全 文 ：植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2010, 45 (6): 679–688, www.chinbullbotany.com
doi: 10.3969/j.issn.1674-3466.2010.06.005

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收稿日期: 2010-05-24; 接受日期: 2010-07-05
基金项目: 973计划(No.2007CB108901)
* 通讯作者。E-mail: chenlimeikm@126.com
铝胁迫下柱花草SSH文库构建及表达序列标签分析
王奇峰1, 易琼1, 李昆志1, 陈丽梅1*, 玉永雄2
1昆明理工大学生命科学与技术学院生物工程技术研究中心, 昆明 650224
2西南大学动物科技学院, 重庆 400716
摘要 柱花草栽培种热研2号(Stylosanthes guianensis ‘Reyan 2’)对铝毒有较强的耐受性。为了鉴定其在铝胁迫下的诱导
基因, 利用抑制消减杂交(SSH)技术构建在300 μmol·L–1铝胁迫下正向cDNA文库。挑选插入片段大于300 bp的600个克隆
进行测序, 共获得504条表达序列标签(EST)。序列重复性分析表明, 其中12.1%的EST只有1次重复, 61.4%的EST有2–16
次重复, 重复出现次数较高的EST是细胞色素P450(53次, 占10.5%)、病原诱导型胰蛋白酶抑制剂(44次, 占8.7%)和衰老相
关蛋白(37次, 占7.3%)。BLASTX分析显示, 504条EST中有97种非冗余基因, 其中包括46条功能已知基因和51条功能未知
序列。46条功能已知EST中有30个为已报道铝胁迫相关基因, 16个是新发现的铝胁迫相关基因。SSH cDNA文库提供的信
息为阐明柱花草耐铝毒的分子机制提供了重要线索。
关键词 铝胁迫, cDNA文库, 表达序列标签, 柱花草, 抑制消减杂交
王奇峰, 易琼, 李昆志, 陈丽梅, 玉永雄 (2010). 铝胁迫下柱花草SSH文库构建及表达序列标签分析. 植物学报 45, 679–
688.
铝是地壳中含量最丰富的金属元素, 在中性或弱
酸性环境中, 铝主要以固定态的硅酸盐及氧化物的形
态存在于土壤中。当土壤pH值低于5时, 铝从硅酸盐
或氧化物中释放出来溶解到土壤中, 抑制根的生长和
发育, 从而影响植物的生长和作物的产量(Kochian,
1995)。全世界约有50%的耕地为酸性土壤, 我国酸
性土壤主要分布在南方15个省区, 约占全国耕地的
21%。在酸性土壤中, 铝是主要的毒害因子。农业上
通常用大量施用生石灰来解除铝毒害, 然而这种方法
只对表层土壤有效, 对深层土壤的酸化却没有实质性
的影响, 而且成本高, 对环境污染严重。因此, 在改
良土壤的同时, 充分挖掘利用植物的潜力, 通过遗传
改良来获得抗铝毒能力较强的植物品种, 是解决酸性
土壤中铝毒害的一个有效途径 (严小龙和张福锁 ,
1997)。
在进化过程中, 很多适应酸性土壤生长的植物都
有耐铝毒的机制, 迄今为止对植物耐铝毒的生理机制
已进行了广泛的研究。研究结果表明, 植物耐铝毒的
生理作用主要有外部排斥机制和内部解毒机制。外部
排斥机制包括铝诱导有机酸分泌 (Koyama et al.,
1999; Ma, 2000)和根际pH值的升高(Wenzl et al.,
2001)等。内部解毒机制是利用有机酸在共质体中螯
合铝离子从而赋予植物对铝的耐受能力 (Delhaize
and Ryan, 1995)。植物抗铝毒特性的遗传学实质是
植物在土壤铝毒胁迫下, 由于某些基因受到诱导表达
或DNA序列的特定改变从而导致其在形态、表型或一
些生理、生化特征上的适应性改变, 增加植物对土壤
铝毒的抵御能力, 从而使其获得抗铝毒基因型。目前
蛋白质组学技术和分子生物学技术已被广泛应用于
解释植物耐铝毒的分子机制, 使越来越多的耐铝基因
及蛋白被克隆和鉴定。Yang等(2007)用2D技术从铝
耐受型水稻(Oryza sativa)中共鉴别出17个可能的铝
诱导蛋白。cDNA文库、差异显示PCR(DDRT- PCR)、
cDNA-AFLP、SSH-cDNA差减文库、DNA微阵列等
技术的应用, 为研究者们提供了有效且可行的方法以
确定在铝胁迫下有关基因的差异表达情况。通过使用
这些方法, 使一系列有关铝胁迫响应基因在拟南芥
(Arabidopsis thaliana)(Kumari et al., 2008; Goodwin
·研究报告·
680 植物学报 45(6) 2010
and Sutter, 2009)、小麦(Triticum aestivum)(Guo et
al., 2007)、黑麦(Secale cereale) (Milla et al., 2002)、
甘蔗 (Saccharum officinarum)(Watt, 2003)、大豆
(Glycine max)(Ermolaryev et al., 2003)、水稻(Mao
and Yi, 2004; Zhang et al., 2007)和苜蓿(Medicago
sativa)(Chandran et al., 2008a)等植物中被鉴定。这
些研究为阐明植物耐铝毒的分子机理提供了重要的
思路和线索。
柱花草(Stylosanthes guianensis)又名笔花豆 ,
是热带地区广泛种植的优良豆科牧草, 具有产量高、
质量好、耐旱、耐瘠、耐酸等优点, 被誉为“瘦地克
星”。目前柱花草在海南、广东、广西、福建、贵州
和云南等省区已被推广种植(唐燕琼等, 2009), 并已
成为我国南方热带草业的当家草种, 有力地促进了我
国热带地区草业和畜牧业的发展。Li等(2009)的研究
证明铝诱导根系分泌柠檬酸是柱花草耐铝毒的重要
机制。但目前尚未见柱花草耐铝毒的分子机理方面的
报道。本研究以圭亚那柱花草热研2号为材料, 采用
抑制消减杂交(SSH)技术构建柱花草在铝胁迫下的正
向SSH cDNA文库, 鉴定柱花草在铝胁迫下差异表达
的相关基因, 为揭示柱花草耐铝毒的分子机制和克隆
柱花草耐铝基因奠定基础。
1 材料与方法
1.1 植物材料及培养方法
柱花草热研2号(Stylosanthes guianensis Sw. ‘Re-
yan 2’)种子由广西大学黎晓峰研究室提供; 紫花苜蓿
栽培品种渝苜1号(Medicago sativa L. ‘Yumu 1’)种子
由西南大学玉永雄研究室提供。柱花草和紫花苜蓿种
子用常温去离子水浸种, 之后将种子洗净平铺于垫有湿
润滤纸的培养皿中, 在25°C恒温培养箱中进行催芽、浸
种。种子露白发芽后, 挑选露白一致的种子播在有针眼
孔的薄泡沫板上, 置于盛有营养液的黑色塑料盆中, 于
25°C、每天光照14小时的光照培养箱或培养室中进行漂
浮培养。塑料盆中的营养液每天更换1次。
1.2 铝胁迫下根相对伸长率的测定
当幼苗主根长至1 cm左右时进行铝胁迫处理, 每个
处理用10株苗, 用pH4.5、浓度分别为10、50、100、
200、300和500 μmol·L–1的AlCl3溶液处理24小时; 以
0.5 mmol·L–1CaCl2溶液处理相同时间的样品根的伸
长率作为对照, 处理液在加入AlCl3后用0.1 mol·L–1
HCl调至pH4.5。处理24小时后测定根伸长率。
根伸长率的测定方法: 测量前用油性记号笔在根
基部位进行标记, 作为测量的基点。在处理前后用直
尺测量从标记点到根尖顶端的距离, 并测量未经处理
前后幼苗主根的伸长量, 处理前后2次测量值之差即
为幼苗根的伸长量, 按下式计算根的相对伸长率:
相对伸长率(%)＝处理根伸长量/对照根伸长量
×100%。
1.3 构建SSH文库样品的铝胁迫处理及根的收集
将长势好、15日龄漂浮培养的柱花草幼苗用0.5
mmol·L–1CaCl2溶液(pH4.5)洗根, 去除残留在根系表
面的营养液, 然后置于300 μmol·L–1AlCl3溶液(含0.5
mmol·L–1CaCl2, pH 4.5)中, 于25°C、每天光照14小
时的培养室中分别进行8个时间梯度的铝胁迫处理,
处理时间分别为0.5、2、4、8、12、24、48和72小
时; 对照组用0.5 mmol·L–1CaCl2溶液(pH4.5)于相同
的条件下处理相同的时间。处理结束后收集幼苗的根,
用液氮速冻后置于–80°C备用。
1.4 总RNA的提取和mRNA的分离
将–80°C冷冻材料取出, 在液氮中磨碎, 柱花草根总
RNA用异硫氰酸胍法提取(Liu, 2006)。抽提到的RNA
溶解于DEPC处理水中, 然后用DNase I(Promega)
处理彻底去除基因组DNA, 用苯酚/氯仿抽提, 最后
用乙醇沉淀后重新溶于DEPC处理水中。用琼脂糖凝
胶电泳和酶标仪检测RNA的质量和浓度, mRNA的分
离用基因公司的mRNA分离试剂盒(Oligotex mRNA
Midi Kit), 具体操作步骤按产品说明书进行。分离到
的mRNA用琼脂糖凝胶电泳检测质量, 确认没有核糖
体RNA污染后用于SSH文库的构建。
1.5 SSH文库的构建
利用Clontech公司的PCR-SelectTM cDNA Subtrac-
tion Kit构建SSH cDNA文库。将分离纯化后的mRNA
样品逆转录成cDNA, cDNA第1链的合成用AMV逆转
录酶, 第2链的合成用E. coli 的DNA聚合酶I。以铝胁
迫处理的材料提取的RNA逆转录产生的双链cDNA
(ds cDNA)为实验方(tester), 以CaCl2处理的对照材
王奇峰等: 铝胁迫下柱花草SSH文库构建及表达序列标签分析 681
料提取的RNA逆转录产生的双链cDNA为驱动方
(driver)。纯化实验方和驱动方cDNA, 然后用RsaI完
全酶切, 将酶切后的实验方cDNA一分为二, 分别连
接不同的接头(接头1和接头2R)。连接反应结束后将
实验方cDNA与过量驱动方cDNA进行2轮分子杂交。
杂交产物稀释后, 接着进行2轮特异PCR。对PCR产
物进行T/A克隆, 转化大肠杆菌后挑选1 344个阳性
克隆组成SSH cDNA文库。
1.6 SSH文库克隆插入片段长度的检测和测序
用接头引物1和接头引物2R进行PCR, 扩增SSH文库
中每个克隆的插入片段, 分析克隆插入片段的有无及
大小。挑选插入片段大于300 bp的克隆进行单向测
序, 分析测序结果, 去除序列相同的克隆获得单一的
EST序列。通过BLASTX比对, 将评分高于40的序列
确定为功能已知的EST序列, 与NCBI上所有数据库
均没有相似序列的EST被确定为功能未知的EST序
列。将所有EST序列上传GenBank数据库获得各基因
在基因库中的登录号。
1.7 SSH文库EST基因功能聚类
将具有功能的EST与Uniprot数据库(http://www.unip-
rot.org/)中已知功能的蛋白进行初步分析比较, 并通
过Gene Ontology (GO, http://www.geneon-tology.
org/)数据库进行基因注释, 对所获得的EST进行功能
聚类。
1.8 RT-PCR分析
从聚类基因中随机选择部分基因, 以5.8S rRNA为内
参, 用RT-PCR进行基因表达谱分析。PCR反应使用
的引物序列及其扩增产物的长度见表1。表达谱分析
用的柱花草以300 μmol·L–1的AlCl3分别处理0.5、2、
4、8、12和24小时, 以0.5 mmol·L–1CaCl2溶液(pH4.5)
于相同的条件下处理24小时的柱花草作为对照。处理
结束后收集其根。用Trizol (Invitrogen)试剂提取根的
总RNA, 通过凝胶电泳检测RNA的质量, 经检测合格
后测定RNA的浓度。从各RNA样品中取4 µg样品, 用
M-MLV Reverse Transcriptase (Promega公司)反转
录合成cDNA。PCR反应使用Taq DNA聚合酶(天根公
司)。在20 μL反应体系中, 含有1×PCR缓冲液、200
μmol·L–1dNTP、0.15 μmol·L–1的上游引物和下游引
物、1 UTaq聚合酶和等量第1链cDNA模板, 用水补足
至20 μL。
2 结果与讨论
2.1 柱花草和紫花苜蓿耐铝毒能力的比较
紫花苜蓿是一种对铝毒敏感的豆科牧草。本研究以紫
花苜蓿为对照分析柱花草对铝毒的抵抗能力。铝对植
物的毒害作用最典型的症状表现为对根伸长的抑制
作用, 因此本研究通过测定根的伸长率比较柱花草和
紫花苜蓿耐受铝毒的能力。结果(图1)表明 , 用10
μmol·L–1铝处理柱花草和紫花苜蓿24小时后即可看


表1 RT-PCR分析所用引物序列
Table 1 Primer sequences for RT-PCR analysis
Gene Forward (5’–3’) Reverse (5’–3’) Product size (bp)
5.8S GGCAACGGATATCTCGGC GGTGACACCCAGGCAGGC 151
CYP ACAAGGGGAATCCGACTGTTTA GGAAATCAGAATCAAACGAGC 680
PSP GTTGAATTACTATTGCGATAC TACGAACCGTGAAAGCGTGGC 280
LBG AAATAAGTGTGACATGGTTTG TGAAGATGTTTTCAAATCCGC 370
NAC GGGCAGGTGTCTTCTTCAA GGTTTCACAAATGGGTCTA 370
MAS CTACCACCTTTGCTCACTT CTTCAATACCTCCAACCAT 430
RGR TATTCCTTGAGGCTTCTGC TCTGGTGGCTTTGGATTTT 100
HDZ TATTCCCTAAACTTGAGAATGTTG CTTTTTCTTTCTTTTCTTTTCCTC 360
SHM ACCTAAGCCGCCCAAGAAG TACCAATACGCACTCCTC 400
CYP: 细胞色素P450; PSP: 衰老相关蛋白; LBG: 脂结合糖蛋白家族; NAC: NAC家族转录因子; MAS: 线粒体ATP合酶; RGR: Rheb
GTPase Rhb; HDZ: 同源域亮氨酸拉链蛋白; SHM: 丝氨酸羟甲基转移酶
CYP: Cytochrome P450 like-TBP; PSP: Putative senescence-associated protein; LBG: Lipid-binding serum glycoprotein family protein;
NAC: NAC family transcription factor; MAS: Mitochondrial ATP synthase; RGR: Rheb GTPase Rhb; HDZ: HDZip I protein; SHM: Serine
hydroxymethyltransferase
682 植物学报 45(6) 2010
出两者的根相对伸长率有明显的差异。随着铝浓度的
增加, 两者的差异更为明显。用300 μmol·L–1的铝处
理24小时后柱花草根相对伸长率为32%, 而紫花苜
蓿仅有9%; 在500 μmol·L–1铝胁迫下两者的根都停
止生长。由此证实柱花草对铝的耐受性较强, 而紫花
苜蓿则对铝较为敏感。
2.2 柱花草在铝胁迫下正向SSH cDNA文库的构建
为了鉴定柱花草在高浓度铝胁迫下的诱导基因, 我们
用SSH方法构建柱花草根在300 μmol·L–1铝胁迫下的
正向SSH cDNA文库。消减后的PCR产物用凝胶电泳
检测, 所得产物处于200–1 000 bp之间。通过连接反
应把PCR产物亚克隆于T载体中, 蓝白斑筛选后共挑
出1 344个阳性克隆组成SSH cDNA文库。用PCR扩
增检测文库中各克隆插入cDNA的大小。结果显示,
插入cDNA片段的长度在200–1 000 bp之间, 平均值
约为500 bp。
2.3 SSH cDNA文库克隆的序列分析及基因功能
聚类
随机挑选cDNA插入片段大于300 bp的600个克隆进
行序列测定, 一共得到504条有效的EST序列, 序列
的平均长度为470 bp。为鉴定504条EST序列可能具
有的生物学功能, 用BLASTX将其翻译为所有可能的
开放阅读框, 然后与非冗余蛋白质数据库进行比对。
序列重复性分析结果表明, 12.1%的EST在文库中仅
出现1次, 61.4%的EST有2–16次重复, 重复频率较
高的EST是细胞色素P450 (CYP)(53次, 占10.5%)、
病原诱导型胰蛋白酶抑制剂(pathogen-inducible
trypsin-inhibitor-like protein, PTI)(44次, 占8.7%)和
衰老相关蛋白(PSP)(37次, 占7.3%)。全部504条EST
序列中有97种非冗余基因, 其中46条为功能已知基
因, 51条为功能未知序列。46条已知功能的EST序列
按功能可聚为6个种类(图2)。在这6个种类中, 与代谢
相关的基因是最多的一组(占28.3%), 其次为胁迫与
防御相关基因(占21.7%), 第3类为信号转导和转录
因子相关基因(占17.4%), 第4类为转运蛋白相关基
因(占13%), 第5类为蛋白合成相关基因(占10.7%),
最小一类为细胞结构相关基因(占8.7%)。根据已发表
的文献可知, 在我们构建的文库中有30个为已报道
的铝胁迫相关基因(表2), 16个是尚未报道过的铝胁


图1 不同浓度的铝处理对柱花草和紫花苜蓿根相对伸长率的
影响

Figure 1 The effects of different concentrations of Al
treatment on the relative root growth of Stylosanthes guian-
ensis and Medicago sativa




图2 SSH文库中差异表达基因的功能聚类及分布

Figure 2 Distribution of differentially expressed genes in the
SSH cDNA library


迫相关基因(表3)。
2.4 基因表达谱分析
为了验证SSH cDNA文库数据的有效性, 我们随机挑
选8个EST, 包括CYP、PSP、LBG、NAC、MAS、
RGR、HDZ和SHM, 用RT-PCR分析这些基因在柱花
草受到300 μmol·L–1铝胁迫不同时间的表达谱。结果
证明, 所选的8个基因在铝胁迫下的表达都有不同
王奇峰等: 铝胁迫下柱花草SSH文库构建及表达序列标签分析 683
表2 已知的铝胁迫相关基因
Table 2 Known genes associated with Al stress


程度的上调(图3), SHM、RGR、LBG、CYP、NAC
和HDZ基因的表达在受到铝胁迫的前4小时内表现为
上调, 但在铝胁迫8小时后的表达下调; PSP基因的
表达在受到铝胁迫的前8小时内表现为上调, 但在铝
胁迫12小时以后的表达下调; 而MAS在受到铝胁迫
后在所有时间点表达均表现为上调。这些结果说明我
们构建的SSH cDNA文库假阳性较少。
2.5 讨论
SSH技术在富集差异表达基因方面有明显优势, 因
此在研究植物抗病及逆境胁迫的基因差异表达中应
用广泛。本研究利用SSH技术构建了柱花草在铝胁迫
下的正向SSH cDNA文库, 从文库中得到了97种铝胁
迫下差异表达基因的EST序列, 为鉴定柱花草的铝胁

Clone name Length (bp) Corresponding or related protein sequence Score e-value Accession number
Stress (8)
11B12 631 Pathogen-inducible trypsin-inhibitor-like protein 130 8e-29 GE841214
13E8 365 PR10 protein 148 1e-34 GE841111
13H9 406 Quinonprotein alcohol dehydrogenase-like 132 9e-30 GE841112
8B12 337 Putative senescence-associated protein 177 2e-43 GE841113
3A5 489 Monodehydroascorbate reductase 196 1e-48 GE841115
7C6 375 Putative copper ion-binding laccase 65.1 2e-09 GE841133
1H7 696 Alcohol dehydrogenase 81.3 8e-14 GE841145
1D3 527 Metallothionein-like protein 97.1 5e-19 GE841155
Signal transduction and transcription factor (6)
14G9 381 Rheb GTPase Rhb1 59.7 1e-07 GE841130
6A6 461 HDZip I protein 59.7 6e-08 GE841124
2E8 1 061 AT hook motif-containing protein 154 9e-42 GE841153
7G9 745 Putative reverse transcriptase 85.5 5e-15 GE841122
6D4 718 NAC family transcription factor 3 125 3e-27 GE841129
3G1 836 Putative splicing factor Prp8 47.4 0.001 GE841142
Metabolism (5)
7H12 664 Cytochrome P450 like TBP protein 146 7e-41 GE841110
12F10 420 Disulfide-isomerase precursor 45.1 0.003 GE841119
14H1 330 Farnesylated protein GMFP5 mRNA 59.7 1e-07 GE841132
13A3 339 Aldose reductase 45.1 0.003 GE841134
11B6 290 Acetylornithine deacetylase, putative 40.8 0.031 GE841140
Protein synthesis (5)
7C9 280 60S ribosomal protein L36 (RPL36B) 63.2 9e-09 GE841120
12H2 170 60S ribosomal protein L38 (RPL38A) 63.2 9e-09 GE841121
4H7 202 40S ribosomal protein S15a 53.1 1e-05 GE841131
14F2 256 60S ribosomal protein L17-like protein 77.0 4e-13 GE841156
9F4 240 Ribosomal protein L18 40.8 0.049 GE841139
Carrier protein (4)
11H1 331 Oxysterol-binding protein 103 5e-21 GE841118
9C12 278 Vacuolar ATP synthase catalytic subunit A 92.8 1e-17 GE841138
12D1 758 Mitochondrial ATP synthase, beta chain 306 1e-81 GE841141
3B11 837 Plasma membrane intrinsic protein 2-2 52.4 6e-05 GE841150
Cell structure (2)
7C5 230 Myosin heavy chain MYA2 48.1 2e-04 GE841125
2A3 924 Procollagen type IV alpha 6 42.4 0.045 GE841151
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表3 新的铝胁迫相关基因
Table 3 Novel genes associated with Al stress


迫诱导基因奠定了基础, 也为揭示柱花草耐铝毒的分
子机理提供了重要线索。
CYP是广泛存在于动植物及微生物体内的一类
具有混合功能的血红素氧化酶系, 参与植物的基础代
谢与次生代谢及外源性有毒物的降解, 将有毒物转化
为无毒的物质。CYP在植物防御体系中起重要作用,
赋予植物抵抗各种胁迫因子的能力。CYP基因表达可
被多种胁迫因子所诱导(Harvey et al., 2002)。CYP在
植物体中的抗病作用已有众多的研究, 但其在抵御非
生物胁迫中的功能目前并不是很清楚。在我们构建的
文库中CYP的EST重复出现的频率最高, 共有53次,
这可能意味着它在柱花草抵御铝毒过程中起重要作
用。
在铝胁迫下植物根的结构受到损坏, 因此对病原
胁迫也特别敏感, 很多植物的病原胁迫相关基因也被
诱导表达(Goodwin and Sutter, 2009)。PTI是一种对
多种丝氨酸蛋白酶水解酶活性有抑制作用的小分子
蛋白质。很多植物在受到害虫侵害或病原菌感染时会
被诱导产生PTI, 因此PTI与植物在胁迫下的防御有
关。在我们构建的文库中PTI出现的重复次数也较高,
共有44次, 也预示它在柱花草抵御铝毒过程中可能
起重要作用。
植物衰老是一个受基因控制的发育过程, 衰老作
为正常发育过程的一部分, 虽然受到基因的严格控
制, 但是一些环境因素, 如缺水、高低温、高盐等逆
境胁迫也能诱导P S P基因的表达致使植物早衰
(Amnon, 2007)。有研究表明, 植物受到高浓度铝胁
迫时, PSP基因的表达被诱导, 根部的很多细胞发生
衰老而死亡(Chandran et al., 2008b)。在构建SSH文
库时, 我们用300 µmol·L–1的铝处理柱花草, 这对其
可能是一种很强的逆境胁迫, 所以也诱导很多PSP基
因的表达。在SSH文库中PSP出现37次, RT-PCR分
Clone name Length (bp) Corresponding or related protein sequence Score e-value Accession number
Metabolism (8)
5G4 274 Myo-inositol oxygenase 100 4e-20 GE841117
9H10 517 Serine hydroxymethyltransferase 256 3e-67 GE841123
3H11 349 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase 45.8 0.001 GE841128
4D4 908 Mitochondrial bifunctional diaminopelargonate syn-
thase-dethiobiotin synthetase
253 1e-65 GE841143
4D12 1 033 Adenosylmethionine-8-amino-7-oxononanoate ami-
notransferase-like protein
263 1e-68 GE841149
12E10 276 Homogentisate phytyltransferase VTE2-1 58.9 2e-07 GE841135
1D1 1 050 Phosphoenolpyruvate carboxykinase 142 6e-32 GE841154
10D4 896 Chloramphenicol transacetylase 293 1e-77 GE841157
Signal transduction and transcription factor (2)
5C11 622 rRNA intron-encoded homing endonuclease 68.2 4e-10 GE841116
9B10 1 078 Common plant regulatory factor 7 118 1e-24 GE841137
Cell structure (2)
9B11 414 Lipid-binding serum glycoprotein family protein 112 2e-23 GE841127
12E12 374 Fiber protein Fb2 47.4 3e-04 GE841146
Carrier protein (2)
12C9 242 Cyclic nucleotide-gated channel C 60.1 8e-08 GE841114
4C12 179 Sugar transporter family protein 61.6 3e-08 GE841126
Stress (2)
3E1 1 033 Odorranain-E1 antimicrobial peptide precursor 45.1 0.008 GE841144
2C12 428 Mannitol dehydrogenase, putative 82.8 7e-15 GE841152
王奇峰等: 铝胁迫下柱花草SSH文库构建及表达序列标签分析 685


图3 利用RT-PCR分析验证SSH文库数据
右边为PCR扩增循环数; 基因名称缩写见表1。

Figure 3 Validation of SSH cDNA library data by RT-PCR
analysis
Number of PCR cycles is shown on the right side; The ab-
breviations of gene names are described as in Table 1.


析也证实柱花草在受到铝胁迫后其表达上调(图3),
说明PSP表达上调可能是柱花草响应300 µmol·L–1铝
胁迫的一个重要组成部分。
植物遭受铝毒害, 首先通过根系吸收铝引起自由
基代谢失衡, 使植物体内产生活性氧(ROS), 再通过
活性氧对细胞产生毒害, 从而导致植物生理上的损伤
(Kochian, 2004)。ROS对细胞内的脂膜、蛋白质、
DNA等有很强的损伤作用。另一方面, ROS与植物细
胞程序性死亡(PCD)有关。因此, 植物对铝胁迫的耐
受性与它们的抗氧化能力密切相关。植物通过清除活
性氧来抵御氧化胁迫的伤害, 从而增加对铝毒害的抗
性。在我们构建的文库中发现多个抗氧化胁迫相关的
基因 , 单脱氢抗坏血酸还原酶 (monodehydroas-
corbate reductase)在植物维持活性氧平衡过程中具
有重要作用(Leterrier et al., 2005); 甘露醇脱氢酶
(mannitol dehydrogenase)在植物防御ROS中起着重
要作用(Jennings et al., 1998); 尿黑酸叶绿醇转移酶
(homogentisate phytyltransferase)是植物生育酚合
成过程中的1个关键限速酶, 处于维生素E生物合成
的第1步, 维生素E可以缓解生物体内ROS引起的氧
化胁迫(Collakova and DellaPenna, 2001)。目前尚未
见甘露醇脱氢酶和尿黑酸叶绿醇转移酶与铝胁迫相
关的报道, 这2个基因的上调表达可能是柱花草抵御
铝毒引起氧化胁迫的特有机制。
植物的液泡在解除铝离子毒害、保护细胞过程中
起着重要的作用。Al3+主要通过与某些多肽, 如金属
硫蛋白(metallothioneins)等螯合并通过液泡H+-ATP-
ase的作用被隔离贮存在液泡内, 从而解除其对细胞
的毒害作用。Hamilton等(2001)的研究证明, 铝抗性
小麦液泡ATP合酶和线粒体ATP合酶受到铝胁迫诱
导其活性增加, 液泡ATP合酶活性的增加为液泡膜的
Na+/H+交换提供动力, 保持细胞质的中性pH。在我们
构建的文库中也发现这些基因的表达上调, 因此通过
液泡缓解铝毒可能是柱花草耐铝毒的部分机理之一。
植物转录因子通过调控多个基因的表达, 从而调
节植物在胁迫下的不同生理生化过程。HDZip是高等
植物中特有的一类转录因子, 该基因能迅速应答外界
环境的变化。NAC家族基因与众多的植物形态建成和
发育过程相关, 是植物特异的转录调控因子, 但NAC
家族基因转录的详细机制并不清楚。NAC家族众多成
员都能对胁迫产生响应(Ooka et al., 2003)。含有AT
hook基序蛋白能够与其调控的目标基因中富含AT碱
基的DNA序列结合而调控基因的表达, 从而影响生
物的生长发育。在番茄(Lycopersicon esculentum)中
过量表达红辣椒中的AT hook基序蛋白能提高转基因
植物对病原体的抵御能力(Kim et al., 2007)。在拟南
芥中过量表达AT hook基序蛋白能降低叶片衰老相关
基因的mRNA表达水平, 同时提高叶片的光合效率和
叶绿素含量, 延缓叶片的衰老(Lim et al., 2007)。这些
转录因子的上调表达可能是柱花草在铝胁迫下的一
种应急机制, 通过这些基因的迅速应答来调控柱花草
适应环境中的铝胁迫。
在我们构建的文库中发现了一个表达上调的
SHM基因。SHM催化丝氨酸与甘氨酸相互转化的可
逆反应, 丝氨酸是合成半胱氨酸的前体, 半胱氨酸和
甘氨酸是谷胱甘肽的重要组成部分。谷胱甘肽具有清
除自由基、解毒、维持DNA的生物合成和细胞的正常
生长等多种生理功能, 在植物抵御活性氧伤害的过程
中起重要作用。SHM表达的增强可能促使柱花草在受
到铝胁迫时合成更多的谷胱甘肽从而缓解铝的毒害
作用。
Li等(2009)的研究发现柠檬酸的分泌是柱花草在
高铝低磷环境下的一种抗性机制。在我们构建的文库
中发现与柠檬酸代谢相关的磷酸烯醇式丙酮酸激酶
686 植物学报 45(6) 2010
(PEPCK)的上调, PEPCK催化的反应产生磷酸烯醇
式丙酮酸(PEP), 而PEP在磷酸烯醇式丙酮酸化酶
(PEPC)作用下可生成草酰乙酸, 草酰乙酸是合成柠
檬酸的底物。因此, PEPCK的上调表达可能有助于增
加柱花草中柠檬酸的合成和分泌, 从而提高其对铝胁
迫的适应能力。
植物耐铝毒的分子机制是个很复杂的过程, 是众
多基因响应的结果。柱花草可能运用多种机制来适应
和缓解铝胁迫的毒害作用, 这些机制尽管存在一些分
子生物学证据, 但大多仅建立在推测的基础上, 还需
要进一步的验证。我们在柱花草SSH cDNA文库中发
现的铝胁迫相关基因中, 除了功能已知基因外, 还有
一些功能未知的基因, 这些基因在柱花草抵御铝毒中
的作用还不清楚, 有待进一步研究。
致谢 感谢广西大学黎晓峰教授提供柱花草热研2号
种子; 感谢昆明理工大学生物工程技术研究中心陈奇
博士帮助设计LBG、PSP、CPY和MAS基因的引物。
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688 植物学报 45(6) 2010
Construction of a Suppression Subtractive Hybridization Library
for Stylosanthes guianensis Under Aluminum Stress and
Expressed Sequence Tag Analysis
Qifeng Wang1, Qiong Yi1, Kunzhi Li1, Limei Chen1*, Yongxiong Yu2
1Bioscience and Biotechnology Research Center, Kunming University of Science and Technology, Kunming 650224, China
2College of Zoological Science and Technology, Southwest University, Chongqing 400716, China
Abstract Stylo (Stylosanthes guianensis) is a forage grass grown worldwide. A cultivar of stylo (‘Reyan No.2’) was
shown to be able to exudate citrate and tolerate aluminum (Al). To identify Al-induced genes in stylo, we constructed a
forward cDNA library for Reyan No.2 under 300 μmol·L–1 Al stress by suppression subtractive hybridization. Approxi-
mately 600 clones with inserts > 300 bp were selected for sequence analysis. In total, 504 expressed sequence tags
(ESTs) were obtained: 12.1% were singletons and 61.4% presented as 2–16 copies. The highly repetitive ESTs were
10.5% for cytochrome P450-like TBP protein, with 53 copies; 8.7% for pathogen-inducible trypsin-inhibitor-like protein,
with 44 copies; and 7.3% for putative senescence-associated protein, with 37 copies. BLASTX analysis revealed that the
504 ESTs could be assembled into 97 non-redundant sequences, including 46 genes with known function. Of 46 genes
with known function, 30 were previously reported to be Al-responsive genes and the other 16 ESTs are novel
Al-associated genes. The information provides important clues to facilitate understanding the Al detoxification mechanism
in stylo at the molecular level.
Key words Al stress, cDNA library, expressed sequence tag, Stylosanthes guianensis, suppression subtractive
hybridization
Wang QF, Yi Q, Li KZ, Chen LM, Yu YX (2010). Construction of a suppression subtractive hybridization library for Sty-
losanthes guianensis under aluminum stress and expressed sequence tag analysis. Chin Bull Bot 45, 679–688.
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* Author for correspondence. E-mail: chenlimeikm@126.com
(责任编辑: 白羽红)