全 文 :植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2012, 47 (2): 149–154, www.chinbullbotany.com
doi: 10.3724/SP.J.1259.2012.00149
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收稿日期: 2011-08-26; 接受日期: 2011-12-06
基金项目: 国家科技重大专项课题“中药材种子种苗和种植(养殖)标准平台”(No.2009ZX09308-002)
* 通讯作者。E-mail: xeli@implad.ac.cn; minjianqin@163.com
GC-MS技术在延胡索块茎代谢产物研究中的应用
王鹏飞1, 王倩倩3, 李先恩2*, 秦民坚1*
1中国药科大学, 南京 210009; 2中国医学科学院药用植物研究所, 北京 100193; 3吉林农业大学, 长春 130118
摘要 采用气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术建立了延胡索(Corydalis yanhusuo)块茎形成过程中代谢产物的代谢组学研究
方法。考察了不同体积提取液和衍生化试剂MSTFA对峰的信号强度和个数的影响, 优化了实验条件, 确定每100 mg材料用
300 μL提取液与100 μL衍生化试剂MSTFA时, 效果最佳。对延胡索块茎样品进行测定, 结果共得到92种化合物, 分别为: 5
种脂肪酸、21种有机酸、16种氨基酸、6种糖类、23种其它成分和21种未知化合物; 并且利用主成分分析(PCA)数据处理
方法对延胡索块茎代谢产物进行了模式识别研究。结果表明: 该实验方法稳定、可靠, 且在主成分分析模式下其识别结果
有明显的分类, 因此可为延胡索块茎的进一步研究提供有效数据, 并为相关研究提供参考。
关键词 延胡索, 气相色谱-质谱联用, 代谢组学, 主成分分析
王鹏飞, 王倩倩, 李先恩, 秦民坚 (2012). GC-MS技术在延胡索块茎代谢产物研究中的应用. 植物学报 47, 149–154.
延胡索(Corydalis yanhusuo)隶属罂粟科(Papa-
veraceae)紫堇属(Corydalis); 其块茎别名元胡、玄胡
和玄胡索, 具有活血、利气和止痛之功效, 可入药并
用于胸胁、脘腹疼痛、闭经痛经、产后淤阻和跌扑肿
痛等的治疗。其主要成分(如延胡索甲素和延胡索乙
素等)为叔胺和季胺类生物碱等次生代谢产物。目前,
尚缺乏对延胡索代谢组学的相关研究。对延胡索块
茎代谢产物的研究可为其块茎生长发育的研究提供
依据。
代谢组学(metabolic)主要是通过对生物样品中
低分子量的代谢产物(如有机酸、脂肪酸、氨基酸和
糖)衍生化处理后, 进行定性和定量分析。目前代谢组
学的研究方法主要有: 气相色谱-质谱联用(gas chro-
matography-mass spectrometer, GC-MS)技术、核磁
共振(nuclear magnetic resonance, NMR)技术、液相
色谱(liquid chromatography, LC)技术和傅立叶变换
红外光谱-质谱联用(Fourier transform infrared spec-
trometer-mass spectrometer, FTIR-MS)技术。其中,
应用最为广泛的是GC-MS技术(尹恒等, 2005)。例如,
应用气相色谱-质谱联用技术对马铃薯(Solanum tu-
berosum)(Roessner et al., 2000, 2001a, 2001b)、番
茄 (Lycopersicum esculentum)(Roessner-Tunali et
al., 2003)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)(Fiehn et al.,
2000; Taylor et al., 2002)、南瓜(Cucurbita moschata)
(Fiehn, 2003)和苜蓿(Medicago sativa)(Huhman and
Sumner, 2002)的代谢产物进行分析, 为植物代谢多
样性的研究提供有效参考。本研究采用GC-MS技术对
延胡索地下变态块茎的代谢产物进行了分析, 利用质
谱数据库对其色谱峰进行了定性和定量测定, 并采用
主成分分析(principal components analysis, PCA)数
据处理方法对数据进行了模式识别, 从而为其代谢组
学的进一步研究提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
于当年9月, 将小叶型的延胡索(Corydalis yanhusuo
W. T. Wang)种植于温室花盆(30 cm × 30 cm × 20
cm)中, 次年2月末开始采样。每隔5天取样1次, 共取
样10次, 4月中旬采收完毕。由于其块茎的生长周期约
为30天, 因此实验分别取生长0、10、20、30和40天
5个不同时期的块茎作为研究对象。
·技术方法·
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1.2 仪器与试剂
实验仪器包括Varian431-GC varian 300-MS气相色
谱-质谱联用系统和Microfuge22R台式微量冷冻离心
机(Beckman, 美国)、HZQ-F160恒温振荡培养箱(奥
赛利特科技, 北京)、DB-5ms(30 mm×0.25 mm, 0.25
μm内径)毛细管气相色谱柱(安捷伦, 美国)、Sigma
3K15型离心机(Sigma, 美国)和CTRVC2-18型真空
离心浓缩仪(博劢行仪器有限公司, 北京)。
实验试剂核糖醇 (rabitol)、甲氧基胺盐酸盐
(methoxyamine hydrochloride)和吡啶(pyridine)均为
色谱纯(晶纯实业有限公司, 上海)。N-甲基-N-三甲基
硅基三氟乙酰胺(N-methyl-N-(trimethylsilyl) trifluoro-
acetamide)购自Sigma Aldrich公司(上海)。甲醇购自
JT Baker公司(美国)。实验用水为娃哈哈纯净水。
1.3 方法
1.3.1 样品提取
取保存在–80°C冰箱中的延胡索块茎, 置于研钵中,
用液氮冷冻充分研磨后, 称取100 mg, 放入1.5 mL
离心管中, 加入1.4 mL甲醇(抑制酶的活性), 置于
–20°C冰箱中保存。实验时, 取出并加入60 μL浓度为
0.2 mg·mL–1的核糖醇(溶解于纯净水, 作为极性成分
的内标), 涡旋15秒后, 将离心管放入金属浴中70°C
恒温15分钟, 每隔5分钟涡旋10秒, 之后放入冷冻微
量离心机中, 12 000 × g离心5分钟。将上清液转移到
一个新的10 mL离心管中, 加入750 μL氯仿(–20°C冰
箱中保存)和1.5 mL纯净水(–4°C), 涡旋15秒, 使极
性相与非极性相充分溶于水和氯仿中。之后12 000 × g
离心5分钟, 取上清液300 μL(极性相)放入1.5 mL离
心管中并在真空浓缩仪中干燥, 备用。
1.3.2 衍生化方法
加入60 μL盐酸甲氧胺(20 mg·mL–1, 溶于吡啶中),
37°C振荡2小时。之后将100 μL MSTFA加入到样品
中, 37°C振荡30分钟后, 移至GC样品瓶中待测。
1.4 GC-MS条件
1.4.1 气相色谱条件
DB-5ms (30 mm × 0.25 mm, 0.25 μm内径)毛细管气
相色谱柱, 10 m保护柱。载气为氦气(99.999%)。流
速为1 mL·min–1。进样模式为不分流进样, 进样量
1 μL。升温程序: 70°C保持5分钟, 以每分钟5°C的速
率升至300°C, 温度最终升高至310°C, 保持10分钟,
并在下次进样前70°C平衡1分钟。
1.4.2 质谱条件
电子轰击(electron impact, EI)离子源, 电子能量70
eV, 传输线温度为260°C, 离子源温度为200°C, 扫
描速度0.6 scan·s–1, 溶剂延迟时间为9–10分钟, 质
量扫描范围m/z为50–600。
1.5 数据分析
采用GC-MS全扫描方式分析延胡索极性代谢产物。
将从GC-MS分析仪上得到的数据文件以简单模式方
式分析, 所有色谱峰通过Varian300自带软件和NIST
进行比对, 进而对代谢物的总离子流图进行色谱峰识
别, 并与峰匹配。利用Spss19.0软件中的主成分分析
数据处理方法对数据进行模式识别研究。
2 结果与讨论
2.1 提取方法的优化
2.1.1 提取液体积的考察
在样品预处理条件相同的情况下, 分别对不同体积的
提取液进行相同衍生化处理, 观察不同提取液体积下
其色谱峰个数的变化情况(图1)。实验结果表明, 每
100 mg材料所用的提取液体积为300 μL时, 得到的
峰信号最强且个数最多, 说明衍生化较充分。
2.1.2 衍生化试剂体积的考察
确定最佳提取液体积后, 取等量300 μL提取液3份,
放入3个1.5 mL离心管中, 分别加入50、100和150 μL
MSTFA衍生化试剂。结果如图2所示, 加入150 μL
MSTFA的谱图其峰数明显要比加入50 μL和100 μL
MSTFA的少; 加入100 μLMSTFA的谱图其峰数明显
要比加入50 μLMSTFA的多, 且峰的信号强度也较
好, 尤其在40分钟时, 二者差异显著。因此衍生化试
剂MSTFA的最佳加入量为100 μL。
王鹏飞等: GC-MS技术在延胡索块茎代谢产物研究中的应用 151
图1 不同体积提取液下色峰个数的变化
Figure 1 Changing of peak numbers with different volume
of extract
2.2 色谱保留时间的稳定性考察
植物代谢物的成分复杂, 色谱峰的数量非常多。直接
对比其不同时期的色谱图, 很难观察到代谢产物的变
化(周艳明等, 2010)。鉴于其保留时间的稳定性对色
谱峰的匹配很重要, 我们随机选择了10个峰, 考察了
其在5次重复分析中保留时间的稳定性(表1)。实验结
果表明 , 多数色谱峰保留时间的相对标准偏差
RSD<0.1%, 仅峰4的RSD为0.49%, 表明此方法有
较好的保留时间稳定性。
2.3 样品的测定
在优化的GC-MS技术条件下, 对生长0、10、20、30
和40天的延胡索的块茎样品进行测定。所得数据通过
图2 不同体积衍生化试剂(MSTFA)的实验结果比较
Figure 2 Comparison of different volumes of derivatization reagent (MSTFA)
152 植物学报 47(2) 2012
表1 保留时间稳定性考察
Table 1 Stability of retention time
Retention time (min) Number
Peak 1 Peak 2 Peak 3 Peak 4 Peak 5 Peak 6 Peak 7 Peak 8 Peak 9 Peak 10
1 9.557 15.936 20.935 23.316 28.867 29.146 32.254 34.151 43.044 45.263
2 9.555 15.940 20.940 23.319 28.867 29.153 32.261 34.154 43.046 45.260
3 9.538 15.937 20.945 23.317 28.982 29.152 32.260 34.158 43.047 45.262
4 9.537 15.941 20.949 23.315 28.899 29.157 32.263 34.160 43.051 45.265
5 9.536 15.938 20.946 23.311 28.868 29.153 32.259 34.152 43.047 45.264
RSD 0.010 4 0.002 0 0.005 5 0.002 9 0.049 6 0.003 9 0.003 3 0.003 8 0.002 5 0.001 9
表2 延胡索块茎代谢产物的GC-MS定性分析
Table 2 Qualitative analysis of Corydalis yanhusuo tubers metabolites with GC-MS
Compound Retention time
(min)
R. match Compound Retention time
(min)
R. match
Lipids L-threonine 19.015 971
Methyl 2-(tms)ethyl malonate 24.993 957 Dl-Ornithine 19.106 848
D-Ribonic acid, γ-lactone 36.812 866 l-Aspartic acid 19.762 840
Trans-9-Octadecenoic acid 36.935 704 N-α-Acetyl-L-Lysine 19.960 744
Trans-13-Octadecenoic acid 37.277 981 L-Citrulline 21.180 827
Carbohydrate L-Proline 22.591 948
D-Fructose 30.034 957 Ornithine 24.726 972
Glucuronic 30.530 957 L-Tyrosine 31.582 935
D-Mannose 38.200 893 Others
D-Turanose 42.436 688 Pentasiloxane 12.693 968
Organic acids Urea 15.111 722
Propanoic acid 9.567 948 Glutamine 24.863 990
Ethanedioic acid 12.114 855 L-Asparagine 26.038 918
Dodecanoic acid 13.265 845 Butanal 27.166 923
Benzoic acid 15.385 899 Cadaverine 20.197 827
Butanedioic acid 17.231 928 N-Acetylglutamine 27.227 719
2-Butenedioic acid 17.886 920 2-Keto-l-gluconic acid 27.807 971
2-Piperidinecarboxylic acid 18.443 884 l-Glutamine 28.318 922
Malic acid 21.318 942 Cadmium 30.293 954
Butenedioic acid 21.722 929 Heptadecanenitrile 31.094 878
Xylonic acid 26.373 899 Myo-Inositol 34.197 935
Ribonic acid 27.555 840 Oleanitrile 35.556 976
Propanetricarboxylic acid 29.157 938 Hexadecanamide 36.408 965
Glucaric acid 30.644 823 9-Octadecenamide 39.413 841
Pantothenic acid 32.596 782 Oleamide 40.160 847
2-propenoic acid 32.947 907 13-Docosenamide 45.844 856
Hexadecanoic acid 33.740 980 Unknown
Galacturonic acid 39.230 870 Tetrasiloxane 8.751 956
Amino acids 3,7-dioxa-2,8-disilanonane 9.453 960
Rlanine 10.886 908 Silanol, trimethyl-, phosphate (3:1) 15.606 932
L-Valine 14.279 960 Disiloxane 20.479 901
L-Isoleucine 16.514 768 Silanamine 22.088 800
Serine tritms 18.359 873 9-Octadecynenitrile 34.449 940
王鹏飞等: GC-MS技术在延胡索块茎代谢产物研究中的应用 153
图3 不同时期延胡索块茎代谢产物主成分分析结果
Figure 3 The principal component analysis of Corydalis
yanhusuo tuber metabolites in different periods
Varian300自带数据库和NIST数据库比对总碎片离
子峰, 进行定性分析; 通过内标核糖醇(0.2 mg·mL–1)
的峰面积与其它峰的峰面积对比进行定量分析。结果
共得到92种化合物, 其中包括: 5种脂肪酸、21种有机
酸、16种氨基酸、6种糖类、23种其它成分和21种未
知化合物。根据所得数据取匹配度大于700(Desb-
rosses et al., 2005)的成分(表2)。
2.4 主成分分析
以5个时期(生长0、10、20、30和40天)的延胡索块茎
提取物为分析对象, 采用PCA方法对其GC-MS代谢
产物数据进行统计分析, 根据主成分载荷因子可知何
种代谢物对分类贡献最大, 这种代谢物可被认为是延
胡索生长过程中的生物标志物。由PCA得分图(图3)
可知, 不同时期延胡索块茎的代谢物间有明显的分
类。生长40天(成熟后期)的延胡索块茎, 其代谢物与
其它时期相比有明显的区别, 0和10天两个生长起始
时期的分类也较为明显, 而20天和30天两个接近成
熟时期的分类比较相近, 从而推知样品组差异显著
(图3)。
衍生化试剂对代谢产物的测定十分重要。其不同
体积及加入时间对待测的代谢产物的影响非常明显。
本实验确定了最佳提取液体积为300 μL和最佳衍生
化试剂体积为100 μL。在此条件下, 共得到92种化合
物。实验所得色谱峰信号较强、峰数较多且稳定性较
好, 其定性结果匹配度也较高, 说明该实验方法稳
定、可靠。
通过对延胡索块茎5个不同生长时期的测定数据
进行主成分分析, 结果表明, 不同生长时期的延胡索
块茎, 其代谢产物在主成分模式分析下差异显著, 可
为延胡索块茎的进一步研究提供有效数据。然而, 鉴
于不同生长时期的成分存在差异且这些成分在代谢
途径中起何种作用目前尚不清楚, 故需进一步研究。
今后的任务将是结合转录组与基因组的相关研究作
进一步探索, 这也是本课题组未来的研究重点。
参考文献
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Metabolites Research of Corydalis yanhusuo Tubers with Gas
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Pengfei Wang1, Qianqian Wang3, Xianen Li2*, Minjian Qin1*
1China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, China; 2Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of
Medical Sciences, Beijing 100193, China; 3Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China
Abstract We established the metabolomics method for investigating metabolites in Corydalis yanhusuo bulbs by gas
chromatography-mass spectrometry. We also investigated the effect of different volumes of extracts and derived reagents
(MSTFA) for peak signal intensity and numbers. We determined the best conditions with each 100 mg material extracted
by use of 300 μL extract and 100 μL MSTFA. To detect samples of C. yanhusuo tuber, we obtained 92 kinds of com-
pounds, which contained 5 fatty acids, 21 organic acids, 16 amino acids, 6 sugars, 23 other ingredients, and 21 unknown
compounds. We also studied the pattern recognition of C. yanhusuo tuber metabolites by principal component analysis.
We could provide valid data and reference values for further research into C. yanhusuo tubers.
Key words Corydalis yanhusuo, gas chromatography-mass spectrometry, metabolomics, principal component analysis
Wang PF, Wang QQ, Li XE, Qin MJ (2012). Metabolites research of Corydalis yanhusuo tubers with gas chromatogra-
phy-mass spectrometry. Chin Bull Bot 47, 149–154.
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* Authors for correspondence. E-mail: xeli@implad.ac.cn; minjianqin@163.com
(责任编辑: 孙冬花)