全 文 ：植物学报Chinese Bulletin of Botany 2009, 44 (3): 345-350, www.chinbullbotany.com
doi: 10.3969/j.issn.1674-3466.2009.03.012
收稿日期: 2008-06-17; 接受日期: 2008-10-01
基金项目: 国家自然科学基金(No.30670126)
* 通讯作者。E-mail: hqtian@xmu.edu.cn
.技术方法.
葱卵细胞的分离
菅明霞, 张亚楠, 王雅英, 田惠桥*
厦门大学生命科学学院, 厦门 361005
摘要 将大葱(Allium fistulosum)胚珠置于酶液中30分钟可将其外珠被去掉。可清楚地看到由内珠被包裹的胚珠中胚囊的
轮廓。将胚珠转移至不含酶的相同溶液中, 用解剖针从胚珠中部切割, 然后挤压胚珠的珠孔部位, 卵器细胞从胚珠的切口处逸
出。再用显微操作仪将卵细胞和2个助细胞分开, 达到葱卵细胞分离的目的。酶对分离卵细胞具有重要的作用, 经0.2%果胶酶
Y23、 0.8%果胶酶、0.8%纤维素酶和0.5%半纤维素酶的处理, 可在2小时内从30 个胚珠中分离出18个卵细胞。随着胚囊
的发育, 2个助细胞的体积出现明显差异。生活的葱卵细胞的成功分离, 为建立葱离体受精体系创造了条件。
关键词 葱, 卵细胞, 分离
菅明霞, 张亚楠, 王雅英, 田惠桥 (2009). 葱卵细胞的分离. 植物学报 44, 345-350.
高等植物的雌配子体在体细胞组织的深处生长, 这
使得人们对高等植物受精机理的认识不易深入。将分
离的精、卵细胞体外人工受精并诱导长成植株的离体
受精方法, 可在不受其它组织影响的单细胞水平上研究
高等植物的受精机理, 为探索配子识别与合子激活等问
题提供了有效手段(田惠桥, 2003)。卵细胞的分离是进
行高等植物离体受精研究的前提之一(W ang et a l. ,
2006)。胡适宜等(1985)成功地从烟草( Nicotiana
tabacum)中分离出第1例高等植物生活的卵细胞。接
着, Kranz等(1991)及Kranz和Lörz(1993)应用分离的
玉米(Zea mays)精、卵细胞体外诱导融合, 成功地再生
出可育植株。14 年后, 第 2 例离体受精实验在水稻
(Oryza sativa)中也获得了成功(Uchiumi et al., 2007)。
然而, 卵细胞深藏在胚囊中, 胚囊又被层层体细胞包裹,
因此分离卵细胞并非易事, 近20年来的努力也只分离出
了10余种植物的生活的卵细胞。建立高等植物离体受
精体系首先要克服分离卵细胞的障碍。在成功分离韭
菜(Allium tuberosum)精细胞的基础上(叶律等, 2008),
我们探索分离了其亲缘关系较近的葱(Allium fistulo-
sum)卵细胞, 为在葱属(Allium)植物中开展离体受精实
验和利用分子生物学方法探索葱属植物卵细胞的发育机
理奠定了基础。
1 材料与方法
实验材料大葱(Allium fistulosum L.)于2007年10月种
植于厦门大学生命科学学院的网室中。植株于2008年
4月上旬开花, 花期约为 2 周。
选取开花当天及开花后 1、2、3天等不同时期的
花, 从子房中迅速剥离出胚珠, 置于酶液中, 振荡酶解
20-40分钟。之后用吸管对酶解的胚珠进行吸打, 以除
去酶解掉的部分外珠被组织, 将只有内珠被包裹的胚珠
转移至分离液中。酶液的基本成分为0-0.8%果胶酶
(Pectolyse Y-23)、0-1.2%果胶酶(Serva)、0-1.2%
纤维素酶(Onozuka RS)和6%-12%甘露醇(w/v)。分离
液的基本成分为0.4%CaCl2、1%牛血清白蛋白 (bovine
serum albumin, BSA)和 8%-15%甘露醇(w/v)。在
Leica DM IRB倒置显微镜下, 用自制解剖针将胚珠从胚
囊中部切开, 轻轻挤压珠孔, 卵细胞及2个助细胞即从切
口部位逸出。用Leica DC-180显微操作仪收集游离出
的卵细胞和助细胞。用 20 mg.mL-1荧光素二醋酸酯
(fluorescein diacetate, FDA)检测细胞的生活力。
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2 结果与讨论
2.1 分离不同发育时期的葱卵细胞及助细胞
我们首先观察了葱的开花过程, 发现其雌雄异熟现象明
显: 葱有6个花药, 开花当天花冠并不完全展开, 6个花
药中 3个花丝伸长, 花药伸出花冠, 随后花药开裂。开
花后1天另外3个花药的花丝伸长, 花药伸出花冠, 然后
花冠完全展开。在开花当天, 雌蕊的花柱很短。开花
后 2天花柱才明显伸长, 到开花后 3天花柱达到最长。
推测葱的花药开裂时间与花柱伸长时间的不同步可使其
避免自花授粉, 这是植物界中的一种常见现象。
葱的胚珠为双珠被、薄珠心。切割胚珠之前需要
先将外珠被去掉, 剩下内珠被包裹的胚囊, 在倒置显微镜
下可清楚地观察到胚囊的轮廓, 为切割胚珠确定了位置
(图 1A)。取开花当天和开花后 1、2、3天不同时期花
的胚珠进行卵细胞的分离。由于卵器细胞的体积较大
且形态特异, 因而从胚珠中逸出的卵器细胞很容易与珠
心体细胞区别, 而且随着胚囊的发育成熟, 卵器细胞的形
态特异性也越加明显。从开花当天胚珠中分离的卵器
细胞均呈梨形, 但很快便变成圆形。卵细胞和2个助细
胞的体积相似, 但在结构上有差异: 卵细胞的细胞质较少
且主要分布在细胞核的周围, 细胞内含物比较透明。开
花当天的2个助细胞大小相似, 细胞核均位于细胞的一
端, 另一端为一个大液泡, 呈现出相同的极性(图 1B)。
开花后1天时, 3个卵器细胞(卵细胞和2个助细胞)之间
的差异更加明显: 卵细胞的体积没有显著变化, 但2个助
细胞的体积却明显增加, 而且2个助细胞之间也出现了
差异, 一个助细胞较大, 另一个则较小; 此外, 2个助细
胞中的大液泡变成了几个较小的液泡(图1C)。开花后3
天时, 分离出的卵器细胞的体积差异更加明显, 卵细胞
的体积没有明显变化, 2个助细胞的体积进一步增大, 约
为卵细胞体积的2-3倍, 并且细胞内的大液泡消失, 细
胞中充满了细胞质; 同时2个助细胞之间的体积差异更
加明显(图 1D)。
分离出的3个卵器细胞通常相互连接在一起(图1E),
易于辨认。用鉴定细胞生活力的荧光素二醋酸酯染色,
3个细胞均显示出活性荧光(图1F)。使用显微操作仪的
玻璃针可将卵细胞和2个助细胞分开, 达到分离生活卵
细胞的目的(图1G, H)。也可以使用显微操作仪将同一
批分离的卵细胞收集在一起(图1I, J), 为以后开展卵细
胞分子生物学研究打下基础。
与高等植物相比, 动物的受精机理研究较为深入, 其
中一个原因就是动物的精、卵细胞易于分离, 尤其是鱼
类的卵细胞本身就是完全离体发育的, 因此实验易于操
作。高等植物卵细胞被胚珠体细胞层层包裹, 胚珠又位
于雌蕊的子房之中, 因此探索植物的受精机理要逾越很
多障碍。利用分离的精、卵细胞在体外诱导融合, 重
演受精过程的离体受精技术排除了体细胞的干扰, 使定
点追踪受精过程中的细胞和分子变化事态得以实现, 是
目前研究高等植物受精机理的有效手段(田惠桥, 2003;
Wang et al., 2006)。离体受精的主要前提是分离出生
活的卵细胞。目前, 已从烟草(胡适宜等, 1985; Tian
and Russell, 1997)、玉米(Kranz et al., 1991)、大
麦(Hordeim vulgare )(Holm et a l. , 1994)、小麦
(Triticum aestivum)(Kovács et al., 1995)、蓝猪耳
(Torenia fournieri)(Kristóf and Imre, 1996; Chen et al.,
2008)、白花丹(Plumbago zey lan ica )(Cao and
Russell, 1997)和水稻(Zhang et al., 1999)等植物中分
离出了生活的卵细胞。其中, 利用玉米卵细胞进行的离
体受精最先获得成功并进行了许多开创性的受精机理研
究(田惠桥, 2003; Wang et al., 2006)。然而, 有关葱
属植物卵细胞的分离尚未见报道。葱卵细胞的分离克
服了探索离体受精作用机理的主要障碍。
2.2 分离卵细胞的最佳筛选条件
葱的子房中有6个胚珠。每次取5朵花的30个胚珠进
行操作易于统计。虽然在不含酶的溶液中也可以将外
珠被剥掉, 但费时费力, 不易操作。 在适当的酶液中, 葱
胚珠的外珠被与内珠被之间易于分开, 再通过吸管的吸
打, 外珠被易被剥离。在剥离外珠被的过程中, 所使用
酶的成分很重要, 尤其是Pectolyse Y-23非常关键, 若
不加此酶, 即使有其它酶成分, 外珠被仍不能被彻底酶
解。但是, 倘若该酶的浓度大于 0.5%, 在外珠被彻底
酶解的同时, 对卵器细胞也会造成较大的伤害, 致使在以
347菅明霞等: 葱卵细胞的分离
图 1 葱卵器细胞的分离
(A) 去掉外珠被的胚珠, 可以看到胚囊的轮廓, 黑线示解剖胚珠时的切割部位(Bar=100 mm); (B) 开花当天的卵器三细胞(Bar=10 mm);
(C) 开花后 1天的卵器三细胞, 2个助细胞开始出现体积差异(Bar=10 mm); (D) 开花后 3天的卵器三细胞, 2个助细胞的体积比卵细胞大,
且 2个助细胞之间的体积差异也非常明显(Bar=10 mm); (E) 卵器三细胞(Bar=10 mm); (F) 卵器三细胞的荧光素二醋酸酯(FDA)检测证明
其具有活性(Bar=10 mm); (G) 分离出的卵细胞(Bar=10 mm); (H) 卵细胞的FDA检测证明其具有活性(Bar=10 mm); (I) 用显微操作仪收集
分离的卵细胞(箭头)(Bar=10 mm); (J) 收集的5个卵细胞(Bar=10 mm)
S: 助细胞; E: 卵细胞
Figure 1 Isolation of egg cells from Allium fistulosum
(A) An ovule taken off outer integument displayed the profile of an embryo sac. The dark line indicates the cut position during
dissection (Bar=100 mm); (B) Three cells of egg apparatus isolated from an ovule at anthesis (Bar=10 mm); (C) Three cells of egg
apparatus isolated from an ovule at 1 day after anthesis; Two synergids (S) displayed the size difference (Bar=10 mm); (D) Three
cells of egg apparatus isolated from an ovule at 3 day after anthesis; Two synergids (S) were bigger than egg cell (E), and the
difference of size of both synergids became more (Bar=10 mm); (E) Three cells of an isolated egg apparatus (Bar=10 mm); (F) The
viability of isolated three cells of egg apparatus evaluated by fluorescein diacetate (FDA) reaction (Bar=10 mm); (G) An isolated egg
cell (Bar=10 mm); (H) The viability of isolated egg cell evaluated by FDA reaction (Bar=10 mm); (I) Collecting an egg cell (arrow)
using a micromanipulator (Bar=10 mm); (J) Five collected egg cells (Bar=10 mm)
S: Synergid; E: Egg cell
348 植物学报 44(3) 2009
后卵细胞的分离过程中, 挤压出来的卵细胞(或助细胞)很
容易破裂。通过筛选, 发现以0.2%的Pectolyse Y-23
结合其它纤维素酶和果胶酶对葱卵细胞的分离最为有利
(表1)。卵细胞分离率的高低也与酶液中其它酶成分的
比例有关: 当纤维素酶(cellulase)RS浓度过高时, 就会
使卵器与内珠被细胞之间、卵细胞与助细胞之间发生
粘连, 在分离3个卵器细胞的过程中易造成卵细胞的破
裂; 而半纤维素酶(hemi-cellulase)则与内珠被的最外层
细胞酶解有关, 没有半纤维素酶或其浓度过低, 常会使
内珠被外膜很难被解剖针切开, 进而也影响卵细胞的分
离效果。
另外, 酶液和分离液中的渗透压也是影响卵细胞分
离效果的一个重要因素。在较低的渗透压中(8%甘露
醇), 从切口逸出的卵器细胞很快膨大且容易破裂。从
这些低渗溶液中分离出的卵细胞在活性检测中, 具有生
活力的时间也很短。在6%甘露醇溶液中, 很难分离出
卵细胞。当酶液和分离液中的渗透压较高时, 卵细胞则
不易逸出切破的胚囊, 即使有少数逸出, 卵器细胞也常出
现萎缩变形等现象, 它们具有生活力的时间同样很短。
结合卵器细胞的分离效果以及分离卵细胞的生活状态,
我们认为在酶液和分离液中加入10%的甘露醇最为适
宜。在最佳的分离条件下, 2个小时内可从 30个胚珠
中分离到最多18个卵细胞(60%)(表1)。如此高的卵细
胞分离效率为利用分子生物学方法研究卵细胞发育机理
创造了先决条件。
胚囊中的配子体细胞被包围在层层体细胞组织中,
不易直接观察。过去曾对受精前后的卵细胞做了大量
的超微结构观察, 从卵细胞的结构变化特征获得了一些
有关高等植物受精机理方面的信息。但是通过切片进
行超微结构观察所得结论具有一定的滞后性和片面性。
例如, 以前在多种植物中均发现受精后合子有一个收缩
的过程, 但也有人怀疑这种现象是在制样的脱水过程中
人为造成的。后来, 用离体受精方法对玉米(Kranz and
Lörz, 1993; Antoine et al., 2000)和小麦(Kumlehn et
al., 1998)分离的卵细胞受精后的人工合子定点追踪观
察, 证实了合子收缩现象是真实的。在对韭菜的胚胎学
观察中, 曾发现胚囊中2个助细胞的体积有差异(田惠桥
和杨弘远, 1991), 但因为是切片制样, 观察的是切片二
维图像, 鉴于不同的角度对切片的观察结果会有很大影
响, 因此难以得出确切的结论。在本实验中, 利用分离
表 1 酶液和分离液的成分及卵细胞分离效果
Table 1 The effect of enzymic component in enzymic solution and isolating solution on the isolating ration of egg cells
Enzymic solution Isolating solution
Pectolyse Pectinase Cellulase Hemi- Mannitol CaCl2 Bovine Mannitol
Ratio of
Y-23 (Serva) RS cellulase (%) (%) serum (%)
egg cells
(%) (%) (%) (%) albumin (%)
0 0 0 0 6 0.2 1 6 0
0 0.8 0.8 0.5 6 0.2 1 6 0
0 1.2 1.2 1 8 0.4 1 8 2/30
0.2 0 1.2 1 8 0.4 1 8 3/30
0.2 0.8 0.8 0.5 10 0.4 1.2 10 18/30
0.2 0.8 0.8 0 10 0.2 1 10 8/30
0.2 1.2 0 0.5 12 0.2 1.2 12 10/30
0.5 0 1.2 1 8 0.4 1 8 9/30
0.5 0.8 0.8 0.5 10 0.4 1.2 10 16/30
0.5 0.8 0.8 0 10 0.2 1 10 11/30
0.5 1.2 0 0.5 11 0.2 1.2 11 8/30
0.8 0 1.2 1 10 0.4 1 10 7/30
0.8 0.8 0.8 0.5 10 0.4 1.2 10 9/30
0.8 0.8 0.8 0 11 0.2 1 11 6/30
0.8 1.2 0 0.5 11 0.2 1.2 11 5/30
349菅明霞等: 葱卵细胞的分离
的方法发现, 2个成熟的助细胞呈现出体积差异, 证实了
2个助细胞的体积差异是一种发育的结果。这就提出了
一个有趣的问题: 在被子植物蓼型胚囊中的2个助细胞
通常一个退化, 接受花粉管, 另一个则保持不退化, 为宿
存助细胞。那么, 当2个助细胞出现差异时, 花粉管是
经过哪个助细胞进入胚囊的？花粉管进入助细胞是随机
的, 还是有一个预定的程序？目前, 对这一问题尚未见报
道, 值得进一步研究。
参考文献
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350 植物学报 44(3) 2009
Isolation of Egg Cells from Allium fistulosum
Mingxia Jian, Yanan Zhang, Yaying Wang, Huiqiao Tian*
School of Life Sciences, Xiamen University, Xiamen 361005, China
Abstract Viable egg cells of Allium fistulosum were isolated by enzymatic digestion and mechanical dissection. The ovules were
incubated in an enzymatic solution containing 0-0.8% pectolyse Y-23, 0-1.2% pectinase (Serva), 0-1.2% cellulase (Onozuka RS),
0-1% hemicellulase (Sigma) and 6%-12% mannitol for 20-40 min to remove the outer integument. Then ovules were transferred
into an isolating solution without enzymes for mechanical dissection. The ovules were cut from the middle part, and the micropylar
part was gently extruded by use of a dissection needle. In general, the three cells of the egg apparatus spilled out from the cut end
of the ovule. The enzymatic solution containing 0.2% pectolyse Y-23, 0.8% pectinase (Serva), 0.8% cellulase (Onozuka RS), 0.5%
hemicellulase (Sigma) and 10% mannitol was best for isolating about 18 egg cells from 30 ovules in 2 h. The isolated egg cells could
be used for in vitro fertilization to explore the fertilization mechanism and for egg development with molecular biological methods.
Key words All ium fistulosum , egg cell, isolation
Jian MX, Zhang YN, Wang YY, Tian HQ (2009). Isolation of egg cells from All ium fistulosum . Chin Bull Bot 44, 345-350.
* Author for correspondence. E-mail: hqtian@xmu.edu.cn
(责任编辑: 孙冬花)