, Sloper-Mould KE, Hicke L (2000). Monoubiquitin
carries a novel internalization signal that is appended to
activated receptors. EMBO J 19, 187–198.
Shin LJ, Lo JC, Chen GH, Callis J, Fu H, Yeh KC (2013).
IRT1 degradation factor1, a ring E3 ubiquitin ligase, regu-
lates the degradation of iron-regulated transporter1 in
Arabidopsis. Plant Cell 25, 3039–3051.
Starr TL, Pagant S, Wang CW, Schekman R (2012). Sort-
ing signals that mediate traffic of chitin synthase III bet-
苏泊丹等: 泛素介导的植物膜蛋白转运及其研究方法 395

ween the TGN/endosomes and to the plasma membrane
in yeast. PLoS One 7, e46386.
Stone SL, Williams LA, Farmer LM, Vierstra RD, Callis J
(2006). KEEP ON GOING, a RING E3 ligase essential for
Arabidopsis growth and development, is involved in ab-
scisic acid signaling. Plant Cell 18, 3415–3428.
Su W, Liu Y, Xia Y, Hong Z, Li J (2011). Conserved endo-
plasmic reticulum-associated degradation system to
eliminate mutated receptor-like kinases in Arabidopsis.
Proc Natl Acad Sci USA 108, 870–875.
Terrell J, Shih S, Dunn R, Hicke L (1998). A function for
monoubiquitination in the internalization of a G pro-
tein-coupled receptor. Mol Cell 1, 193–202.
van der Veen AG, Ploegh HL (2012). Ubiquitin-like pro-
teins. Annu Rev Biochem 81, 323–357.
Vembar SS, Brodsky JL (2008). One step at a time: endo-
plasmic reticulum-associated degradation. Nat Rev Mol
Cell Biol 9, 944–957.
Wang S, Thibault G, Ng DT (2011). Routing misfolded
proteins through the multivesicular body (MVB) pathway
protects against proteotoxicity. J Biol Chem 286, 29376–
29387.
Wenzel D, Stoll K, Klevit R (2011). E2s: structurally eco-
nomical and functionally replete. Biochem J 433, 31–42.
Weyand S, Shimamura T, Yajima S, Suzuki Si, Mirza O,
Krusong K, Carpenter EP, Rutherford NG, Hadden JM,
OReilly J (2008). Structure and molecular mechanism of
a nucleobase-cation-symport-1 family transporter. Sci-
ence 322, 709–713.
Wyatt D, Malik R, Vesecky AC, Marchese A (2011). Small
ubiquitin-like modifier modification of arrestin-3 regulates
receptor trafficking. J Biol Chem 286, 3884–3893.
Zhang X, Garreton V, Chua NH (2005). The AIP2 E3 ligase
acts as a novel negative regulator of ABA signaling by
promoting ABI3 degradation. Genes Dev 19, 1532–1543.
Zhao Q, Tian M, Li Q, Cui F, Liu L, Yin B, Xie Q (2013). A
plant-specific in vitro ubiquitination analysis system. Plant
J 74, 524–533.

Ubiquitin-mediated Membrane Protein Trafficking in Plant Cells
and Related Research Techniques: A Review
Bodan Su, Jinxing Lin, Jianwei Xiao*
College of Biological Sciences and Technology, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China
Abstract Ubiquitin is covalently attached to target proteins via a lysine residue to decide the fate of the target proteins.
However, the investigations of ubiquitin-mediated protein, especially membrane protein trafficking processes, are few in
plant cells as compared with mammal and yeast cells. The application of biochemical techniques and microtechniques
provide new tools for dissecting the mechanisms of ubiquitin-mediated membrane protein trafficking in plants. This review
summarizes our current understanding of how ubiquitin modification affects membrane protein trafficking, with special
emphasis on mechanisms of ubiquitin-mediated membrane protein sorting and related research techniques, which pro-
vide valuable information for further study on ubiquitin-mediated membrane protein trafficking in plants.
Key words membrane proteins trafficking, ubiquitin, ubiquitylation
Su BD, Lin JX, Xiao JW (2016). Ubiquitin-mediated membrane protein trafficking in plant cells and related research
techniques: a review. Chin Bull Bot 51, 387–395.
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* Author for correspondence. E-mail: xiaojianwei@bjfu.edu.cn
(责任编辑: 朱亚娜)