全 文 ：第 25卷　第 4期　　　　　　　　　　　　　植　　　物　　　研　　　究 2005年　10月
Vo .l 25　No. 4　　　　　　　　　　　　BULLETIN OF BOTAN ICAL RESEARCH Oc.t , 　2005
基金项目:国家自然科学基金项目;新天石大科研基金(XS20000P)
第一作者简介:朱新霞(1968— ),女 ,硕士 ,副研究员 ,主要从事生物技术研究。
收稿日期:2004 - 09 - 17
小拟南芥 chitinase基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达
朱新霞 1　田丽萍 2　高剑峰 2　祝建波 1
(1.新疆兵团绿洲生态农业重点实验室 ,石河子　832003)
(2.石河子大学生物工程学院 ,石河子　832003)
摘　要　以野生资源小拟南芥 (Arabidopsis pum ila)chitinase基因的 cDNA为基础 ,采用基因重组
技术 ,将该基因按正确的阅读框架定向克隆于原核表达载体 pET-30a(+)中 ,转化大肠杆菌 BL21
(DE3),用 IPTG诱导表达 ,并对表达产物进行 SDS— PAGE分析。结果表明:重组小拟南芥 chiti-
nase基因在大肠杆菌中获得高效表达 ,其分子量约为 40 KD。小拟南芥 chitinase基因原核表达载
体的成功构建和重组小拟南芥 chitinase蛋白在大肠杆菌中的高效表达 ,为进一步研究其生物学功
能奠定了基础。
关键词　小拟南芥;ch itinase;表达载体构建;基因表达
Construction of prokaryotic expression vector ofArabidopsis pum ila
chitinase and its expression inE scherichia coil
ZHU X in-X ia1　TIAN Li-P ing2　GAO Jian-Feng2　ZHU Jian-Bo1
(1. Key Labo rato ry of Oa sis Eco logy Agriculture o f X in jiang B ing tuan, Shihezi　832003)
(2. Co llege o f B io-eng inee ring, Sh ihezi Un ive rsity, Shihe zi　832003)
Abstract　Prokaryo tic expression vector pET—CH o fArabidopsis pum ila chitinase gene cDNA was con-
struc ted by means of recombinant gene techno logy and expressed inE scherichia coil BL21 under induc-
tion of IPTG , the exp ressed products w ere detected by SDS— PAGE analysis. Result show:Recombi-
nan t chitinase w as efficien tly expressed inE. coli BL21, itmo lecularwe ightw as about 40KD. The suc-
cessfu l construction of prokaryo tic expression vecto r containing Arabidopsis pum ila chitinase gene and ef-
fec tive expression of recombinan t ch itinase inE. coli BL21 laid the foundation fo r fu rther study on its bi-
ological function.
Key words　Arabidopsis pum ila;chitinase;cDNA cloning vectors;gene expression
chitinase是一种能降解几丁质(N-乙酰氨基葡
萄糖线性聚物 )的糖苷酶 [ 1] ,多种动物 、植物 、微生
物已经发现可产生几丁质酶。在植物中 ,几丁质酶
可分布于根 、茎 、叶 、花器 、果实 、种子诸器官。植物
几丁质酶的产生可分为组成型的和诱导型的 ,在正
常情况下 ,植物中几丁质酶活性较低 ,但经诱导因
子诱导 ,活性会迅速升高。植物几丁质酶基因作为
抗病基因 ,通过遗传转化 ,提高农作物抗病性已有
不少成功的先例 [ 2 ～ 6] ,在作物抗病基因工程中日益
显示出重要性。
2000年底研究人员已经完成了对拟南芥整个
基因组的测序工作 ,随着拟南芥基因与功能组学的
不断深入发展 ,有关这种模式植物近缘种群相关基
因的研究也越来越引起人们关注 ,小拟南芥是拟南
芥在中国新疆分布的一个有特色的近缘种 ,具有个
体小 、形态结构简单 、生长周期短 、繁殖系数高 、对
极端环境有很好的抗性等特点。作者以小拟南芥
总 RNA 为模板 , 采用逆转录—聚合酶链式反应
(RT— PCR)和基因重组技术 ,成功地完成了新疆
特色野生资源小拟南芥 chitinase基因的分子克隆
与序列测定 [ 7] ,在该研究基础上 ,我们拟构建小拟
南芥 chitinase基因的原核表达载体 ,并在大肠杆菌
中进行表达 。
1　材料和方法
1. 1　材料
野生小拟南芥采自新疆石河子地区 ,重组质粒
PBS—CH为自行构建 (含有完整的小拟南芥 ch iti-
nase cDNA序列 )。原核表达载体 pET-30a,大肠杆
菌 E scherichia coli DH5α,表达宿主菌 E scherichia
coli BL21(DE3)为本实验室保存菌株 。琼脂糖凝
胶 DNA回收 K it购自北京天为时代公司 , DNA
M arker、BamH I和 Sa lI限制性内切酶购自 TaKaRa
公司。
1. 2　方法
1. 2. 1　原核表达载体的构建
用上下游引物 5′端插入的 BamH I和 Sal I酶切
PBS—CH 质粒 , 回收 chitinas基因片段 , 再用
BamH I和 Sa lI酶切 pET-30a质粒 ,回收载体片段 ,
将 ch itinase基因片段和 pET-30a的载体片段在 T4
连接酶的作用下 4℃连接过夜 。连接产物转化感
受态 E. coil DH5α,涂在含有 kan的 LB平板上。
挑取生长良好的单菌落 ,接种于含有卡那霉素的
LB培养基中 , 37℃摇菌培养过夜 ,利用碱裂解法进
行质粒的小量提取 ,提取的质粒先用 PCR鉴定 ,再
进一步用 BamH I和 Sa lI酶切验证鉴定阳性克隆。
1. 2. 2　重组质粒在大肠杆菌中的表达
经 PCR验证和酶切鉴定正确的重组表达质粒
pET—CH , 用来转化表达宿主菌 E. coli BL21
(DE3),同时转化空白质粒 pET30作为对照。转化
菌涂布于含有卡那霉素的 LB琼脂平板上 , 37℃培
养过夜 。挑取生长良好的单菌落 ,接种于 20mL含
50 mg L -1卡那霉素的 LB培养基中 , 37℃摇菌培
养过夜 。按 1:100接种于 100 mL含有卡那霉素的
LB培养基中 , 37℃摇菌继续培养至 OD600约为 0. 6
时 ,加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 (IPTG)
至终浓度为 1mmol L - 1 ,于 25 ～ 37℃诱导表达 ,
之后每隔 2 h取出一定菌液待用 。
1. 2. 3　细胞内总蛋白质的制备
取经 IPTG 诱 导 处 理 的 细 菌 培 养 物 ,
60 000 r m in-1离心 10m in,收集菌体 , 沉淀重悬
于1 /10体积的 50 mm Tris buffe r(pH8. 0)中 ,保温
30m in, 反 复 冻 融 数 次 , 用 超 声 波 处 理 ,
12 000 r m in-1离心5 m in,分别收集上清和沉淀 ,
加10 μL 1×SDS— PAGE上样缓冲液 ,混匀后在沸
水浴中放置 5m in,迅速置于冰上备用。
1. 2. 4　SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳检测表达蛋白
蛋白表达用体积分数为 10%的 SDS— PAGE
电泳检测。
以上各步骤连接 、转化 、酶切及 SDS— PAGE
电泳反应参考 Samb rook J[ 8]方法进行。
图 1　小拟南芥 pET— CH的 PCR鉴定
1. PCR产物;M. DNA分子量标记
F ig. 1　PCR identifica tion o f recomb inan t p lasm id pET— CH
1. PCR p roducts;M. M arkerDL15000
图 2　小拟南芥 pET— CH的酶切鉴定
1. PET— CH双酶切;M. DNA分子量标记
F ig. 2　Restric tion endonucleases digestive identification of
recom binant p lasm id pET— CH
1. pET— CH digested w ithBamH I andSa lI;M. M arker
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2　结果
2. 1　原核表达质粒 pET—CH的构建和鉴定
PBS—CH质粒用 BamHI和 Sa lI双酶切后 ,回
收 chitinase基因片段 ,将其定向克隆到原核表达载
体 pET-30a的 BamH I和 Sa lI酶切位点之间 ,构建
原核表达质粒 ,分别进行 PCR鉴定和 BamH I /Sa lI
双酶切鉴定 。小拟南芥 chitinase cDNA 全长为
984 bp,加上引入的 BamH I和 Sa lI两个酶切位点 ,
预计扩增产物为1 000 bp左右。 PCR产物经 1. 0%
琼脂糖凝胶电泳 ,结果如图 1所示 ,在相对分子量
为 1 000 bp处有 1条特异性扩增条带 ,与预计大小
相一致 。重组质粒经 BamH I和 Sa lI双酶切 ,可得
到 1条约 1 000 bp的条带和 1条与 pET-30a空载体
(5. 6 KB)一致的条带 (图 2),表明 chitinase基因
已插入原核表达质粒中 ,该质粒被命名为 pET—
CH。
2. 2　重组质粒在大肠杆菌中的表达
将重组质粒 pET—CH转化表达宿主菌 E. coli
BL21(DE3),扩大培养后进行诱导表达。经不同
浓度 IPTG (0. 1 ～ 1. 0mmo l /L) 、不同温度 (25 ～
37℃)和不同时间(间隔 2 h)诱导表达摸索后 ,获得
该蛋白的最佳表达条件:1. 0 mo l /L IPTG , 37℃。取
诱导前和诱导后细菌进行蛋白质变性电泳(图 3),
表达时相显示诱导 4 h后表达的量达到最高 ,随着
诱导时间增加 ,表达量有所降低 ,表达产物分子质
量的大小约为 40 KD ,预计表达产物 N—末端含有
从载体序列表达的 49个氨基酸 , C—末端含有从
克隆序列表达的的 321个氨基酸 ,预计分子量大小
为40 KD ,表达产物大小与理论预计值相符 。
图 3　重组质粒表达产物的 SDS— PAGE分析
1. pETCH诱导 2 h沉淀;2. pETCH诱导 4 h沉淀;3. pETCH诱导 6 h沉淀;4. pETCH过夜诱导沉淀;
5. pETCH无诱导沉淀;6. pET30 a沉淀;M. 蛋白质分子量标准
F ig. 3　SDS— PAGE ana ly sis o f expressed produc ts of re combinan t p lasm id
1. Induced cells IPTG or 2 h;2. Indu ced cells IPTG or 4 h;3. Indu ced ce lls IPTG or 6 h;4. Indu ced cel ls IPTG overn igh t;
5. Un induced deposit of pETCH;6. Deposit of pet-30 a vector;M. P ro tein m ark ers
3　讨论
随着对植物几丁质酶研究的深入 ,发现其具有
广泛的生物学作用。 Schlumbaum[ 9]于 1986年首次
报道了提纯的菜豆几丁质酶具抗真菌活性 ,现证明
提纯的烟草 、马铃薯 、黄瓜 、菜豆 、豌豆 、鹰嘴豆 、甜
菜 、水稻 、小麦 、大麦 、玉米等的几丁质酶对立枯丝
核菌 (Fusarium so lani)等 20多种真菌的菌丝生长
或孢子萌发具有抑制作用 。 Kai Jun Zhao[ 10]从芥
菜中克隆的 1个几丁质酶基因 (B jCH I1),编码的
酶具 2个几丁质结合域 ,证实对大肠杆菌有毒害作
用。 A ry[ 11]从珍珠草中分离到的一种几丁质内切
酶能抑制昆虫 α-淀粉酶活性 ,也能有效地抑制蝗
虫等虫类的消化。另研究还发现植物几丁质酶基
4214期 朱新霞等:小拟南芥 chitinase基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达
因参与了植物的发育调控 ,如几丁质参与了胡萝卜
和云杉的体胚发育过程。
小拟南芥 (Arabidopsis pum ila)是拟南芥在中
国新疆分布的一个有特色的近缘种 ,对极端逆境有
很好的抗性 , 90年代起 ,国外一些实验室已陆续克
隆出拟南芥 chitinase基因 ,而有关小拟南芥 ch iti-
nase基因的克隆至今未见报道 , 最近 ,我们采用
RT— PCR方法 ,首次成功克隆了小拟南芥 chitinase
基因[ 7] 。通过对小拟南芥 ch itinase基因 cDNA的
克隆与序列分析 ,我们发现小拟南芥 chitinase基因
与国际上报道的 Arabidopsis thaliana g lycosy l hydro-
lase fam ily 19 (chitinase) (A t1g05850) mRNA ,
comp le te cds(登录号 NM - 100466)、Arabidopsis
thaliana putative c lass I chitinase (A t1g05850)mR-
NA , comple te cds(AY034935)、Arabidopsis thaliana
chitinase-like pro tein 1 (CTL1) mRNA , CTL1—
ELP1 a lle le, complete cds(AF422178)有 93%序列
同源性 ,包含 cDNA完整的 963个核苷酸编码序
列 ,核苷酸序列有 57个碱基差异 ,编码的 321个氨
基酸有 13处差异 , 为进一步研究小拟南芥 ch iti-
nase基因的生物功能 ,我们采用基因重组技术 ,将
chitinase基因按正确的阅读框架定向克隆至原核
表达载体 pET30a中 ,成功地构建了 ch itinase基因
的重组表达载体 ,转化大肠杆菌 BL21(DE3)后 ,该
基因与氨基末端的 6—组氨酸标签作为融合蛋白
进行了诱导表达 ,表达的重组蛋白分子大小与理论
值相符 ,这为以后的分离和纯化提供了良好的条
件 。重组 chitinase蛋白的分离 、纯化及其生物学活
性测定等正在进行之中。
本研究成功地构建了小拟南芥 chitinase基因
的原核表达载体 ,并在大肠杆菌中高效表达出目的
蛋白 ,为进一步研究小拟南芥 chitinase基因的生物
功能和应用奠定了良好基础。
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