全 文 ：植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2010, 45 (5): 579–587, www.chinbullbotany.com
doi: 10.3969/j.issn.1674-3466.2010.05.007

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收稿日期: 2009-12-08; 接受日期: 2010-03-30
基金项目: 973计划前期项目(No.2007CB116211)、国家自然科学基金(No.30771755和No.30972401)和安徽省自然科学基金(No.09041-
1006)
* 通讯作者。E-mail: xiatao62@126.com; gaolp62@126.com
茶树实时荧光定量PCR分析中内参基因的选择
孙美莲1, 王云生2, 杨冬青1, 韦朝领1, 高丽萍2*, 夏涛1*, 单育1, 骆洋2
1安徽农业大学农业部茶叶生物化学与生物技术重点实验室, 合肥 230036
2安徽农业大学生命科学学院, 合肥 230036
摘要 选择合适的内参基因是提高实时荧光定量PCR分析(qRT-PCR)准确性的先决条件。该文以茶树(Camellia sinensis)
芽、叶、幼根、嫩茎、花瓣、种子和愈伤组织为材料, 应用实时荧光定量PCR技术, 分析了18S rRNA、GAPDH、β-actin
和α-tubulin 4个常用内参基因在茶树不同器官组织中的表达情况。经GeNorm和NormFinder软件分析发现, 当利用荧光定
量PCR分析比较茶树不同器官组织中的基因表达差异时, 可选择β-actin作为校正内参基因; 而比较不同成熟度的叶片和愈
伤组织时, 可以选择GAPDH作为校正内参基因。
关键词 茶树, 实时荧光定量PCR, 内参基因
孙美莲, 王云生, 杨冬青, 韦朝领, 高丽萍, 夏涛, 单育, 骆洋 (2010). 茶树实时荧光定量PCR分析中内参基因的选择. 植
物学报 45, 579–587.
实时荧光定量PCR(real time fluorescence qua-
ntitative PCR, qRT-PCR)实现了聚合酶链式反应技
术(polymerase chain reaction, PCR)从定性到定量
的飞跃, 具有重复性好、灵敏度高、定量准确、速度
快等优点, 已成为分子生物学研究中分析基因表达的
重要工具(Heid et al., 1996; Haller et al., 2004;
Ransbotyn and Reusch, 2006; Yoo et al., 2009)。
qRT-PCR技术不仅应用于转基因产品的检测(Libault
et al., 2008), 而且在医药等许多领域中也得到广泛
应用 (Boxus et al., 2005; Chain et al., 2005;
Etschmann et al., 2006)。利用qRT-PCR方法计算基
因相对表达量时, 通常需引入一个表达较为稳定的管
家基因作为内参基因 (reference gene)(吴文凯等 ,
2009)。在植物学研究中, 常用的稳定表达的管家基
因有甘油醛-3-磷酸-脱氢酶(glyceraldehyde-3-phos-
phate dehydrogenase, GAPDH)基因(Sekalska et
al., 2006)、肌动蛋白基因(actin)(Li et al., 2005; Wil-
liams et al., 2005; Domoki et al., 2006)、微管蛋白基
因 (tubulin)(Jeong et al., 2006)和 18S rRNA等
(Bustin, 2000)。理想化的内参基因应在各种类型的组
织、细胞和各种实验因素条件下均恒定表达。然而, 近
年来大量的研究结果表明, 并没有表达绝对稳定的基
因, 任何一种管家基因的所谓恒定表达都只是在一定
类型的细胞或实验因素作用下“有范围”的恒定
(Andersen et al., 2004; 张艳君等, 2007)。随着对定
量要求的不断提高, 为了得到更可靠的实验结果, 实
验中需要选择较为合适的1个或多个内参基因进行
校正。
茶树(Camellia sinensis (L.) O. Kuntze)中含有
丰富的次生代谢产物, 如多酚类物质、生物碱、维生
素、多糖、挥发油和矿物质(Hertog et al., 1993; Park
et al., 2004), 具有抗氧化、抗菌、抗病毒和抗过敏等
一系列药理功能(Cabrera et al., 2006; Ho et al.,
2009; Ko et al., 2009)。目前, 利用分子生物学研究
手段揭示茶树次生代谢途径及其调控机理已成为研
究热点(Zaprometov and Zagoskina, 1987; Matsu-
moto et al., 1994; Takeuchi et al., 1994; Park et al.,
2004; 夏涛和高丽萍, 2009)。马春雷(2007)以β-actin
为内参基因对茶树中类黄酮合成相关的7个基因进行
了RT-PCR表达分析。此外, 利用qRT-PCR技术开展
·技术方法·
580 植物学报 45(5) 2010
茶树基因的表达水平分析已有报道 , 如赵丽萍等
(2006)以茶树鲜叶为材料, 对与茶叶香气密切相关的
2个基因进行定量表达分析。但目前有关茶树内参基
因选择的研究国内外鲜见报道。本文以茶树不同组织
(芽、叶、幼根、嫩茎、花瓣、种子和愈伤组织)为材
料, 利用qRT-PCR技术开展18S rRNA、GAPDH、
β-actin和α-tubulin 4个内参基因的表达量分析, 并利
用GeNorm(Vandesompele et al., 2002)和Norm-
Finder(Andersen et al., 2004)分析软件对4个内参基
因在茶树各器官中的表达变化进行比较分析, 以期筛
选出表达最稳定的内参基因, 为进一步开展茶树次生
代谢的分子生物学研究奠定方法学基础。
1 材料与方法
1.1 材料
本研究以茶树(Camellia sinensis (L.) O. Kuntze)的
芽、叶、幼根、嫩茎、花瓣、种子和愈伤组织为材料。
其中, 茶树的芽、叶、幼根、嫩茎、花瓣和种子采自
安徽农业大学试验茶园; 茶树愈伤组织为本实验室筛
选的“云茎63Y”, 外植体为云南大叶种的嫩茎。样
品采集后液氮速冻, –80°C贮藏备用。
1.2 总RNA的提取
利用改良的CTAB法(史成颖等, 2007)提取茶树芽、叶
的总RNA; 利用本课题组改进的简易CTAB-LiCl法提
取茶树幼根、嫩茎、花瓣、种子和愈伤组织的总RNA。
简易CTAB-LiCl法操作步骤如下: 取适量材料于液氮
中研磨成粉末(研磨时加入少量PVPP), 迅速转移至
加有0.9 mL CTAB提取液和45 μL β-巯基乙醇的离心
管中; 充分混匀, 于65°C水浴30分钟, 间歇颠倒混
匀; 4°C、12 000×g离心10分钟; 吸上清液于新的预
冷离心管中; 加入等体积的酚:氯仿:异戊醇(25:24:1,
v/v/v), 温和混匀, 于4°C冰箱中放置10分钟, 4°C、
12 000 × g离心10分钟, 吸上清液于新的预冷离心管
中(注意不能吸取到中间层); 重复上一步; 加入等体
积的氯仿:异戊醇(24:1, v/v), 温和混匀, 4°C、12 000
×g离心15分钟 , 吸取上清液于新的预冷离心管中 ,
加入1/3体积的8 mol·L–1 LiCl, 再加入占总体积1%的
β-巯基乙醇; 混匀, 于–20°C放置过夜; 4°C、13 000
× g离心30分钟, 弃液相, 沉淀用75%乙醇洗涤2次;
干燥后溶于30 μL DEPC-H2O中, –80°C保存备用。利
用核酸定量仪和琼脂糖凝胶电泳检测总RNA质量。
1.3 反转录合成cDNA第一链
按照RevertAidTM First-Strand cDNA Synthesis Kit
试剂盒(Fermentas公司)操作方法, 将各样品总RNA
反转录合成cDNA第一链。获得的cDNA产物直接用于
PCR或–20°C贮藏备用。
1.4 PCR引物设计
根据定量PCR引物的设计原则, 利用Primer Premier
5.0软件, 分别设计18S rRNA、GAPDH、β-actin和
α-tubulin 4个内参基因的定量PCR引物。引物序列见
表1, 由英骏生物技术有限公司合成。
1.5 目的基因片段的普通PCR扩增
PCR反应体系中分别加入2.5 μL 10×PCR buffer、1.5
µL 25 mmol·L–1 MgCl2、0.5 μL 10 mmol·L–1 dNTPs、
0.5 μL 10 µmol·L–1 forward primer、0.5 μL 10


表1 Real-time RT-PCR检测中所用的4个内参基因的引物序列
Table 1 Primer sequences of four reference genes used in real-time RT-PCR analysis
Gene name Gene
symbol
Forward primer (5’–3’) Reverse primer (5’–3’) Amplicon
size (bp)
Ribosomal RNA 18S 18S rRNA CGGCTACCACATCCA-
AGGAA
GCTGGAAT-
TACCGCGGCT
191
Glyceraldehyde-3-
phosphate dehydrogenase
GAPDH TTGGCATCGTTGAGG-
GTCT
CAGTGGGAACACG-
GAAAGC
206
Beta actin β-actin GCCATCTTTGATTGGAATGG GGTGCCA-
CAACCTTGATCTT
175
Tubulin alpha α-tubulin TCCAAACTAACCTTG-
TGCCATAC
ACACCCTTGGGTAC-
TACATCTCC
220
孙美莲等: 茶树实时荧光定量 PCR分析中内参基因的选择 581
µmol·L–1 reverse primer、0.2 μL 5 U·μL–1 Taq和1 μL
模板, 加无菌水补至总体积25 μL。反应条件为: 95°C
预变性3分钟; 95°C变性30秒, 62°C退火30秒, 72°C
延伸30秒, 40个循环; 72°C延伸7分钟。用1.2%琼脂
糖凝胶电泳检测扩增产物。
1.6 内参基因的荧光定量PCR分析
在荧光定量PCR管(TLS-0851, BIO-RAD公司)中加
入10 µmol·L–1 forward和reverse引物各0.4 µL、生物
用水8.2 µL和TaKaRa PCR Master mix(大连宝生物
SYBR Green Realtime PCR Master Mix) 10 µL。各
反应管中加入待测样品cDNA各1 µL, 总反应体系为
20 µL, 每个样品重复3次。反应条件为: 95°C预变性
30秒; 95°C变性5秒, 62°C退火30秒, 40个循环。然后
进行55–95°C的熔解曲线分析, 荧光波长为FAM 490
nm。完成上述步骤后, 把加好样品的定量PCR专用反
应管放在icycler real-time quantity PCR仪(BIO-RAD
公司)上进行反应。数据读取由荧光定量PCR仪自动
完成。
1.7 数据处理和分析
根据公式Q=E△Ct, 利用Excel 2003对每个扩增样品
的Ct值计算各基因的相对表达量Q。其中E为基因扩
增效率(一般情况下将基因扩增设为理想扩增, 扩增
效率E默认为2), △Ct=Ctmin–Ct样品(Ctmin为所有样品中
最低的Ct值 , Ct样品为每个样品的Ct值 )(李钱峰等 ,
2008; 吴文凯等, 2009)。
根据4个常用内参基因在茶树不同器官组织中计
算得到的相对表达量, 利用GeNorm软件(http://med-
gen.ugentbe/~jvdesomp/genorm)和 NormFinder软
件 (http://www.mdl.dk/publicationsnormfinder.htm),
对各个管家基因的表达稳定性进行统计学分析, 从而
筛选出最优的内参基因。
2 结果与讨论
2.1 RNA样品的质量检测
琼脂糖凝胶电泳(图1)和核酸定量检测结果(表2)显示,
茶树各器官总RNA电泳图谱带型清晰, 28S rRNA的
亮度约为18S rRNA亮度的2倍, A260/A280为2.0左右,
A260/A230>2.0, 平均得率为1 792.2 ng·µL–1。表明茶
树各器官总RNA提取质量高, 可用于后续的分子生
物学分析。
2.2 内参基因片段的RT-PCR扩增
以芽组织总RNA为模板RT-PCR扩增各内参基因片
段, 经琼脂糖凝胶电泳结果显示(图2), 在100–250
bp之间均存在较亮的特异条带, 与引物设计的预期
片段大小一致。说明扩增反应具有较高的专一性, 可



图1 茶树不同组织总RNA提取的琼脂糖凝胶电泳检测
1: 芽; 2: 第1叶; 3: 第2叶; 4: 第3叶; 5: 第4叶; 6: 幼根; 7: 嫩
茎; 8: 花瓣; 9: 种子; 10: 暗培养的愈伤组织; 11: 光照处理的
愈伤组织

Figure 1 Agarose gel analysis of total RNA extracted from
different tissues of tea plant
1: Bud; 2: First leaf; 3: Second leaf; 4: Third leaf; 5: Fourth
leaf; 6: Young roots; 7: Stem; 8: Petals; 9: Seeds; 10: Callus
cultivated under darkness; 11: Callus cultivated under light


表2 茶树不同组织总RNA提取质量的比较
Table 2 Comparison of the quality of total RNA extracted
from different tea tissues
Tissues A260/A280 A260/A230 Yield
(ng·µL–1)
Bud 2.04 2.34 2 735.9
First leaf 2.02 2.31 2 924.2
Second leaf 2.01 2.33 2 328.3
Third leaf 1.95 2.15 3 807.5
Fourth leaf 2.04 2.26 2 094
Young roots 2.03 2.32 1 414.4
Stem 2.01 2.41 837.7
Petals 2.02 2.33 669.8
Seeds 1.97 2.25 1 482.6
Callus cultivated
under darkness
2.03 2.45 745.2
Callus cultivated
under light
2.01 2.41 674.3
582 植物学报 45(5) 2010


图2 茶树内参基因RT-PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测
M: DNA marker; 1: 18S rRNA; 2: GAPDH; 3: α-tubulin; 4:
β-actin

Figure 2 Agarose electrophoresis analysis of the RT-PCR
products of reference genes in tea plant
M: DNA marker; 1: 18S rRNA; 2: GAPDH; 3: α-tubulin; 4:
β-actin


用于荧光定量PCR分析。
2.3 内参基因的荧光定量PCR分析
以茶树不同材料来源的第一链cDNA为模板, 进行实
时荧光定量PCR分析。结果表明(图3), 4个内参基因
引物来源的各材料的熔解曲线都只有明显的单一峰,
说明所用引物都能特异性地扩增各内参基因的相应
产物, 不存在引物二聚体, 且每个待测样品的PCR扩
增曲线的重复性也非常好, 说明实时荧光定量PCR
的结果是准确可信的。
2.4 内参基因的选择
为了筛选合适的内参基因, 采用GeNorm软件对各内
参基因的相对表达量Q进行统计分析。结果表明(图4),
茶树不同材料中4种内参基因的表达稳定性各异, 当
以不同组织(芽、第1叶、第2叶、第3叶、第4叶、幼
根、嫩茎、花瓣、种子和愈伤组织)为材料时, β-actin、
GAPDH、18S rRNA和α-tubulin表达稳定度的平均值
M依次为0.860、0.860、1.078和1.543, 即表达稳定
度由高到低的排序为β-actin=GAPDH＞18S rRNA＞
α-tubulin。当以不同叶片(第1叶、第2叶、第3叶和第
4叶 )为材料时 , β-actin、GAPDH、18S rRNA和
α-tubulin表达稳定度的平均值M依次为0.860、0.345、
0.667和 0.345, 表达稳定度由高到低排序为
GAPDH=α-tubulin＞18S rRNA＞β-actin。当以愈伤
组织(暗培养的愈伤组织和光照处理的愈伤组织)为材
料时, β-actin、GAPDH、18S rRNA和α-tubulin表达
稳定度的平均值M依次为0.534、0.059、1.049和
0.059, 表达稳定度由高到低排序为 GAPDH=
α-tubulin＞β-actin＞18S rRNA。
同样, NormFinder计算结果表明(表3), 当以不
同组织(芽、第1叶、第2叶、第3叶、第4叶、幼根、
嫩茎、花瓣、种子和愈伤组织)为材料时, β-actin表达
稳定值最小, 是最优的内参基因。当以不同叶片(第1
叶、第2叶、第3叶和第4叶)为材料时, GAPDH表达稳
定值最小, 是最优的内参基因。当以愈伤组织(暗培养
的愈伤组织和光照处理的愈伤组织 )为材料时 ,
GAPDH表达稳定值最小, 是最优的内参基因。以上2
种不同算法所得的结果基本吻合, 即当利用荧光定量
PCR分析比较茶树不同器官组织的基因表达差异时,
可选择β-actin作为校正内参基因; 而比较不同成熟度
的叶片和愈伤组织时, 可以选择GAPDH作为校正内
参基因。


表3 通过NormFinder软件分析获得的候选内参基因在茶树不同组织中的表达稳定值(S)排序
Table 3 The ranking order of the expression stability value (S) of candidate reference genes in different tissues of tea plant
calculated by NormFinder
Ranking order 1 2 3 4 Best gene
A β-actin (S=0.298) GAPDH (S=0.375) 18S rRNA (S=0.874) α-tubulin (S=1.302) β-actin
B GAPDH (S=0.120) α-tubulin (S=0.120) β-actin (S=0.680) 18S rRNA (S=0.684) GAPDH
C GAPDH (S=0.020) α-tubulin (S=0.020) β-actin (S=0.780) 18S rRNA (S=1.068) GAPDH
A: 不同组织(芽、第1叶、第2叶、第3叶、第4叶、幼根、嫩茎、花瓣、种子、愈伤组织); B: 不同叶片(第1叶、第2叶、第3
叶、第4叶); C: 愈伤组织(暗培养的愈伤组织、光照处理的愈伤组织)
A: Different tissues (bud, first leaf, second leaf, third leaf, fourth leaf, young roots, stem, petals, seeds, callus); B: Different leaves
(first leaf, second leaf, third leaf, fourth leaf); C: Callus (callus cultivated under darkness, callus cultivated under light)

孙美莲等: 茶树实时荧光定量 PCR分析中内参基因的选择 583

图3 茶树不同组织中4个内参基因的real-time PCR 扩增曲线(左)和熔解曲线(右)
(A) 18S rRNA; (B) GAPDH; (C) β-actin; (D) α-tubulin 右图中曲线a和b分别代表荧光强度曲线(Rn)和荧光强度与温度变化对数曲
线(dF/dT)

Figure 3 Real-time PCR amplification curves (left) and melting curves (right) of four reference genes in different tissues of tea plant
(A) 18S rRNA; (B) GAPDH; (C) β-actin; (D) α-tubulin Melting curve a and b represented the fluorescence curves (Rn) and the
logarithmic curve of fluorescence changing against temperature (dF/dT), respectively.
584 植物学报 45(5) 2010


图4 GeNorm软件分析获得的各内参基因在茶树不同组织中
的表达稳定值(M)
(A) 不同组织(芽、第1叶、第2叶、第3叶、第4叶、幼根、嫩茎、
花瓣、种子、愈伤组织); (B) 不同叶片(第1叶、第2叶、第3叶、第
4叶); (C) 愈伤组织(暗培养的愈伤组织、光照处理的愈伤组织)

Figure 4 Expression stability values (M) of reference genes
in different tissues of tea plant calculated by GeNorm
(A) Different tissues (bud, first leaf, second leaf, third leaf,
fourth leaf, young roots, stem, petals, seeds, callus); (B)
Different leaves (first leaf, second leaf, third leaf, fourth leaf);
(C) Callus (callus cultivated under darkness, callus cultivated
under light)
2.5 讨论
实时荧光定量PCR技术已成为分子生物学研究的重
要工具。在植物研究中, Shimada等(2003)利用实时
定量PCR技术对包括油菜素内酯(BR)合成、分解信号
转导相关基因在内的8个基因的表达进行了分析。
Philippar等(2003)分析了玉米(Zea mays)叶片表皮、
微管组织中钾离子通道编码基因的表达方式。目前在
茶树中实时定量PCR技术的应用相对较少, 赵丽萍
等(2006)利用该技术, 分析了茶树新梢不同叶片中β-
葡萄糖苷酶和β-樱草糖苷酶基因的表达。为了获得更
准确、可靠的实时荧光定量PCR结果, 除了需要合理
的实验与引物设计之外, 实验过程中的每一步要求都
很严格, 包括RNA的提取质量、聚合酶的扩增效率、
cDNA的合成以及PCR准备过程中的准确操作和防止
污染等(Vandesompele et al., 2002)。此外, 选择合
适的内参基因也是极其重要的一个环节。由于内外环
境的影响, 在细胞中真正恒定表达的基因并不存在。
Jain等(2006)通过对水稻(Oryza sativa)中10个常用
内参基因的考察, 发现UBQ5和eEF-1α在不同组织中
的表达比较一致, 18S和25S rRNA在不同环境处理下
表达较为稳定。李钱峰等(2008)研究了7个常用的管
家基因在水稻不同品种中的应用, 发现各基因在品种
间的表达差异并不相同, eEF-1α和ACT1具有最为稳
定的表达, 而UBC则表达最不稳定。Nicot等(2005)
以马铃薯(Solanum tuberosum)为材料, 分析了7个
常用的管家基因, 发现ef1α是表达最稳定的内参基
因。Hu等(2009)研究了7个常用的管家基因和7个候选
管家基因在大豆 (Glycine max)中的应用 , 发现
SKIP16、UKN1和UKN2是所有样品中最稳定的内参
基因。由此可见, 在实际研究中内参基因只是在细胞
处于特定条件下相对稳定表达(Suzuki et al., 2000;
Lee et al., 2002; Boxus et al., 2005)。已有报道在拟
南芥(Arabidopsis thaliana)等一些重要模式生物中,
可以利用全基因组搜索并经过实验验证来获取可靠
的内参基因(Czechowski et al., 2005)。
从本文对茶树不同组织中4个常用内参基因的表
达分析可以看出, 并没有一个基因在所有的条件下都
稳定表达。以不同组织(芽、第1叶、第2叶、第3叶、
第4叶、幼根、嫩茎、花瓣、种子和愈伤组织)为材料,
β-actin基因表达相对稳定。以不同叶片(第1叶、第2
孙美莲等: 茶树实时荧光定量 PCR分析中内参基因的选择 585
叶、第3叶和第4叶)以及愈伤组织(暗培养和光照处理)
为材料, GAPDH基因表达相对稳定。根据GeNorm和
NormFinder软件分析可以看出, 两者所得的结果基
本吻合, 这也在一定程度上说明实验筛选出的内参基
因较为可靠。本研究为开展茶树功能基因表达分析奠
定了方法学基础。
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孙美莲等: 茶树实时荧光定量 PCR分析中内参基因的选择 587
Reference Genes for Real-time Fluorescence Quantitative PCR in
Camellia sinensis
Meilian Sun1, Yunsheng Wang2, Dongqing Yang1, Chaoling Wei1, Liping Gao2*,
Tao Xia1*, Yu Shan1, Yang Luo2
1Key Laboratory of Tea Biochemistry and Biotechnology, Ministry of Agriculture, Anhui Agricultural University, Hefei 230036,
China; 2School of Biology Science, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China
Abstract The selection of a suitable reference gene is an important prerequisite for successful gene expression analysis
by real-time fluorescence quantitative PCR (qPCR). We investigated the expression stability of 4 endogenous candidate
genes (18S rRNA, GAPDH, β-actin and α-tubulin) in qPCR experiments in different organs and tissues, including buds,
leaves, young roots, stem, petals, seeds, and callus, of the tea plant Camellia sinensis (L.) O. Kuntze. The analysis with
GeNorm and NormFinder algorithms revealed that β-actin could be used as a reference gene for organs and tissues and
GAPDH for mature leaves and callus.
Key words Camellia sinensis, real-time fluorescence quantitative PCR, reference genes
Sun ML, Wang YS, Yang DQ, Wei CL, Gao LP, Xia T, Shan Y, Luo Y (2010). Reference genes for real-time fluores-
cence quantitative PCR in Camellia sinensis. Chin Bull Bot 45, 579–587.
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* Author for correspondence. E-mail: xiatao62@126.com; gaolp62@126.com
(责任编辑: 刘慧君)