全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2012, 48 (5): 456~464456
收稿 2012-01-09　　修定 2012-03-26
资助 科技部“十二五”科技支撑课题(2011BAD22B08)和科技部
国际合作重点项目(2006DFB63400)。
* 通讯作者(E-mail: chenfangbio@gmail.com; Tel: 028-
85417281)。
一个麻疯树RING型锌指蛋白基因JcRFP1的克隆及表达
严安心, 谢瑜, 吉柔风, 李诗娟, 徐莺, 陈放*
四川大学生命科学学院, 成都610065
摘要: 首次从麻疯树胚乳cDNA文库中克隆得到一个RING型锌指蛋白基因(GenBank登录号为JF920726), 命名为JcRFP1。该
cDNA长度为728 bp, 包含编码JcRFP1蛋白的完整开放阅读框(516 bp)。JcRFP1基因在麻疯树各器官中均检测到表达且表达
量依次为: 叶>茎>花>果实>种子>根。将克隆到的JcRFP1基因的cDNA序列连接到表达载体pET32a (+)上, 导入BL21 (DE3)
pLysS菌株, 成功诱导表达相对分子质量为33.2 kDa的可溶性融合蛋白。该融合蛋白免疫新西兰大白兔, 得到效价为1: 6 500
的抗血清。研究表明, JcRFP1蛋白具有体外泛素连接酶E3活性, 在麻疯树体内可能参与油菜素甾醇信号转导途径。
关键词: 麻疯树; RING指蛋白; 原核表达; 泛素连接酶; 油菜素甾醇
Cloning and Expression of a RING Finger Protein Gene JcRFP1 from Jatro-
pha curcas L.
YAN An-Xin, XIE Yu, JI Rou-Feng, LI Shi-Juan, XU Ying, CHEN Fang*
School of Life Sciences, Sichuan University, Chengdu 610065, China
Abstract: A novel RING finger protein gene was cloned from Jatropha curcas endosperm cDNA library (Gen-
Bank Accession No. JF920726), named JcRFP1. The cDNA length was 728 bp including the complete coding
sequence (516 bp) of JcRFP1. JcRFP1 gene expression could be detected in all organs of J. curcas, and the ex-
pression levels are different as follows leaf>stem>flower>fruit>seed>root. JcRFP1 cDNA was ligated into the
expression plasmid pET-32a (+) and a soluble fusion protein with the molecular weight of 33.2 kDa was ex-
pressed successfully in E. coli strain BL21 (DE3) pLysS including the recombinant plasmid pET32a
(+)-JcRFP1ΔN. Thereafter, the fusion protein was used to immunize the New Zealand white rabbits and the
polyclonal antibody was obtained, which could be diluted into 1: 6 500 during western blot analysis. The study
showed JcRFP1 had in vitro ubiquitin ligase (E3) activity and might participate in brassinosteroid signal trans-
duction pathways in J.curcas.
Key words: Jatropha curcas L.; RING finger protein; prokaryotic expression; ubiquitin ligase; brassinosteroid
锌指蛋白在真核生物中广泛存在, 参与细胞
的分化、增殖和凋亡等多种生命过程。蛋白的锌
指结构是由若干保守的半胱氨酸及组氨酸残基同
锌离子结合而形成的相对独立的“指”状四面体结
构。根据与锌离子结合的保守的Cys和His组合的
不同, 可以把锌指结构分为C2H2、C2HC、C3H、
C3HC4、C3H2C3、C4、C4HC3、C6等多种类
型。C3HC4、C3H2C3型锌指结构又分别称为
RING-HC、RING-H2锌指, 是RING指结构的两种
类型, 能够与2个Zn2+结合(Freemont 1993)。RING
指结构包含40~60个氨基酸残基, 一级序列为Cys-
X2-Cys-X9-39-Cys-X1-3-His-X2-3-Cys/His-X2-Cys-X4-48-
Cys-X2-Cys (X为任意一种氨基酸残基), C3HC4和
C3H2C3锌指结构的区别在于第5个保守氨基酸残
基的不同(Cys/His) (Borden和Freemont 1996)。
泛素-蛋白酶体途径是真核生物特有的蛋白
质降解途径, 包括底物蛋白泛素化和蛋白酶体降
解两个过程。底物蛋白泛素化需要泛素激活酶
(ubiquitin-activating enzymes, E1)、泛素结合酶
(ubiquitin-conjugating enzymes, E2)和泛素连接酶
(ubiquitin ligases, E3)共同作用: 首先E1在ATP作用
下激活泛素(ubiquitin, Ub), 形成E1-Ub; 然后活化
的泛素被转移至E2, 形成E2-Ub; 最后E3募集
E2-Ub和底物, 并催化泛素转移至底物蛋白, 使其
泛素化。最终泛素化的底物被26S蛋白酶体所识
严安心等: 一个麻疯树RING型锌指蛋白基因JcRFP1的克隆及表达 457
别降解(Yamao 1999; Ciechanover等2000; Glickman
和Ciechanover 2002)。RING指蛋白普遍具有泛素
连接酶E3活性, 能够起到募集特异泛素结合酶E2
和底物的作用, 是某些特异底物泛素化过程的关
键酶。目前已被证实具有泛素连接酶活性的RING
指蛋白很多(大多为体外泛素化实验所证实), 如
Ubr1 (Kwon等1998)、Cbl (Levkowitz等1999)、
Apc11 (Leverson等2000)、TRAF6 (Deng等2000)、
IAPs (Yang等2000)、AtRma1 (Matsuda等2001)、
CRLs (Gray等2002; Willems等2004; Petroski和De-
shaies 2005)、SDIR1 (Zhang等2007)、Rma1H1
(Lee等2009)、GhRING1 (Ho等2010)、RNF146
(Callow等2011)等。RING指蛋白对植物生理过程
的调节是多种多样的 , 如植物病害防御(Liu等
2008)、光形态发生(Deshaies和Meyerowitz 2000;
Hardtke和Deng 2000)、根的发育 (Koiwai等
2007)、渗透压调节(Hong等2007)、信号转导(Cal-
low等2011)、细胞凋亡(Lin等2008; Lee等2011)、
激素合成的调控(Wang等2004; Ko等2006)、过氧
化物酶体生物合成(Schumann等2007)、细胞周期
调控(Lai等2009)等。
麻疯树又名小桐子, 为大戟科(Euphorbiaceae)
麻疯树属(Jatropha)植物, 是一种重要的生物能源
树种, 具有耐热、耐旱等特点。麻疯树中锌指蛋
白的研究能够为耐热和耐旱作用机制的阐明、高
效抗逆基因的发现、植物性状的改良等提供帮
助。本文首次报道克隆了一个编码麻疯树RING指
蛋白的基因, 并运用生物信息学的方法对该基因
及其编码的氨基酸序列进行深入分析, 推测其可
能具有的生物学功能。运用分子生物学技术对基
因表达模式、蛋白生物活性、植物激素应答等方
面进行了考查并制备了相应蛋白的高效价抗体。
这些研究成果为进一步探明该基因的生理生化功
能奠定了基础。
材料与方法
1 实验材料
麻疯树(Jatropha curcas L.)种子(采自四川省
西昌地区)胚乳用于RNA提取。BL21 (DE3) pLysS
菌株购自于北京百泰克生物技术有限公司, DH5α
菌株和表达质粒pET-32a (+)均为本实验室保存。
限制性内切酶BamHI和HindIII、T4 DNA连
接酶、反转录酶M-MLV(RNase H-)及各种抗生素
均购自于TaKaRa公司, EasyTaq DNA聚合酶、
EasyPfu DNA聚合酶、核酸分子量标准、蛋白分
子量标准均购自于Transgen公司, Plasmid Mini Kit
I (100) 购自于Omega公司, Ni2+-NTA柱购自Qiagen
公司, 琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(普通离心柱
型)、RNAprep pure植物总RNA提取试剂盒(离心
柱型)均购自TIANGEN公司, 荧光定量PCR试剂盒
SsoFast EvaGreen Supermix购于Bio-Rad公司,
UBE1 (E1)、UbcH5c (E2)、泛素(Ub)、Anti-Ubiq-
uitin (Anti-Ub)均购自于Boston Biochem公司, HRP
标记的山羊抗兔IgG二抗购于EarthOx公司, 辣根过
氧化物酶底物购自于Thermo公司, 弗氏完全佐剂
和弗氏不完全佐剂购自Sigma公司, Protein A Sep-
harose CL-4B亲和层析柱购于GE公司, 其余试剂均
为国产分析纯。
2 实验方法
2.1 生物信息学分析
利用相关软件分析JcRFP1的氨基酸序列: 用
BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 进行
同源序列搜索; 用ExPASy (http://au.expasy.org) 的
Compute pI/Mw计算蛋白质的等电点、分子量; 用
TMHMM预测跨膜结构; 用SignalP预测信号肽; 用
PROSITE预测功能位点; 用SBASE预测结构域; 用
SOPMA预测二级结构; 用SWISSMODEL预测三
级结构; 选取部分已报道的植物RING型锌指蛋白,
应用DNAMAN进行序列比对; 用MEGA4构建系
统进化树。
2.2 组织特异性表达
按照RNAprep pure植物总RNA提取试剂盒操
作说明提取麻疯树不同组织器官(根、茎、叶、
花、果实、种子)的总RNA。用Oligo(dT)18、反转
录酶M-MLV (RNase H-)合成cDNA第一链。按照
荧光定量PCR试剂盒使用说明, 以cDNA第一链为
模板, 以组成型表达的麻疯树18S rRNA (GenBank
登录号为AY823528.1)为内参基因, 用18S引物
(18FP: 5′ GAGACCTCAGCCTGCTAACT 3′和
18RP: 5′ CAGAACATCTAAGGGCATCAC 3′)及
JcRFP1特异性引物(FP1: 5′ CGCTTTGTAGAAC-
CTCATT 3′和RP1: 5′ TGGAACCGAACTGTACT-
植物生理学报458
CAC 3′)进行qRT-PCR, 以检测JcRFP1基因在不同
组织器官中的表达量差异。
2.3 JcRFP1在原核细胞中的表达
利用JcRFP1基因的特异引物FP2 (5′ CGCG-
GATCCGGTCTTTCGGATTTCCTGGA 3′)和RP2
(5′ CCCAAGCTTCTCCCTACAAAACTGGA-
ACCG 3′), 以JcRFP1的cDNA为模板进行PCR。50
μL反应体系含有2 μL cDNA, 5 μL 10×EasyTaq buf-
fer (含Mg2+), 4 μL dNTP (2.5 mmol·L-1), 0.5 μL Ea-
syTaq (5U·μL -1), 正向引物和反向引物(10 μmol·L-1)
各2 μL, 加灭菌ddH2O至50 μL。反应条件如下, 94
℃变性3 min; 94 ℃ 30 s, 65 ℃ 30 s, 72 ℃ 1 min, 30
个循环; 72 ℃延伸10 min。PCR产物与pET32a (+)
连接, 构建表达质粒pET32a (+)-JcRFP1ΔN, 将其导
入BL21 (DE3) pLysS感受态细胞中。用终浓度为1
mmol·L-1的IPTG于37 ℃诱导4 h, 离心收集菌体。
冷TBS (500 mmol·L-1 NaCl, 50 mmol·L-1 Tris-HCl,
pH 8.0)重悬后, 超声破碎, 取上清加入Ni2+-NTA柱
中, 用不同浓度咪唑溶液(20、50、100、200、300
和500 mmol·L-1)梯度洗脱, 以分离和纯化融合蛋
白。纯化后的融合蛋白于–80℃保存。每次使用
前用Bradford法测定融合蛋白浓度。
2.4 体外泛素连接酶活性鉴定
采用体外自泛素化反应鉴定JcRFP1蛋白的泛
素连接酶活性。自泛素化反应体系包括: 1×泛素
化反应缓冲液(30 mmol·L-1 Tris-HCl, pH 8.0; 5
mmol·L-1 MgCl2; 100 mmol·L
-1 NaCl; 2 mmol·L-1
ATP和2 mmol·L-1 DTT), 0.3 mmol·L-1 PMSF, 25
μmol·L-1 MG132, 500 μmol·L-1泛素, 100 nmol·L-1
UBE1, 500 nmol·L-1 UbcH5c, 500 ng·μL-1 pET32-
JcRFP1ΔN, 以及灭菌ddH2O。反应温度为28 ℃, 时
间为1 h。反应后的体系用泛素抗体进行Western
blot分析: 兔源泛素抗体为一抗, 1:200稀释, 37 ℃
孵育2 h; 山羊抗兔IgG/辣根过氧化物酶标记的二
抗1:5 000稀释, 37 ℃孵育1 h。
2.5 油菜素内酯(brassinolide, BL)对JcRFP1基因
表达的影响
将麻疯树幼苗按如下条件进行培养: 温度为
(28±1) ℃, 光照强度为480 μmol·m-2·s-1, 光照时间为
12 h·d-1。培养2个月后在光照条件下用1 μmol·L-1
BL水溶液对幼苗全株进行喷施处理, 取不同处理
时间(0、0.5、1、2、4和6 h)的麻疯树幼苗叶片进
行JcRFP1基因的荧光定量PCR实验。对照组用不
含BL的水溶液处理。荧光定量PCR实验步骤同
2.2。
2.6 JcRFP1融合蛋白抗血清的制备
以JcRFP1融合蛋白对成年雄性新西兰大白兔
进行皮下注射免疫, 共免疫6次。首次免疫以弗氏
完全佐剂与抗原等体积充分乳化, 其他均以弗氏
不完全佐剂进行乳化。在末次免疫后8 d采集血
清。抗血清用Protein A Sepharose CL-4B亲和层析
柱进行亲和纯化。Western blot方法验证抗血清与
JcRFP1融合蛋白结合的特异性。
实验结果
1 JcRFP1的cDNA及蛋白质特征分析
麻疯树胚乳cDNA文库测序后经Blastn分析,
得到一条与蓖麻RING-H2锌指蛋白基因(GenBank
登录号为XM_002511848.1)核苷酸序列一致性达
83%的cDNA序列。该cDNA长度为728 bp, 包含完
整的开放阅读框516 bp, 5′非翻译区41 bp和3′非翻
译区171 bp; 推测的编码蛋白命名为麻疯树RING
指蛋白JcRFP1。
JcRFP1蛋白由171个氨基酸残基组成, 理论分
子量19.7 kDa, 等电点为4.69, 为酸性小分子蛋白
质。该蛋白的N端第15~37位氨基酸序列具有较强
疏水性, 组成疏水跨膜螺旋, 第1~14位氨基酸序列
位于膜的外侧, 第38~171位氨基酸序列位于膜的
内侧。但蛋白N端疏水序列不含典型I型信号肽的
结构特征, 可能为膜锚定区, 因此JcRFP1蛋白可能
为膜锚定蛋白。经PROSITE小蛋白模式数据库推
测, JcRFP1蛋白在C端包含典型的C3H2C3型RING
指结构 , 与Zn 2+结合的保守氨基酸残基分别为 :
C92、C95、C111、H113、H116、C119、C131、C134 (图
1-B), 除RING指结构外, 没有发现其他明显的功能
性位点, 这与SBASE程序预测结果基本一致。
JcRFP1氨基酸序列的二级结构预测显示, α
螺旋和无规卷曲是JcRFP1蛋白中较大量的结构元
件, 其余含有较少量的延伸链和β转角。统计结果
表明, JcRFP1蛋白的二级结构包含50.88% α螺旋、
43.27%无规卷曲、5.26%延伸链和0.58% β转角,
其中C92、C95位于延伸链, C111、H113、H116、C119位
严安心等: 一个麻疯树RING型锌指蛋白基因JcRFP1的克隆及表达 459
于α螺旋, C131、C134位于无规卷曲。
进一步用SWISSMODEL预测JcRFP1蛋白的
三级结构可知, JcRFP1的RING指三级结构(图1-A)
与已知的粳稻泛素连接酶EL5的RING指三维结构
具有很高的相似性(Arnold等2006; Schwede等
2003; Guex和Peitsch 1997)。Takai等(2002)对粳稻
EL5蛋白的研究发现, 其RING-H2结构域具有泛素
连接酶E3活性, 能够与泛素结合酶OsUBC5a或Os-
UBC5b共同作用使MBP泛素化。RING-H2结构域
发挥泛素连接酶E3活性时, 结合2个Zn2+, 整个分子
呈交叉型构象(图1-A、B)。交叉型构象所形成的
凹槽能够为特异的泛素结合酶E2提供居留位点。
当Zn2+缺失时, RING指的交叉型构象会随之改变,
失去泛素连接酶活性。JcRFP1蛋白中保守氨基酸
残基C92、C95、H116、C119与C111、H113、C131、C134
分别结合一个Zn2+, 从而形成特异的交叉型构象。
2 JcRFP1蛋白的同源性分析及进化树构建
利用NCBI网站的非冗余蛋白质序列数据库,
通过Blastp程序在不同种属的植物中找到56条JcR-
FP1蛋白同源序列, 一致性范围为85%~27%, 这些
蛋白分别来自蓖麻(Ricinus communis L.)、毛果杨
(Populus trichocarpa Torr. et Gray)、拟南芥[Arabi-
dopsis thaliana (L.) Heynh.]、葡萄(Vitis vinifera
L.)、蒺藜苜蓿(Medicago truncatula Gaertn. var. trun-
catula)、大豆[Glycine max (L.) Merr.]、高粱[Sor-
ghum bicolor (L.) Moench var. bicolor]、玉米(Zea
mays L.)、粳稻(Oryza sativa L. subsp. japonica
Kato)、大麦(Hordeum vulgare L. var. vulgare)和北
美云杉[Picea sitchensis (Bong.) Carr.]等, 体现了
JcRFP1在进化上的保守性。这些同源蛋白大多被
推测具有泛素连接酶E3活性, 这对JcRFP1的功能
研究具有一定的指导意义。图2-A为JcRFP1与部
分同源蛋白的序列比对, 这些蛋白分别为: 来自蓖
麻的XP_002511894和XP_002509838、来自毛果
杨的XP_002302597和XP_002320813、来自拟南
芥的NP_191705.1 (BRH1)、NP_192876 (RHA1a)
和NP_192875 (RHA1b), 它们与JcRFP1的氨基酸序
列一致性分别为85%、63%、84%、84%、73%、
35%和37%。从图2-A中可以看出JcRFP1的N端跨
膜区及C端RING指结构域都具有高度保守性。含
有RING-H2结构域的蛋白称为RH类蛋白, 分为7个
亚类RH A~G (Jensen等1998)。选取不同亚类的蛋
白, 经Clustal W比对后, 采用MEGA4软件, 根据内
分枝测试(interior branch test)中的邻接法(neighbor
joining tree)构建分子进化树如图2-B, 从中可以看
出JcRFP1属于RH类, RHA亚类蛋白。
3 JcRFP1基因的组织特异性表达
JcRFP1基因的表达范围较广, 在根、茎、
叶、花、果实、种子中均检测到转录产物。图3
实时定量PCR (qRT-PCR)表明, 该基因在各组织器
官中的表达量为: 叶>茎>花>果实>种子>根。
4 JcRFP1的原核表达
将JcRFP1基因的完整开放阅读框导入大肠杆
菌并诱导后 , 目的蛋白JcRFP1不能得到明显表
达。Matsuda等(2001)对AtRma1蛋白的研究表明
外源蛋白的末端疏水序列会影响其在原核细胞中
图1 JcRFP1蛋白RING指结构域的三维结构图
Fig.1 Three-dimensional structure of RING finger domain from JcRFP1
A: JcRFP1蛋白RING指结构域的立体图; B: C3H2C3型锌指结构域的平面图, 图中“x”代表任意一种氨基酸残基, 但“x”的个数不代表
实际的氨基酸残基个数。
植物生理学报460
的表达。考虑到JcRFP1蛋白的N端具有较强疏水
性, 设计引物将包含N端疏水区的一段氨基酸序列
(第1~37位氨基酸序列)去除后进行原核表达, 我们
得到了融合蛋白pET32-JcRFP1ΔN (图4)。该融合
蛋白具有可溶性, 加入Ni2+-NTA亲和层析柱中用不
同浓度咪唑溶液进行梯度洗脱, 在100 mmol·L-1咪
唑浓度条件下, 能得到较纯的融合蛋白(图5)。
5 体外泛素连接酶活性检测
近来的研究表明, 许多含有RING指结构的蛋
白质无论是在体内还是在体外都能够进行依赖于
RING指的自身泛素化, 即催化自身与泛素链的结
合。虽然自身泛素化的生理意义还不是很清楚,
但是这一特点已经被用于鉴定RING指蛋白在体外
是否是泛素连接酶E3的参考指标, 特别是当它的
底物还没有被阐述清楚的情况下(Callow等2011;
Lee等2011)。在一个自泛素化反应体系中, 含有
RING指结构的蛋白能够催化自身与单个或者多个
泛素分子(泛素链)相结合, 因此结合物的分子量呈
梯度分布。图6的Western blot分析表明当自泛素
化体系中同时存在UBE1、UbcH5c、ATP、pET32-
图2 JcRFP1与其他植物RING-H2锌指蛋白(RH类)的氨基酸序列比较
Fig.2 Amino acid sequence comparison between JcRFP1 and other plant RING-H2 finger proteins (RH group)
A: 麻疯树JcRFP1与其他的植物RING-H2指蛋白的氨基酸序列比对, 各序列的GenBank登录号如下, 来自蓖麻的XP_002511894
(与JcRFP1的一致性为85%, 下同)和XP_002509838 (63%); 来自毛果杨的XP_002302597 (84%)和XP_002320813 (84%); 来自拟南芥的
NP_191705.1 (BRH1, 73%)、NP_192876 (RHA1a, 35%)和NP_192875 (RHA1b, 37%)。方框内的氨基酸序列表示疏水跨膜区。*表示RING
指结构域中结合Zn2+的保守氨基酸残基。B: 麻疯树JcRFP1与不同类型RH蛋白(包含RH A~G 7个亚类)之间的关系。这些蛋白分别来
自: 蓖麻(XP_002511894)、毛果杨(XP_002302597、XP_002320813)和拟南芥(蛋白分别为BRH1、RHA1a、RHA1b、RHB1a、RHC1a、
RHC2a、BAB10906、ATL2、ATL3、RHF1a、RHF2a、RHG1a)。括号内的字母A~G表示蛋白属于RH A~G中的某一类。
严安心等: 一个麻疯树RING型锌指蛋白基因JcRFP1的克隆及表达 461
JcRFP1ΔN蛋白和泛素时, pET32-JcRFP1ΔN蛋白
能够被自身泛素化, 这就说明pET32-JcRFP1ΔN蛋
白在体外具有泛素连接酶活性。同时也证明了
UbcH5c能够与pET32-JcRFP1ΔN蛋白的RING指结
构域特异结合。
6 油菜素内酯(BL)处理对JcRFP1基因表达的影响
拟南芥BRH1基因与麻疯树JcRFP1基因所编
码氨基酸序列的同源性为73%。Molnár等(2002)研
究发现BRH1基因的表达受BL的影响。据此, 我们
用1 μmol·L-1 BL处理麻疯树幼苗, 考察其对JcRFP1
基因表达的影响。从图7我们可以看出BL能够抑
图3 JcRFP1基因在麻疯树不同器官中的表达状况
Fig.3 Expression analysis of JcRFP1 gene in
different tissues of J. curcas
花苞、青果和幼嫩的种子采于凉山州麻疯树种植基地, 根、
茎、叶取材于实验室中培养2个月左右的麻疯树幼苗。
图4 pET32-JcRFP1ΔN蛋白在重组大肠杆菌中的表达
Fig.4 Expression of pET32-JcRFP1ΔN protein in
recombinant E. coli cells
M: 蛋白分子量标准; 1: 诱导后的pET32-JcRFP1ΔN重组菌;
2: 未诱导的pET32-JcRFP1ΔN重组菌; 3: 诱导后的pET32a (+)重组
菌; 4: 未诱导的pET32a (+)重组菌; *表示33.2 kDa左右的pET32-
JcRFP1ΔN融合蛋白; 箭头表示20.4 kDa左右的pET32a (+)表达标
签; 分离胶浓度12%。
图5 pET32-JcRFP1ΔN融合蛋白的纯化
Fig.5 Purification of fusion protein pET32-JcRFP1ΔN
M: 蛋白分子量标准; 上清、沉淀: 超声破碎后的菌液上清、
沉淀; 1: Ni2+-NTA 亲和层析柱纯化结果; *表示pET32-JcRFP1ΔN
融合蛋白; 分离胶浓度12%。
图6 pET32-JcRFP1ΔN蛋白具有体外自泛素化活性
Fig.6 pET32-JcRFP1ΔN possesses in vitro
autoubiquitination activity
反应时间为1 h, 各反应组分如图所示, 图中的反应条带即为
泛素化的pET32-JcRFP1ΔN蛋白所形成的分子梯度。
植物生理学报462
制JcRFP1基因的表达。
7 JcRFP1融合蛋白抗血清的获得
JcRFP1融合蛋白抗血清经Western blot分析可知
稀释度为1: 6 500时仍能与JcRFP1融合蛋白呈明显
阳性反应(图8)。JcRFP1融合蛋白的多克隆抗体在体
内活性检测、亚细胞定位等方面具有重要作用。
Jensen等(1998)认为RHA类蛋白是含有126~200个
氨基酸残基的小分子蛋白, 一般包含N端疏水结构
域和C端RING-H2结构域。RHA类蛋白的N端疏
水结构域能够形成跨膜α螺旋, 但一般不包含信号
肽切割位点, 因此推断其N端疏水区可能为膜锚定
区。由于RHA类蛋白包含的结构域较少, 结构域
之间的影响较小, 故常用此类蛋白研究RING-H2
结构域的功能。
pET32-JcRFP1ΔN融合蛋白的自泛素化实验
表明该蛋白的RING-H2结构域能够与UbcH5c结
合, 发挥泛素连接酶E3活性。利用UbPred pro-
grams (http://ubpred.org/)对pET32-JcRFP1ΔN融合
蛋白的泛素化位点进行预测, 结果显示pET32a标
签上的K4、K134、K140、K158可能被泛素化, 即
在自泛素化反应中pET32-JcRFP1ΔN的RING指结
构域可能催化自身pET32a标签上的赖氨酸残基与
泛素结合。
根据体外泛素化实验结果, 我们有理由推断
JcRFP1蛋白在生物体内可能作为一种泛素连接酶
参与特异底物的泛素-蛋白酶体降解途径。虽然其
作用底物目前尚不清楚, 但是从JcRFP1基因的组
织特异性表达分析来看, 底物蛋白可能较多地存
在于麻疯树叶片中。许多RING指蛋白的功能与逆
境胁迫密切相关, 如CaRFP1 (Hong等2007)、Os-
BIRF1 (Liu等2008)、Rma1H1 (Lee等2009)、
AtAIRP1(Ryu等2010)、CaRING1 (Lee等2011)、
OsDIS1 (Ning等2011)等, 因此今后我们将进一步
开展JcRFP1基因表达与逆境环境相关性的研究。
与油菜素内酯的分子结构相似的一类植物激
素统称为油菜素甾醇(brassinosteroids, BRs)。油菜
素甾醇信号转导途径是最近几十年植物学的研究
热点之一, 该途径对植物生长发育的调节作用包
括抗逆性、光形态发生、细胞伸长和分裂、维管
束发育、种子萌发、花器官发育和器官衰老等。
油菜素内酯能够抑制麻疯树幼苗中JcRFP1基因的
表达, 说明植物体内JcRFP1基因可能参与了油菜
素甾醇信号转导途径。但是JcRFP1基因在油菜素
甾醇信号转导途径中的具体作用机制还需要实验
的进一步探索。
参考文献
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图7 qRT-PCR检测BL处理条件下JcRFP1基因的转录水平
Fig.7 Transcription pattern of JcRFP1 gene
under BL treatment by qRT-PCR
图8 纯化的pET32-JcRFP1ΔN蛋白的Western blot分析
Fig.8 Western blot analysis of purified
pET32-JcRFP1ΔN protein
M: 蛋白分子量标准; 1、3泳道中pET32-JcRFP1ΔN的加入量
均为200 ng; 2泳道中pET32-JcRFP1ΔN的加入量为100 ng; 1泳道加
入免疫前兔血清作为阴性对照; 2、3泳道加入免疫后抗血清作为
实验组。抗pET32-JcRFP1ΔN抗血清按1:6 500稀释, 37 ℃反应1 h;
山羊抗兔IgG/辣根过氧化物酶标记的二抗按1:5 500稀释, 37 ℃孵
育30 min。箭头所指即为特异杂交条带。
讨　　论
本次研究中, 我们得到的cDNA长度为728 bp,
除了包含编码JcRFP1蛋白的完整开放阅读框(516
bp)以外, 还包含41 bp的5′非翻译区和171 bp的3′非
翻译区。JcRFP1蛋白由171个氨基酸残基组成, 分
子进化树分析表明其属于RH类, RHA亚类蛋白。
严安心等: 一个麻疯树RING型锌指蛋白基因JcRFP1的克隆及表达 463
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