全 文 ：植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2016, 51 (3): 296–305, www.chinbullbotany.com
doi: 10.11983/CBB15127
——————————————————
收稿日期: 2015-07-17; 接受日期: 2015-09-25
基金项目: 国家自然科学基金(No.U1303302, 31060149)和石河子大学高层次人才启动项目(No.RCZX200902)
* 通讯作者。E-mail: xianzhongh106@163.com
小拟南芥ApZFP基因异源超表达促进拟南芥
开花并提高耐逆性
刘慧, 郭丹丽, 蔡大润, 黄先忠*
石河子大学生命科学学院, 石河子 832003
摘要 锌指蛋白(ZFP)是一类重要的转录因子, 广泛参与植物的生长发育和非生物胁迫应答。新疆小拟南芥(Arabidopsis
pumila)又名无苞芥, 是十字花科短命植物, 具有高光效、繁殖力强和适应干旱等生物学特征, 而且比模式植物拟南芥(A.
thaliana)更耐高盐胁迫。将前期克隆的小拟南芥锌指蛋白基因ApZFP通过花滴法转化到哥伦比亚生态型拟南芥(Col-0)中,
获得了独立表达的转基因株系。表型观察发现, 过量表达ApZFP基因可促使拟南芥在长短日照下均提前开花。实时荧光定
量PCR结果显示, 转基因拟南芥株系中, 光周期途径中的CO基因和年龄途径中的SPL基因表达上调; 春化、环境温度和自
主途径中的FLC基因表达下调; 编码成花素的基因FT及下游开花相关基因AP1和LFY的表达量均升高。进一步通过盐、干
旱和ABA胁迫处理ApZFP转基因株系的种子和幼苗, 发现在胁迫处理下, 与对照相比, 转基因拟南芥种子萌发率较高, 幼
苗主根较长。因此推测, ApZFP在植物发育过程中具有多种功能, 可能既参与植物的开花转变过程, 又同其它植物的锌指蛋
白基因一样, 参与植物的耐逆过程。
关键词 小拟南芥, 无苞芥, 锌指蛋白, 早花, 抗逆
刘慧, 郭丹丽, 蔡大润, 黄先忠 (2016). 小拟南芥ApZFP基因异源超表达促进拟南芥开花并提高耐逆性. 植物学报 51,
296–305.
干旱、盐碱和低温等非生物逆境是影响作物生长
发育和产量形成的重要限制因子。在长期的进化过程
中, 高等植物形成了复杂的防御机制, 这种机制往往
是通过感知和转导逆境信号分子来实现的, 如锌指蛋
白(zinc finger protein, ZFP)、转录因子和离子通道等
(Mansur et al., 1996)。其中, 锌指类蛋白是真核生物
中一类重要的转录因子, 广泛参与基因的转录、翻译、
mRNA的运输、细胞骨架构建、细胞支持、蛋白折叠
和染色质修饰等过程(Takatsuji, 1998; Gamsjaeger et
al., 2007), 在动植物的生长发育中均起着重要作用。
锌指蛋白在真核生物基因组中十分丰富, 根据半
胱氨酸(C)和组氨酸(H)残基的数目和位置, 可将锌指
结构分为C2H2、C3H2C3和C3HC4三个亚类(Mac-
Pherson et al., 2006)。其中C2H2类锌指蛋白, 又称
为TFIIIA类型锌指或经典锌指, 是真核生物转录因子
中研究最多的与DNA结合的结构模式。该结构是由2
个半胱氨酸和2个组氨酸与Zn2+形成配位键, 进而形
成1个包含β发夹和1个α螺旋的紧密指状结构(Specht
et al., 2001)。植物C2H2型锌指蛋白的α螺旋区一般
都有1个QALGGH的高度保守的氨基酸序列, 是植物
锌指蛋白所特有的(Takatsuji, 1999), 它们广泛参与
植物各个时期的生长发育调控和胁迫应答(Kasuga
et al., 1999; Singh et al., 2002; Englbrecht et al.,
2004)。如模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)的1
个锌指蛋白基因SZT主要在根部表达, 应答盐胁迫
(Sakamoto et al., 2000)。矮牵牛(Petunia hybrid)锌
指蛋白基因ZPT2-3参与多种胁迫应答反应, 且具有
提高植物耐旱性的潜在能力(Sugano et al., 2003)。
过表达大豆(Glycine max)锌指蛋白基因SCOF-1也可
以增强拟南芥和烟草(Nicotiana tabacum)的耐冷性
(Kim et al., 2001)。
开花是植物重要的生理现象, 是植物由营养生长
转变为生殖生长的过程 (Kobayashi and Weigel,
2007)。这一过程涉及不同发育方式的转换, 分为成
·研究报告·
刘慧等: 小拟南芥 ApZFP基因异源超表达促进拟南芥开花并提高耐逆性 297

花诱导(floral induction)、成花决定(floral determina-
tion)、花的起始(floral initiation)和花器官形成(floral
formation)等一系列顺序过程。其中成花决定标志着
植物成花转变的启动, 是花的起始和花器官形成的基
础 , 直接控制植物的开花时间 (傅永福和孟繁静 ,
1997)。开花时间的调控是个非常复杂的过程, 受自
身遗传因子和外界环境因素2方面的共同影响, 二者
所产生的多种信号汇集在一起, 实现对开花时间的精
准控制(孙昌辉等, 2007)。目前, 对植物开花时间调控
的理解主要是通过模式植物拟南芥成花的生理学和
遗传学研究获得的。迄今为止, 已经探明包括光周期、
春化、温度、赤霉素、自主以及年龄6条遗传途径参
与调控拟南芥的开花时间 (Srikanth and Schmid,
2011)。光周期途径中的CONSTANS (CO), 温度、
春化和自主途径中的FLOWERING LOCUS C (FLC),
年龄途径中的SQUAMOSA PROMOTER BINDING
LIKE (SPL)以及赤霉素途径中的AtGA20OX在植物
开花过程中均具有重要作用, 共同调控拟南芥开花
(Fornara et al., 2010)。FLOWERING LOCUS T (FT)
是光周期途径中植物开花时间决定的关键基因。研究
表明, FT基因的表达产物可能就是人们长期追寻的开
花刺激物质, 即成花素(florigen) (Abe et al., 2005;
Huang et al., 2005; Wigge et al., 2005)。长日照下,
CO蛋白大量积累, 直接作用于FT基因的启动子区,
也可同其它转录因子相互作用共同促进FT的转录
(Kobayashi and Weigel, 2007)。随后FT蛋白进入韧
皮部的维管束中 , 长距离运输到达顶端分生组织
(SAM), 与FLOWERING LOCUS D (FD)蛋白相互作
用, 形成FT/FD蛋白复合物, 进而激活花分生组织基
因APETALA1 (AP1)和LEAFY (LFY)的表达(Corbe-
sier et al., 2007), 从而促进植物开花。目前已在多种
植物中分离出FT的同源基因, 并通过转基因证明FT
基因的表达促进植物提早开花(Hayama et al., 2007;
Hemming et al., 2008; Guo et al., 2015; Li et al.,
2015)。此外, 转录因子在植物成花转变过程中也发
挥重要作用。例如, 玉米(Zea mays)锌指蛋白基因
ID1能够调控开花时间(Kozaki et al., 2004); 水稻
(Oryza sativa)中的同源基因RID1控制水稻植株从营
养生长向生殖生长的转变(Wu et al., 2008)。
小拟南芥(A. pumila)是十字花科无苞芥属植物,
俗称新疆无苞芥(Olimarabidopsis pumila) (Al-Sheh-
baz et al., 1999), 具有高光效、繁殖力强和适应干旱
气候等生物学特征, 而且比拟南芥更耐高盐胁迫(张
海波等, 2007)。本实验室前期从小拟南芥中克隆获得
了1个开放阅读框为684 bp的锌指蛋白基因ApZFP,
高盐、干旱和低温等胁迫的诱导表达结果显示, 该基
因涉及多种胁迫相关的信号转导途径 (郭丹丽等 ,
2014)。本实验通过在拟南芥中过表达ApZFP基因,
探讨了ApZFP基因在促进植物开花过程中的重要作
用; 同时通过盐、干旱和ABA胁迫进一步揭示该基因
在响应逆境胁迫过程中的功能。
1 材料与方法
1.1 材料
小拟南芥(Arabidopsis pumila L.)种子采自石河子蘑
菇湖周边的盐碱地 , 哥伦比亚生态型拟南芥 (A.
thaliana L.) (Col-0)种子为本实验室保存。质粒载体
pCAMBIA2300-35S-OCS、大肠杆菌E. coli DH5α及
农杆菌GV3101均为本实验室保存。
1.2 方法
1.2.1 35S::ApZFP植物表达载体的构建及拟南芥
的遗传转化
以pCAMBIA2300-35S-OCS为载体 , 将ApZFP的开
放阅读框插入多克隆位点KpnI和BamHI之间, 构建
带有花椰菜病毒CaMV35S启动子的植物表达载体
35S::ApZFP。将该载体转入农杆菌GV3101中, 转化
后的克隆经PCR检测为阳性后, 通过花滴法转入拟
南芥中(Clough and Bent, 1998)。收集种子, 在含50
mg·mL–1卡那霉素的1/2MS培养基(准确称取30 g蔗
糖、2.2 g MURASHIGE & SKOOG BASAL MEDI-
UM、0.5 g MES、8 g agar, 加ddH2O定容至1 L, 调
pH至5.8)上进行筛选。将抗性苗移至土壤中生长, 待
成熟后收集种子即得T1代, 继续筛选至T4代纯合体
种子后, 保存作为实验材料备用。

1.2.2 野生型和35S::ApZFP转基因拟南芥DNA的
提取及PCR检测
采用改良的CTAB法(黄晓丹等, 2006)提取拟南芥总
DNA。用引物 KpnI-ApZFP-F和 BamHI-ApZFP-R
(表1)进行PCR鉴定。PCR反应程序为: 94°C预变性5
298 植物学报 51(3) 2016

分钟; 94°C变性40秒, 56°C退火30秒, 72°C延伸30
秒, 30个循环; 72°C延伸5分钟。PCR反应产物用1%
琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.2.3 拟南芥开花相关基因和开花通路关键基因的
表达分析
本研究中基因表达分析所用组织为叶片。转基因拟南
芥开花时, 分别取转基因和野生型植株的莲座叶为材
料, 用RNAprep pure Plant Kit试剂盒(Tiangen, Cat
No.DP432)提取总RNA, 经琼脂糖凝胶电泳检测, 取
质量完好的RNA置于–80°C保存备用。参照Prime-
ScriptTM RT-PCR Kit (TaKaRa, Cat No.RR014A)说
明书合成cDNA第1链。以拟南芥18S (KT154684)基
因作为内参基因 , 设计拟南芥编码成花素的基因
AtFT (AF152096)、开花相关基因AtAP1 (AF466782)
和AtLFY (KF051022)的实时荧光定量PCR (qRT-
PCR)引物 , 以及开花通路关键基因AtCO (NM_
121589.1)、AtFLC (NM_121052.2)、AtSPL (NM_
118867.1)和AtGA20OX (NM_103535.1)引物(表1)。
利用Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR
System进行扩增。反应程序为94°C2分钟; 95°C3秒,
60°C30秒, 40个循环, 60°C读取荧光值; 循环结束后
95°C1分钟, 60°C 30秒, 40°C 2分钟。最后进行溶解
曲线分析。每个样品设3次重复。

1.2.4 野生型和35S::ApZFP转基因株系的耐逆实验
1.2.4.1 野生型和35S::ApZFP转基因株系种子的
盐、干旱和ABA处理
在超净台上先用70%乙醇洗涤种子1分钟, 弃上清后,
用10%NaClO灭菌处理拟南芥种子15分钟, 用无菌
水清洗4–5次, 分别将野生型及T4代转ApZFP基因拟
南芥纯合株系种子用枪头点播在含NaCl (100 mmol·
L–1)、甘露醇(200 mmol·L–1)和ABA (0.5 μmol·L–1)的
1/2MS培养基中, 以不添加NaCl、甘露醇和ABA的
1/2MS培养基作为对照组, 每个平板接种25粒种子,
4°C 2天后, 移入22°C (16小时光照/8小时黑暗)培养
箱中培养。以胚根突破种皮为萌发标志, 每天统计萌
发数, 连续统计7天。实验重复3次。


表1 本研究所用的引物名称
Table 1 PCR primers used in this study
Primer name Primer sequence (5′–3′) Application
ApZFP-RTF GCAGCAAGAACATTTGGCAG
ApZFP-RTR GTAACAGGTCAACGTTTGGG
qPCR
AtFT-RTF ATGTCTATAAATATAAGAGA
AtFT-RTR CTTGGCTTGTTTTGAACC
qPCR
AtAP1-RTF AACCAAGGCCACAATATGCC
AtAP1-RTR ATCATTCCTCCTCATTGCCATAG
qPCR
AtLFY-RTF
AtLFY-RTR
CGGCTTAGATTATCTGTTCCACTTG
ACTCGCTCCTGATTTCTTCGC
qPCR
AtCO-RTF AAAACTGCAGCGTACCACAG
AtCO-RTR TTGGGTGTGAAGCTGTTGTG
qPCR
AtFLC-RTF CTCTACAGCTTCTCCTCCGG
AtFLC-RTR TCCCACAAGCTTGCTATCCA
qPCR
AtGA20OX-RTF CCTACTCCAGAGCCAACCAA
AtGA20OX-RTR AAAAGTACCGTGAGCCATGC
qPCR
AtSPL-RTF ACGTTGAGAGGAATGGGTGT
AtSPL-RTR ACCCGACTCCACCACAATAG
qPCR
KpnI-ApZFPF GGGGTACCATGGATTCGTCCATCAAAGGAGATC
BamHI-ApZFPR CGGGATCCTCATAGCTTAAGAGTCAAGTCAAT
Vector construction
18S-F ATACGTGCAACAAACCC
18S-R CTACCTCCCCGTGTCA
Reference gene

刘慧等: 小拟南芥 ApZFP基因异源超表达促进拟南芥开花并提高耐逆性 299

1.2.4.2 野生型和35S::ApZFP转基因幼苗的盐、干
旱和ABA处理
野生型(Col-0)及T4代转ApZFP基因拟南芥纯合株系
种子消毒和室内培养按照文献(院海英等, 2011)所述
的方法处理。将种子平铺在1/2MS培养基上, 4°C 2天
后, 移入22°C (16小时光照/8小时黑暗)培养箱中培
养。培养6天后, 分别将生长状况一致的幼苗转入含
有不同浓度NaCl (100 mmol·L–1和200 mmol·L–1)、甘
露醇(200 mmol·L–1和300 mmol·L–1)和ABA (1 μmol·
L–1)的1/2MS固体培养基中, 以不添加NaCl、甘露醇
和ABA的1/2MS培养基作为对照组, 每个平板中的幼
苗个数均相同。实验重复3次。将所有处理的平板竖
直培养8天后, 观察每个处理植株的主根生长情况并
统计胁迫后主根的长度。
2 结果与讨论
2.1 35S::ApZFP植物表达载体的构建及转基因
植株的鉴定
经KpnI和BamHI双酶切鉴定, ApZFP基因成功连接至
pCAMBIA2300-35S-OCS植物表达载体中 , 获得
35S::ApZFP表达载体(图1A)。将构建成功的表达载
体通过农杆菌GV3101转入野生型拟南芥, 通过卡那
霉素筛选和DNA检测获得11株T1代转基因植株(图
1B)。挑选其中基因表达量较高的2株转基因株系
35S::ApZFP-3和35S::ApZFP-5 (图2B, 以下分别简
称为L3和L5)作为本实验的材料。
2.2 过表达ApZFP基因促进拟南芥提前开花
将野生型和转基因(L3和L5)拟南芥幼苗同时移栽到
土壤中。开花表型分析(图2A, D)和开花时间统计(表
2)表明, 在长日照和短日照条件下, 与野生型相比,
转基因拟南芥株系L3和L5的开花时间都明显较早。
qRT-PCR结果显示, ApZFP在转基因株系中高表达
(图2B, E)。莲座叶数量统计表明, 转基因株系的莲座
叶数目较野生型少, 茎生叶较野生型拟南芥多(图2C,
F)。说明小拟南芥锌指蛋白基因ApZFP能够调控植物
的开花时间。
2.3 ApZFP基因促进拟南芥成花相关基因的表达
在长日照和短日照条件下, 转基因株系中编码成花素
的基因AtFT及开花相关基因AtAP1和AtLFY的表达水
平都较野生型显著提高(P<0.01) (图3A–C), 表明在
拟南芥中过表达ApZFP基因可促进FT下游内源基因
的表达, 间接证明ApZFP基因可促进拟南芥成花。
2.4 拟南芥成花途径中关键基因的表达分析
调控拟南芥开花时间的6条遗传途径中, 光周期通过
影响AtCO的表达来调控AtFT的表达, 从而控制开
花。AtFLC是温度、春化和自主途径中的关键基因, 该
基因抑制AtFT的表达, 从而延迟拟南芥开花。年龄途
径中的AtSPL可以促进成花相关基因AtAP1的表达来




图1 35S::ApZFP植物表达载体的构建及其转基因植株的PCR鉴定
(A) 35S::ApZFP载体的酶切鉴定(M: DL 2000 DNA分子量标准; 1–2: 35S::ApZFP重组质粒双酶切); (B) 转基因植株的目的基因的
PCR鉴定(M: DL 2000 DNA分子量标准; 1: 35S::ApZFP质粒阳性对照; 2–12: 不同的转基因株系; 13: 野生型(阴性对照))

Figure 1 Construction of the 35S::ApZFP plant expression vector and detection of ApZFP transgenic lines by PCR
(A) Plasmids of 35S::ApZFP digested by KpnI and BamHI enzymes (M: DL 2000 DNA marker; 1–2: Double enzyme digestion of
two 35S::ApZFP recombinant plasmids); (B) Target gene detection of the 35S::ApZFP transgenic lines by PCR (M: DL 2000 DNA
marker; 1: 35S::ApZFP positive plasmid control; 2–12: Different transgenic lines; 13: Wild type (negative control))

300 植物学报 51(3) 2016



图2 ApZFP基因过表达促进拟南芥开花
(A)和(D)分别为长日照和短日照条件下野生型和转基因拟南芥
的早花表型; (B)和(E)分别为长日照和短日照条件下, 野生型和
转基因拟南芥中ApZFP基因的相对表达量; (C)和(F)分别为长
日照和短日照条件下野生型和转基因拟南芥各植株莲座叶和茎
生叶数目的统计结果。WT: 野生型; L3, L5: 转基因株系; ** 差
异极显著(P<0.01)。

Figure 2 Overexpression of ApZFP gene promotes Arabi-
dopsis flowering time
(A) and (D) Phenotypes of wild-type and transgenic lines
grown in chambers under long-day condition and short-day
condition; (B) and (E) Relative expression analysis of ApZFP
gene in wild-type and transgenic lines Arabidopsis under
long-day condition and short-day condition; (C) and (F) Sta-
tistics of rosette and cauline leaves number in transgenic
lines and wild-type Arabidopsis under long-day condition and
short-day condition. WT: Wild type; L3, L5: Transgenic lines;
** Significant differences at P<0.01.


促进开花。赤霉素途径中的AtGA20OX通过氧化赤霉
素(GA)来促进开花(Srikanth and Schmid, 2011)。实
验结果(图4A–D)表明, 转基因株系中AtCO和AtAPL
的表达量都较野生型高(P<0.01); AtFLC的表达量都


图3 长日照和短日照条件下AtFT (A)、AtAP1 (B)和AtLFY (C)
基因的表达分析
WT: 野生型; L3, L5: 转基因株系; LD: 长日照条件; SD: 短日
照条件。** 差异极显著(P<0.01)。

Figure 3 Expression of Arabidopsis flowering-related genes
AtFT (A), AtAP1 (B) and AtLFY (C)
WT: Wild type; L3, L5: Transgenic lines; LD: Long-day condi-
tion (16 h light/8 h dark); SD: Short-day condition (8 h light/16
h dark). ** Significant differences at P<0.01.

较野生型低(P<0.01); 而AtGA20OX的表达量与野生
型没有显著差异。这说明ApZFP基因促进拟南芥早花
可能是通过影响多种开花途径来共同调节的。
2.5 盐、干旱和ABA胁迫对野生型和转基因拟南
芥种子萌发的影响
为了进一步研究ApZFP在植物逆境应答中的作用,
将野生型和转基因拟南芥(L3, L5)的种子按照方法
1.2.4节做萌发处理。胁迫处理种子7天后的萌发结果
显示, 在对照组中, 野生型和转基因拟南芥种子在萌

刘慧等: 小拟南芥 ApZFP基因异源超表达促进拟南芥开花并提高耐逆性 301

表2 过表达ApZFP转基因拟南芥的开花时间
Table 2 The flowering time of overexpression of ApZFP in Arabidopsis
Genotype Light conditions Number of lines Time of anthesis (days) Rosette leaf number formed at anthesis
WT LD 16 23.6±1.7 11.2±1.3
35S::ApZFP-3 LD 21 17.1±0.7** 7.5±1.1
35S::ApZFP-5 LD 30 16.1±0.9** 7.0±0.7
WT SD 8 35±1.3 13.2±1.1
35S::ApZFP-3
35S::ApZFP-5
SD
SD
16
16
22.7±0.8
21.9±0.7
8.5±1.0**
8.1±0.8**
** 表示P<0.01水平差异极显著; LD: 长日照(16小时光照/8小时黑暗); SD: 短日照(8小时光照/16小时黑暗); WT: 野生型
** Significant differences at P<0.01, according to Student’s t-test compared with wild-type; LD: Long-day condition (16 h light/8 h
dark); SD: Short-day condition (8 h light/16 h dark); WT: Wild type



图4 拟南芥成花途径中关键基因的表达分析
(A) AtCO; (B) AtFLC; (C) AtSPL; (D) AtGA20OX; WT: 野生
型; L3, L5: 转基因株系; ** 差异极显著(P<0.01)。

Figure 4 Expression analysis of key genes in Arabidopsis
flowering pathway
(A) AtCO; (B) AtFLC; (C) AtSPL; (D) AtGA20OX. WT: Wild
type; L3, L5: Transgenic lines; ** Significant differences at
P<0.01.


发期的生长情况没有明显区别(图5A)。统计结果表明,
种子的萌发率都在90%以上(图5B)。当种子在100
mmol·L–1 NaCl胁迫下, 野生型拟南芥种子的萌发率
下降到50%左右, 而转基因拟南芥种子的萌发率平均
保持在80%左右(图5B)。200 mmol·L–1甘露醇处理下
野生型拟南芥种子的萌发率下降到10%左右, 而转基
因拟南芥种子的萌发率平均保持在50%左右(图5B)。
在0.5 μmol·L–1 ABA胁迫处理下, 野生型拟南芥种子
萌发率下降到10%左右, 而转基因拟南芥种子的萌发
率平均保持在50%左右(图5B)。以上结果表明, 在拟
南芥中过表达ApZFP基因可以增强拟南芥种子在萌
发期对盐、干旱和ABA的耐受性。
2.6 盐、干旱和ABA胁迫对野生型和转基因拟南
芥幼苗生长的影响
为了研究ApZFP在植物应对非生物胁迫中的作用 ,
将幼苗期的野生型和转基因拟南芥(L3, L5)按照1.2.4
节所述方法进行处理。结果表明, 在不同程度的胁迫
处理下, 竖直培养8天后, 所有拟南芥幼苗的主根生
长均受到不同程度的抑制, 但L3和L5受到的抑制较
野生型轻(图6A)。除主根生长受到抑制外, 随着培养
基中NaCl和甘露醇浓度的升高, 野生型植株还表现出
了叶片加厚卷曲及叶柄变短的表型, 而L3和L5的形态
没有明显的改变(图6A)。统计胁迫后幼苗主根的长度,
结果表明, 转基因株系的主根长度明显大于野生型植
株, 而对照处理中的野生型和转基因植株没有明显的
差异(图6B)。实验结果表明, 过表达ApZFP基因能够
提高拟南芥幼苗对盐、干旱和ABA胁迫的耐受性。
2.7 讨论
C2H2型锌指蛋白广泛存在于高等植物中, 参与植物
的生长发育和胁迫应答。例如, 拟南芥1个C2H2型锌
指蛋白基因TTL参与胚乳的发育(Lu et al., 2012); 而
拟南芥另外1个C2H2型锌指蛋白基因AtZFP5则是根
毛发育中不可或缺的基因(An et al., 2012); SU-
PERMAN类单锌指蛋白在雄蕊、花及果实发育过程中
具有重要作用(翟晓霏等, 2010)。此外, 目前已经发现
参与胁迫应答反应的植物C2H2型锌指大多都具有双
302 植物学报 51(3) 2016


图5 NaCl、Mannitol和ABA胁迫处理对野生型和转基因拟南芥
株系种子萌发的影响
(A) NaCl (100 mmol·L–1)、Mannitol (200 mmol·L–1)和ABA
(0.5 μmol·L–1)处理7天后野生型和转基因株系拟南芥种子的萌
发表型; (B) NaCl、Mannitol和ABA胁迫下野生型和转基因株系
拟南芥种子萌发率的统计。数据来自独立重复3次实验, 其中,
** 表示P<0.01水平差异极显著; WT: 野生型; L3, L5: 转基因
株系

Figure 5 The effects of salt, drought and ABA stress on the
seeds germination in wild-type and transgenic plants
(A) The phenotypes of the seed germination under stress of
1/2MS medium containing NaCl (100 mmol·L–1), Mannitol
(200 mmol·L–1) and ABA (0.5 μmol·L–1), respectively, after 7
days of growth; (B) Statistic analysis of the seed germination
rates in wild-type and transgenic Arabidopsis under salt,
drought and ABA stress, respectively, after 7 days of growth.
Data were obtained from three independent experiments, **
indicate significant differences at P<0.01; WT: Wild type; L3,
L5: Transgenic lines

图6 NaCl、Mannitol和ABA胁迫8天后对野生型和转基因拟南
芥幼苗主根的影响
(A) 处理8天后含不同浓度NaCl (100和200 mmol·L–1)、
Mannitol (200和300 mmol·L–1)以及1 μmol·L–1 ABA的1/2MS培
养基中幼苗的表型; (B) NaCl、Mannitol和ABA胁迫8天后野生
型和转基因拟南芥幼苗主根长度统计。数据来自独立重复3次实
验, 其中 ** 表示P<0.01水平差异极显著; WT: 野生型; L3,
L5: 转基因株系

Figure 6 The effects of salt, drought and ABA stress on the
seedlings primary root of wild-type and transgenic lines
(A) The phenotypes of the seedlings on 1/2MS medium con-
taining NaCl (100 mmol·L–1, 200 mmol·L–1)、Mannitol (200
mmol·L–1, 300 mmol·L–1) and 1 μmol·L–1 ABA, respectively,
after 8 days of growth; (B) Statistic analysis of the seedlings
primary root length in wild-type and transgenic lines under
salt, drought and ABA stress, respectively. Data were ob-
tained from three independent experiments, ** indicate sig-
nificant differences at P<0.01; WT: Wild type; L3, L5: Trans-
genic lines
刘慧等: 小拟南芥 ApZFP基因异源超表达促进拟南芥开花并提高耐逆性 303

锌指结构(黄骥和张红生, 2007)。例如, 在拟南芥中过
表达大豆C2H2型锌指蛋白基因GsZFP1可增加植物
的耐冷性和耐旱性(Luo et al., 2012); 过表达拟南芥
的C2H2型锌指蛋白基因AtZAT7可提高转化体的耐
盐性(Shi et al., 2014); 而水稻C2H2型基因ZFP36则
可增强水稻的耐氧化胁迫能力(Zhang et al., 2014)。
小拟南芥能在新疆干旱和盐碱等自然逆境环境
下广泛生存, 表明其具有不同于其它植物的耐逆基因
及响应逆境胁迫生理生态反应的特殊机制(院海英等,
2012; Zhao et al., 2013)。ApZFP基因是郭丹丽等
(2014)利用保守引物同源克隆法从新疆小拟南芥中
克隆的1个C2H2型锌指蛋白同源基因。氨基酸比对分
析表明, ApZFP与拟南芥的AZF1 (Arabidopsis zinc-
finger protein 1)相似性最高。AZF1受干旱、盐和ABA
诱导(Sakamoto et al., 2000); 并且在糖皮质激素诱
导启动子驱动下的转基因拟南芥不仅表现出对盐胁
迫的敏感, 而且植株生长和活力存在缺陷(Kodaira et
al., 2011)。本研究表明, 在高盐、干旱和低温等胁迫
下 , ApZFP基因的表达明显上调 ; 进一步分析了
ApZFP基因上游2 095 bp的启动子, 结果表明启动子
区存在拟南芥AZF1启动子中没有的元件, 如逆境响
应、高效转录和抗氧化作用元件(郭丹丽等, 2014), 暗
示了启动子序列的差异可能是导致二者在不同植物
中功能差异的根本原因。本实验室还开展了小拟南芥
高盐胁迫前后的转录组测序分析, 多个ZFP基因受盐
胁迫诱导表达上调, 这也表明由于物种的进化, 锌指
蛋白基因家族在小拟南芥中起着不同于模式植物拟
南芥中的功能。ApZFP基因参与逆境胁迫的机制究竟
是怎样的? 它与小拟南芥自身耐盐耐旱的特质有什
么联系? 这些问题都需要进一步研究。
虽然C2H2型锌指蛋白广泛参与植物的耐逆和生
长发育, 但是, 在锌指蛋白家族中, 同一个蛋白既可
以参与植物发育又参与耐逆过程的非常少。本研究发
现, ApZFP除了可以提高转基因拟南芥的耐逆性之
外, 还能够促进植株成花, 使得拟南芥开花时间明显
提前(图2A; 表2)。开花是植物由营养生长向生殖生长
转型最重要的过程, 在这个过程中, 调控植物成花的
途径有很多, 在拟南芥中调控开花时间有6条遗传途
径。FT是开花调控途径中的重要整合因子, 能将光周
期、春化、温度和赤霉素途径所感知的信号整合在一
起, 促进下游开花通路相关基因的表达, 并且自主途
径和年龄途径同样可以促进花分生组织基因的表达,
最终促进植物开花(Fornara et al., 2010)。本研究中,
转ApZFP基因植株通过上调光周期途径中AtCO的表
达来升高AtFT的相对表达量, 从而促进转基因植株
早花。而AtFLC的相对表达量在转基因植株中的降低
可能主要是由温度、春化和自主途径共同调节的 ,
AtFLC表达量降低能够促进AtFT的表达上升, 从而促
进拟南芥开花。年龄途径中的AtSPL可以通过直接作
用于花分生组织基因AtAP1的表达来促进开花。因此
推测, ApZFP基因可能处于AtCO、AtFLC和AtSPL的
上游, 通过上调或下调这些基因的下游基因AtFT和
花分生组织基因来共同调控开花。AtFT的下游开花相
关基因AtAP1和AtLFY的表达水平也证明了ApZFP可
以通过多种开花途径来促进拟南芥早花。而
AtGA20OX的表达量没有显著变化, 表明ApZFP基
因可能没有参与到赤霉素途径。本实验通过AtFT和
AtFT上下游一系列的基因表达初步证明ApZFP能够
促进拟南芥开花, 然而调控开花的转变是由多种信号
及多种途径共同调控的, ApZFP基因在促进植物开花
的途径中具体处于什么位置及其作用机制还需要进
一步研究。
参考文献
傅永福, 孟繁静 (1997). 植物的成花决定. 植物生理学通讯
33, 81–87.
郭丹丽, 王崎崎, 吴晓庆, 费春艳, 黄先忠 (2014). 新疆无苞
芥锌指蛋白基因的克隆及表达分析 . 西北植物学报 34,
243–250.
黄骥, 张红生 (2007). TFIIIA型锌指蛋白及在提高植物耐逆性
中的作用. 遗传 29, 915–922.
黄晓丹, 张云贵, 应铁进 (2006). 高质量植物基因组DNA的
提取. 植物生理学通讯 42, 311–314.
孙昌辉, 邓晓建, 方军, 储成才 (2007). 高等植物开花诱导研
究进展. 遗传 29, 1182–1190.
院海英 , 顾超 , 徐芳 , 崔百明 , 黄先忠 (2011). 小拟南芥
Na+/H+逆转运蛋白基因的克隆及生物信息学分析. 石河子
大学学报(自然科学版) 29, 401–407.
院海英, 徐芳, 吕新华, 崔百明, 黄先忠 (2012). 小拟南芥高
盐胁迫诱导cDNA文库的构建与测序分析. 石河子大学学报
(自然科学版) 30, 1–4.
翟晓霏, 靳永胜, 张文, 朱元娣 (2010). SUPERMAN类单锌
指蛋白的研究进展. 分子植物育种 8, 563–566.
304 植物学报 51(3) 2016

张海波, 刘彭, 刘立鸿, 兰海燕, 张富春 (2007). 新疆短命植
物小拟南芥(Arabidopsis pumila)种子萌发特性及其生态适
应性. 生态学报 27, 4310–4316.
Abe M, Kobayashi Y, Yamamoto S, Daimon Y, Yamagu-
chi A, Ikeda Y, Ichinoki H, Notaguchi M, Goto K, Araki
T (2005). FD, a bZIP protein mediating signals from the
floral pathway integrator FT at the shoot apex. Science
309, 1052–1056.
Al-Shehbaz IA, OKane Jr SL, Price RA (1999). Generic
placement of species excluded from Arabidopsis (Bras-
sicaceae). Novon 9, 296–307.
An L, Zhou Z, Sun L, Yan A, Xi W, Yu N, Cai W, Chen X,
Yu H, Schiefelben J, Gan Y (2012). A zinc finger protein
gene ZFP5 integrates phytohormone signaling to control
root hair development in Arabidopsis. Plant J 72, 474–
490.
Clough SJ, Bent AF (1998). Floral dip: a simplified method
for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidop-
sis thaliana. Plant J 16, 735–743.
Corbesier L, Vincent C, Jang S, Fornara F, Fan Q, Searle
I, Giakountis A, Farrona S, Gissot L, Turnbull C,
Coupland G (2007). FT protein movement contributes to
long-distance signaling in floral induction of Arabidopsis.
Science 316, 1030–1033.
Englbrecht CC, Schoof H, Bohm S (2004). Conservation,
diversification and expansion of C2H2 zinc finger proteins
in the Arabidopsis thaliana genome. BMC Genomics 5, 39.
Fornara F, de Montaigu A, Coupland G (2010). Snapshot:
control of flowering in Arabidopsis. Cell 141, 550–550.
Gamsjaeger R, Liew CK, Loughlin FE, Crossley M, Mac-
kay JP (2007). Sticky fingers: zinc-fingers as protein-
recognition motifs. Trends Biochem Sci 32, 63–70.
Guo D, Li C, Dong R, Li X, Xiao X, Huang X (2015). Mo-
lecular cloning and functional analysis of the FLOWER-
ING LOCUS T (FT) homolog GhFT1 from Gossypium
hirsutum. J Integr Plant Biol 57, 522–533.
Hayama R, Agashe B, Luley E, King R, Coupland G
(2007). A circadian rhythm set by dusk determines the ex-
pression of FT homologs and the short-day photoperiodic
flowering response in Pharbitis. Plant Cell 19, 2988–3000.
Hemming MN, Peacock WJ, Dennis ES, Trevaskis B
(2008). Low-temperature and daylength cues are inte-
grated to regulate FLOWERING LOCUS T in barley. Plant
Physiol 147, 355–366.
Huang T, Böhlenius H, Eriksson S, Parcy F, Nilsson O
(2005). The mRNA of the Arabidopsis gene FT moves
from leaf to shoot apex and induces flowering. Science
309, 1694–1696.
Kasuga M, Liu Q, Miura S, Yamaguchi-Shinozaki K,
Shinozaki K (1999). Improving plant drought, salt, and
freezing tolerance by gene transfer of a single stress-
inducible transcription factor. Nat Biotechnol 17, 287–291.
Kim JC, Lee SH, Cheong YH, Yoo CM, Lee SI, Chun HJ,
Yun DJ, Hong JC, Lee SY, Lim CO, Cho MJ (2001). A
novel cold-inducible zinc finger protein from soybean,
SCOF-1, enhances cold tolerance in transgenic plants.
Plant J 25, 247–259.
Kobayashi Y, Weigel D (2007). Move on up, it’s time for
change—mobile signals controlling photoperiod-depend-
ent flowering. Genes Dev 21, 2371–2384.
Kodaira KS, Qin F, Tran LS, Maruyama K, Kidokoro S,
Fujita Y, Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K (2011).
Arabidopsis Cys2/His2 zinc-finger proteins AZF1 and
AZF2 negatively regulate abscisic acid-repressive and
auxin-inducible genes under abiotic stress conditions.
Plant Physiol 157, 742–756.
Kozaki A, Hake S, Colasanti J (2004). The maize ID1
flowering time regulator is a zinc finger protein with novel
DNA binding properties. Nucleic Acids Res 32, 1710–
1720.
Li C, Zhang Y, Zhang K, Guo D, Cui B, Wang X, Huang X
(2015). Promoting flowering, lateral shoot outgrowth, leaf
development, and flower abscission in tobacco plants
overexpressing cotton FLOWERING LOCUS T (FT)-like
gene GhFT1. Front Plant Sci 6, 454.
Lu X, Li Y, Su Y, Liang Q, Meng H, Li S, Shen S, Fang Y,
Zhang C (2012). An Arabidopsis gene encoding a C2H2-
domain protein with alternatively spliced transcripts is
essential for endosperm development. J Exp Bot 63,
5935–5944.
Luo X, Bai X, Zhu D, Li Y, Ji W, Cai H, Wu J, Liu B, Zhu Y
(2012). GsZFP1, a new Cys2/His2-type zinc-finger pro-
tein, is a positive regulator of plant tolerance to cold and
drought stress. Planta 235, 1141–1155.
MacPherson S, Larochelle M, Turcotte B (2006). A fungal
family of transcriptional regulators: the zinc cluster pro-
teins. Microbiol Mol Biol Rev 70, 583–604.
Mansur LM, Orf JH, Chase K, Jarvik T, Cregan PB, Lark
KG (1996). Genetic mapping of agronomic traits using
recombinant inbred lines of soybean. Crop Sci 36, 1327–
1336.
Sakamoto H, Araki T, Meshi T, Iwabuchi M (2000). Ex-
pression of a subset of the Arabidopsis Cys2/His2-type
zinc-finger protein gene family under water stress. Gene
248, 23–32.
Shi H, Wang X, Ye T, Cheng F, Deng J, Yang P, Zhang Y,
刘慧等: 小拟南芥 ApZFP基因异源超表达促进拟南芥开花并提高耐逆性 305

Chan Z (2014). The Cys2/His2-type zinc finger transcrip-
tion factor ZAT6 modulates biotic and abiotic stress re-
sponses by activating salicylic acid-related genes and
CBFs in Arabidopsis. Plant Physiol 16, 1367–1379.
Singh K, Foley RC, Oñate-Sánchez L (2002). Transcription
factors in plant defense and stress responses. Curr Opin
Plant Biol 5, 430–436.
Specht JE, Chase K, Macrander M, Graef GL, Chung J,
Markwell JP, Germann M, Orf JH, Lark KG (2001).
Soybean response to water. Crop Sci 41, 493–509.
Srikanth A, Schmid M (2011). Regulation of flowering time:
all roads lead to Rome. Cell Mol Life Sci 68, 2013–2037.
Sugano S, Kaminaka H, Rybka Z, Catala R, Salinas J,
Matsui K, Ohme-Takagi M, Takatsuji H (2003). Stress-
responsive zinc finger gene ZPT2-3 plays a role in
drought tolerance in petunia. Plant J 36, 830–841.
Takatsuji H (1998). Zinc-finger transcription factors in
plants. Cell Mol Life Sci 54, 582–596.
Takatsuji H (1999). Zinc-finger proteins: the classical zinc
finger emerges in contemporary plant science. Plant Mol
Biol 39, 1073–1078.
Wigge PA, Kim MC, Jaeger KE, Busch W, Schmid M,
Lohmann JU, Weigel D (2005). Integration of spatial and
temporal information during floral induction in Arabidop-
sis. Science 309, 1056–1059.
Wu C, You C, Li C, Long T, Chen G, Byrne ME, Zhang Q
(2008). RID1, encoding a Cys2/His2-type zinc finger tran-
scription factor, acts as a master switch from vegetative to
floral development in rice. Proc Natl Acad Sci USA 35,
12915–12920.
Zhang H, Liu Y, Wen F, Yao D, Wang L, Guo J, Ni L,
Zhang A, Tan M, Jiang M (2014). A novel rice C2H2-type
zinc finger protein, ZFP36, is a key player involved in
abscisic acid-induced antioxidant defence and oxidative
stress tolerance in rice. J Exp Bot 65, 5795–5809.
Zhao YX, Wei YL, Zhao P, Xiang CB, Xu F, Li C, Huang
XZ (2013). Construction of a cDNA library from the
ephemeral plant Olimarabidopsis pumila and preliminary
analysis of expressed sequence tags. Z Naturforsch C 68,
499–508.
Heterologous overexpression of ApZFP Promotes Flowering and
Improves Abiotic Tolerance in Arabidopsis thaliana
Hui Liu, Danli Guo, Darun Cai, Xianzhong Huang*
College of Life Sciences, Shihezi University, Shihezi 832003, China
Abstract Zinc finger proteins (ZFPs) are important transcription factors widely involved in plant growth and develop-
ment, as well as response to abiotic stress. Arabidopsis pumila (synonym: Olimarabidopsis pumila) is a cruciferous
ephemeral plant, possessing biological characteristics of strong photosynthesis, high reproductive capacity and drought
tolerance, and is more tolerant to salt stress than A. thaliana. To study the physiological functions of A. pumila ZFP
(ApZFP), the 35S::ApZFP construct we cloned previously was transformed into Arabidopsis (Col-0) by the floral dip
method, then independent transgenic lines were determined. Overexpression of ApZFP in Arabidopsis promotes Arabi-
dopsis flowering under long- and short-day conditions. Quantitative real-time RT-PCR revealed that overexpression of
ApZFP in Arabidopsis increases the expression of the photoperiod pathway gene CO, age pathway gene SPL, FT en-
coding florigen gene and downstream flowering-related genes AP1 and LFY; it decreases the expression of the vernali-
zation, autonomous and ambient temperature pathway gene FLC. In addition, the germination rates are higher in
35S::ApZFP transgenic plants than the wild type, and the primary root length during seedling growth is longer under
abiotic stress such as salt, mannitol and ABA treatment. ApZFP has multifaceted roles during plant development, par-
ticipating in flowering transition and stress tolerance in Arabidopsis.
Key words Arabidopsis pumila, Olimarabidopsis pumila, zinc finger protein, early flowering, stress tolerance
Liu H, Guo DL, Cai DR, Huang XZ (2016). Heterologous overexpression of ApZFP promotes flowering and improves
abiotic tolerance in Arabidopsis thaliana. Chin Bull Bot 51, 296–305.
———————————————
* Author for correspondence. E-mail: xianzhongh106@163.com
(责任编辑: 朱亚娜)