全 文 ：植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2010, 45 (5): 556–565, www.chinbullbotany.com
doi: 10.3969/j.issn.1674-3466.2010.05.005

——————————————————
收稿日期: 2009-09-28; 接受日期: 2010-01-31
基金项目: 国家自然科学基金(No.30600479, 30872042)、教育部新世纪优秀人才支持计划专项基金(No.NCET-07-0084)、人事部留学
回国人员优秀类专项基金、教育部科学技术研究重大项目(No.307006, 109022)、全国百篇优秀博士论文专项基金(No.200770)和长江学
者专项基金
* 通讯作者。E-mail: zdqcaf@yahoo.com
小叶杨DREB同源基因内SSR的发现及群体结构分析
卫尊征1, 2, 杜庆章1, 2, 郭琦1, 2, 张金凤1, 2, 李百炼1, 2, 张德强1, 2*
1北京林业大学林木花卉遗传育种教育部重点实验室, 北京 100083; 2北京林业大学林木育种国家工程实验室, 北京 100083
摘要 利用基因特异的PCR引物从小叶杨(Populus simonii)经干旱胁迫后构建的cDNA文库中扩增得到长度为671 bp的
PsDREB cDNA克隆。该基因内部含有完整的且大小为543 bp的开放阅读框, 可编码181个氨基酸残基。在此基础上, 对36
株小叶杨基因型个体的DREB基因进行了克隆和序列分析, 发现其内部存在以CAC为基本单位的4次(A)、5次(B)、7次(C)、
8次(D)、9次(E)、10次(F)和11次(G)7种类型的简单重复序列(SSR)。以该重复序列为扩增对象设计引物, 对我国11个省16
个群体528株小叶杨进行了群体遗传结构分析。结果表明, 在检测群体中各位点等位基因频率大小顺序依次为: D＞C＞F＞
E＞A＞G＞B; 平均有效等位基因数为3.167 0, 平均观察和期望杂合度分别为0.468 5和0.531 5, 且在多数群体中存在一
定程度的近交效应和显著偏离Hardy-Weinberg平衡; 而Ewens-Watterson中立性检验表明, 除山西宁武、辽宁朝阳和河南
伊川外, 其它多数群体均属于中立性选择。研究结果将为利用候选基因内SSR标记来评价林木育种资源的遗传多样性以及
保护和利用这些资源提供科学的理论依据。
关键词 DREB, 群体结构, 小叶杨, SSR
卫尊征, 杜庆章, 郭琦, 张金凤, 李百炼, 张德强 (2010). 小叶杨DREB同源基因内SSR的发现及群体结构分析. 植物学报
45, 556–565.
干旱、高盐和低温胁迫是影响森林生产力及限制
林业生产的主要非生物胁迫因素。随着我国人口数量
的剧增、耕地面积的锐减和生态环境的日益恶化, 选
育抗旱、耐盐和能够在极端温度环境中生长的树木就
显得颇为重要, 同时它也是加速“三北”防护林工程
建设步伐和解决西部大开发问题的根本途径。DREB
是植物体内编码脱水应答元件结合蛋白(dehydration
responsive element binding protein)的一种重要转录
因子基因(Liu et al., 1998)。与先前发现的胁迫相关基
因的特性及作用方式有所不同, 它是一种DRE(dehy-
dration responsive element)顺式作用元件, 普遍存
在于干旱、高盐和低温等环境胁迫应答基因的启动子
中, 并能够诱导多种胁迫条件下的基因表达, 从而在
转录水平上起到调控作用(其作用不依赖于信号转导
途径)(Kasuga et al., 1999; Zhang et al., 2004)。通过
将DREB基因分别转入模式植物——拟南芥(Arabid-
opsis thaliana)和烟草(Nicotiana tabacum)等以及主
要农作物——水稻(Oryza sativa)、玉米(Zea mays)和
小麦 (Triticum aestivum)等大量的研究充分证明
DREB的过量表达可有效激活并影响靶基因的表达水
平, 并能够显著提高转化植株对干旱、盐碱和低温环
境的耐受程度, 从而增强植物对多种逆境的抵抗和适
应能力(Liu et al., 1998; Zhang et al., 2004; Sa-
kuma et al., 2006)。据此, 若将这一策略应用于树木
抗逆性状的遗传改良, 在树木中分离DREB基因并对
其进行分子遗传学研究将会为选育能够在干旱、盐碱
和极端温度下生长的抗逆优质品种提供科学的理论
依据。
简单重复序列(simple sequence repeat, SSR),
又称微卫星(microsatellite), 是一种基于核苷酸序列
长度多态性的分子标记技术, 通常以1–6个核苷酸的
串联重复形式出现, 广泛存在于真核生物的基因组
中。据估算每隔10–50 kb的碱基就会有1个SSR位点
出现(Tautz and Schmid, 1998)。依据来源不同, 可将
·研究报告·
卫尊征等: 小叶杨 DREB 同源基因内 SSR 的发现及群体结构分析 557
其分为2类: 一类来源于非编码序列, 如基因间隔区、
启动子区、5′UTR、3′UTR和内含子区域; 另一类来
源于编码区域, 如基因的外显子区。处于非编码区的
SSR保守性较差, 在物种自然演化过程中受到的选
择压较小, 具有较高的多态性, 这对于研究群体的遗
传多样性、构建遗传连锁图谱和亲缘关系鉴定具有非
常重要的意义(Russell et al., 2004; Chabane et al.,
2005)。而编码区的SSR来源于基因的转录区域, 保
守性较强, 多态性较低, 但其在不同物种间的通用性
较高, 如今它正逐渐替代非功能性标记成为研究遗传
多样性、功能基因组、基因结构和进化以及比较作图
等的主要方法和手段(Varshney et al., 2005)。SSR
一般是依据所设计的位于其两侧保守的特异引物进
行PCR扩增获得, 而它的引物开发则主要通过2种途
径来实现: (1) 构建基因组文库、探针杂交或克隆测序
等; (2) 根据已经发表的序列(如EST数据库方法)提
供的序列信息。
本文以我国北方地区分布较为广泛、适应性与抗
逆性均较强的青杨派乡土树种小叶杨(Populus si-
monii)为实验材料, 通过基因特异的PCR扩增获得了
来自11个种源共36株小叶杨个体的DREB的基因组
DNA。在克隆与测序的基础上, 经过序列比对分析发
现在小叶杨自然群体内的DREB编码区存在编码组氨
酸(His)的(CAC)n SSR位点, 并以此位点对我国11个
省528株小叶杨群体进行基因及基因型频率检测, 分
析各个群体中此位点的遗传分布和群体遗传结构并
探讨了其遗传资源的保存策略。研究结果将为我国林
木抗性育种资源的研究、保护和利用提供科学的理论
依据及技术指导。
1 材料与方法
1.1 实验材料
实验选用的528份小叶杨(Populus simonii Carr.)基因
型个体分别来自我国青海、甘肃、陕西、四川、山西、
河北、内蒙古、吉林、辽宁、河南和山东11个省、市、
自治区。
1.2 基因组DNA的提取
按照DNAeasy Plant Mini Kits (Qiagen, Inc., Valen-
cia, CA, USA)试剂盒所描述的方法提取小叶杨基因
组DNA。
1.3 DREB基因的克隆和测序
在对小叶杨经干旱胁迫后构建的cDNA文库进行随机
测序时, 发现了一个与拟南芥DREB基因同源的小叶
杨cDNA克隆。在此基础上设计该基因的特异引物,
从小叶杨中分离出DREB基因。设计的引物为 , F:
5′-TTGCTCTCATCCCAATCCCAA-3′; R: 5′-ACCT-
TCCCACCGTACCACTA-3′。
以小叶杨基因库中按省份和种源挑取的36株个
体的总DNA为模板进行扩增。反应体系总体积为25
μL, 其中含模板DNA约60 ng, 1.5 mmol·L–1 MgCl2,
1 × buffer, 0.12 mmol·L–1 dNTPs, 正、反向引物(浓
度为0.12 μmol·L–1)和1 U Taq酶(上述试剂均购自
Promega公司)。扩增程序为 : 94°C预变性3分钟 ;
94°C变性45秒, 58°C退火30秒, 72°C延伸1分钟, 30
个循环; 72°C延伸10分钟。PCR产物经1.0%琼脂糖凝
胶电泳分离后进行回收和纯化。回收产物与pGEM-T
载体连接, 转化大肠杆菌DH5α后, 筛选蓝白斑并利
用PCR扩增鉴定阳性克隆。由Invitrogen公司进行序
列测定。
1.4 DREB基因测序分析
首先应用FGENESH(http://linux1.softberry.com/be-
rry.phtml)在线软件对扩增序列进行基因结构预测分
析, 并利用NCBI检索其同源核酸序列; 之后再使用
DNAMAN 6.0软件和CLUSTALX软件包等程序推导
出氨基酸序列并进行NCBI检索分析, 同时分别估算
和预测推导蛋白质的分子量和等电点。
1.5 SSR标记的开发
使用CLUSTALX软件对36株小叶杨DREB基因进行
对位排列, 并适当手工校正。对位排列后的序列用
MEGA 4.0软件进行序列间差异分析。经比对后发现,
在DREB33基因序列中存在变异的(CAC)n短片段重
复序列。设计扩增长度为165 bp的引物。具体序列如
下, F: 5′-CTGAGGTTGGAGCTCATGTT-3′; R: 5′-
AGTCAACCGGCCGTGGCTT-3′。
1.6 小叶杨SSR位点的群体多态性检测
利用1.5节所述的SSR引物对不同地区的528个小叶
558 植物学报 45(5) 2010
杨单株进行PCR扩增, 反应体系同1.3节所述。扩增产物
经变性后在6.0%的变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离,
条件是95 J·s–1, 3 000 V, 恒功率电泳约90分钟。之后采
用Tixier等(1997)的银染检测方法进行显色观察。
1.7 SSR数据的统计分析
使用Alberta大学生物技术中心开发的Pop Gene 16
(Population Genetic, Analysis Version 1.3.2)软件对
各群体基因分布情况和群体遗传结构进行分析。其中,
各群体基因分布情况主要包括基因及基因型频率的
分布 , 运用χ2 适合性检验检测基因频率是否符合
Hardy-Weinberg平衡; 群体遗传结构分析则主要包
括观察等位基因数(number of allele, Na)、有效等位
基因数(effective number of alleles, Ne)、群体纯合度
(homozygosity, Hom)、群体杂合度(heterozygosity,
Het)、Wright’s固定指数(Wright’s fixation index, Fis)
和Ewens-Watterson中性检验等内容, 各参数的具体
计算方法参见Nei和Kumar(2000)的报道。
2 结果与讨论
2.1 小叶杨DREB同源基因的克隆及序列分析
在对小叶杨经干旱胁迫后构建的cDNA文库随机测序
时发现了一个与拟南芥DREB基因同源的小叶杨
cDNA克隆, 在此基础上设计基因特异的引物, 以小
叶杨基因组DNA为模板进行PCR扩增, 产物经琼脂
糖凝胶电泳分离、回收、纯化以及转化大肠杆菌等步
骤后进行测序(图1)。由图1可知, 克隆的核苷酸序列
长度约为671 bp。利用在线软件FGENESH和软件
DNAMAN 6.0对其结果(图1)进行分析, 结果表明, 其
序列内部含有完整的开放阅读框, 大小为543 bp, 编
码区起始于ATG密码子(位于第101位碱基处), 终止
于AGT密码子(位于第641位碱基处), 可编码长度为
181个氨基酸残基的蛋白质。估计该蛋白质的分子量
约为20.3 kDa, 等电点为8.51。通过NCBI对其核苷酸
序列进行比对分析, 结果发现其与拟南芥DREB基因
有较高的同源性, 可达到56%, 故将其命名为小叶杨



图1 小叶杨DREB同源基因及其推测的蛋白质序列

Figure 1 Nucleotide and deduced amino acid sequence of homologous DREB fragment from Populus simonii


卫尊征等: 小叶杨 DREB 同源基因内 SSR 的发现及群体结构分析 559
DREB同源基因是合理的。
2.2 小叶杨DREB同源基因序列查新及系统进化
分析
将小叶杨DREB同源基因序列与已公开的拟南芥和水
稻基因序列进行同源性比较, 发现它们与拟南芥和水
稻DREB基因的同源性分别为56%和52%。为了分析
小叶杨DREB蛋白与其它植物DREB蛋白的系统发育
进化关系, 利用BLAST-P程序将推测蛋白质产物的
氨基酸序列与NCBI数据库中注册的拟南芥、水稻、
玉米、小麦、高粱(Sorghum bicolor)、白菜(Brassica
rapa)、棉花(Gossypium hirsutum)、野生大豆(Glycine
soja)、蓖麻(Ricinus communis)、葡萄(Vitis vinifera)
和毛果杨(P. trichocarpa)11个物种DREB蛋白的氨基
酸序列进行了ClustalX序列排列 , 之后利用MEGA
4.0软件中非加权配对算数平均法(unweighted pair-
group method with arithmetic means, UPGMA)构建
了分子系统树, 其中空缺(gap)始终作缺失(missing)
处理, 最后得到了这些DREB蛋白的系统进化树(图
2)。由图2可知, 在有花植物中, DREB蛋白由极点向2
个方向发生了进化, 分为单子叶植物和双子叶植物。
其中单子叶植物分支中主要包括水稻、玉米、小麦和
高粱4个物种的DREB蛋白; 而双子叶植物分支中则
主要包括8个物种的DREB蛋白。双子叶植物分支在
进化过程的起始阶段就分成了2个小分支, 一支以一
年生植物拟南芥和白菜的DREB蛋白为主, 另一支则
主要以多年生植物, 包括棉花、野生大豆、蓖麻、葡
萄以及2个杨树种(毛果杨和小叶杨)共6个物种的蛋白
为主。结果表明, 小叶杨和其它植物DREB蛋白的系
统进化结果与有花植物表型分类系统的结果基本
一致。
2.3 小叶杨DREB同源基因内SSR位点的序列变异
从小叶杨自然群体中选择了36株能够最大程度地反
映其分布范围的个体, 对其DREB基因进行测序和比
对分析后发现在该基因的编码区内存在SSR位点(图
3)。从图2和图3可以看出, 在小叶杨DREB同源基因
中存在编码组氨酸(His)的以“CAC”为基本单位的
SSR位点, 重复次数有4、5、7、8、9、10和11共7
种类型。其中重复8次的个体最多, 有16株, 占个体总



图2 DREB蛋白质的系统发育进化树

Figure 2 The rooted phylogenetic tree of DREB protein

560 植物学报 45(5) 2010


图3 36株小叶杨DREB基因内SSR位点的序列比对
1–24号分别取自青海、陕西、甘肃、四川、山西、河北、内蒙古和吉林8个省区, 平均每个省区3株; 25–36号取自辽宁、河南和山
东3个省区, 平均每个省区4株。

Figure 3 Alignment of simple sequence repeats of DREB among 36 individuals from Populus simonii
Number 1–24 were from Qinghai, Shaanxi, Gansu, Sichuan, Shanxi, Hebei, Inner Mongolia and Jilin province, three trees per
region on average. Number 25–36 were taken from Liaoning, Henan and Shandong province, four trees per region on average.


数的44%; 重复9次的有8株; 重复5次和11次的最少,
仅各有1株。这一结果显示, 既然在高度保守的编码
区内部也发现了变异较为丰富的SSR位点, 就有必
要研究该位点在小叶杨天然群体内的变异情况。
2.4 小叶杨DREB同源基因内SSR位点在不同群
体中的变异
2.4.1 SSR位点在不同群体中的遗传分布
为了检测SSR位点在小叶杨天然群体中的变异情况,
在SSR位点的两端设计引物对在整个群体中收集的
528个基因型个体进行PCR扩增和电泳分离, 统计分
析各群体内SSR位点的等位基因频率(表1)。由表1可
知, SSR位点在小叶杨天然群体中的变异较为丰富,
在分析的群体中共检测到7种等位基因类型, 其重复
序列CAC的重复次数分别为4、5、7、8、9、10和11
次, 分别用字母A、B、C、D、E、F和G表示。另外,
在检测的16个群体中, 等位基因数在3–7之间波动,
并且仅在辽宁朝阳、河南嵩县和河南伊川3个群体中
检测到全部等位基因类型, 在华北地区的张家口和内
蒙古奈曼2个群体中检测到的等位基因类型最少, 仅
为3个。其余群体中则分别检测到3–6个等位基因类
型; 由检测到的不同类型等位基因出现的频率可知,
卫尊征等: 小叶杨 DREB 同源基因内 SSR 的发现及群体结构分析 561
表1 小叶杨自然群体中DREB基因内SSR位点的等位基因频率分布
Table 1 The frequency distribution of the SSR alleles at DREB gene in different natural populations of Populus simonii
Allele frequency Chi-square test Populations Sample
size A B C D E F G χ2 value P
Qinghai huzhu 14 – – 0.785 7 0.107 1 0.071 4 0.035 7 – 27.376 6** 0.000 1
Qinghai qilian 26 – 0.019 2 0.096 2 0.538 5 0.038 5 0.307 7 – 74.391 1** 0.000 0
Qinghai dulan 35 – 0.100 0 0.285 7 0.414 3 0.057 1 0.128 6 0.014 3 55.308 9** 0.000 0
Shaanxi fuxian 45 0.155 6 – 0.155 6 0.366 7 0.211 1 0.055 6 0.055 6 93.109 3** 0.000 0
Shaanxi luochuan 45 0.255 6 – 0.022 2 0.022 2 0.088 9 0.433 3 0.177 8 189.335 4** 0.000 0
Gansu diebu 44 0.056 8 – – 0.204 5 0.613 6 0.125 0 – 30.304 9** 0.000 0
Sichuan kangding 22 0.022 7 – – 0.136 4 0.045 5 0.636 4 0.159 1 39.642 3** 0.000 0
Shanxi ningwu 27 0.055 6 0.222 2 0.277 8 0.388 9 – 0.055 6 – 39.789 2** 0.000 0
Hebei zhangjiakou 48 – 0.020 8 0.510 4 0.468 8 – – – 43.203 2** 0.000 0
Neimeng naiman 31 – 0.016 1 0.629 0 0.354 8 – – – 5.934 4 0.114 8
Jilin tongyu 43 – – 0.604 7 0.279 1 0.093 0 0.023 3 – 32.900 4** 0.000 0
Liaoning chaoyang 32 0.015 6 0.031 2 0.015 6 0.281 2 0.281 2 0.281 2 0.093 8 32.921 6* 0.047 1
Henan songxian 36 0.333 3 0.013 9 0.125 0 0.166 7 0.041 7 0.097 2 0.222 2 89.009 9** 0.000 0
Henan yichuan 35 0.171 4 0.100 0 0.028 6 0.228 6 0.214 3 0.100 0 0.157 1 201.872 6** 0.000 0
Henan luoning 38 – 0.052 6 0.052 6 0.513 2 0.210 5 0.118 4 0.052 6 40.021 5** 0.000 5
Shandong yishui 7 0.357 1 – – 0.214 3 – 0.285 7 0.142 9 6.000 0 0.423 2
Average – 0.089 0 0.036 0 0.224 3 0.292 8 0.122 9 0.167 7 0.067 2 – –
A–G分别代表包含简单序列重复CAC重复次数为4、5、7、8、9、10和11的7种不同等位基因类型。χ2值为各品种群体内不同基因
型分布的Hardy-Weinberg平衡检验值。*P< 0.05; **P < 0.01
A–G represent seven alleles which include 4, 5, 7, 8, 9, 10 and 11 times simple sequence repeats of CAC, respectively. The
values of χ2 are from the test of the distribution of different genotypes for Hardy-Weinberg equilibrium in different population of
Populus simonii. * P < 0.05; ** P < 0.01


尽管有些群体对不同的等位基因类型有一定的偏好
性, 但D类型出现频率最高, B类型出现频率最低。检
测的这7种等位基因类型在16个群体中出现的频率大
小依次为: D(0.292 8)＞C(0.224 3)＞F(0.167 7)＞
E(0.122 9)＞A(0.089 0) ＞G(0.067 2)＞B(0.036 0)。
为了检测小叶杨DREB同源基因内SSR位点在自然
群体中的分布是否符合Hardy-Weinberg平衡, 采用
卡方检验进行了分析。结果表明仅有内蒙古奈曼和山
东沂水2个群体遵循Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05),
其余群体均严重偏离(P<0.01), 表明该基因位点所在
的群体大部分不遵循随机交配模式。
由图4显示的SSR位点在不同自然群体中的基因
型分布可见, 在每一个群体中该位点存在有多种等位
基因类型组合, 在所有群体中共检测到26种组合。除
7种纯合子(AA、BB、CC、DD、EE、FF和GG)组合
外, 其余等位基因则均以杂合子的形式存在。其中基
因型CC、CD和DD是小叶杨群体中存在的主要等位
基因类型 , 分别占全部基因型总数的 11.36%、
18.37%和14.20%。而且基因型数目在不同群体之间
的差异也十分明显。例如我国西北地区的青海都兰和
陕西富县2个群体以及东北地区的辽宁朝阳群体的基
因型变化非常丰富, 数目可达10种以上, 分别为12、
11和12种; 最少的是华北地区的张家口群体, 仅有3
种基因型, 不同群体间等位基因类型相差多达8种以
上, 其余地区群体的基因型则介于4–9种之间。
2.4.2 SSR位点在不同群体中的遗传杂合性分析
遗传杂合度表示被检测位点上各群体内的杂合子出
现频率, 是度量群体遗传变异的一个最适参数。杂合
度越低, 群体的遗传一致性就越高。由表2可知, 总体
来说, 各群体所检测的平均杂合度均较大, 表明各群
体的遗传多样性较为丰富, 选择潜力大。在群体杂合
度遗传变异分析中, 以山东沂水(1.000 0)和河北张家
口 ( 0 .979 2 )2个群体的杂合度最大 , 陕西洛川
(0.200 0)群体的最小。群体纯合度的变化趋势与群体
杂合度相反, 平均为0.468 5。在此基础上, 分别利用
562 植物学报 45(5) 2010


图4 小叶杨自然群体中DREB基因内SSR位点的基因型分布
AA、BB和CA等代表由等位基因A、B、C、D、E、F和G两两组合形成的基因型。

Figure 4 Distribution of different SSR genotype lineages at DREB gene within natural populations of Populus simonii
Genotype AA, BB, CA and so on represent independent assortment of allelic genes: A, B, C, D, E, F and G.


表2 小叶杨自然群体中DREB基因内SSR位点的杂合性分析
Table 2 The analysis of heterozygosity degree of SSR loci at DREB gene in different natural populations of Populus simonii
Observed values Levene’s expected values Populations Sample
size Homozygosity Heterozygosity Homozygosity Heterozygosity
Nei’s ex-
pected
values
Effective
number of
alleles
Wright’s
fixation
index
Qinghai huzhu 14 0.714 3 0.285 7 0.621 7 0.378 3 0.364 8 1.574 3 0.216 8
Qinghai qilian 26 0.730 8 0.269 2 0.383 9 0.616 1 0.604 3 2.527 1 0.554 5
Qinghai dulan 35 0.685 7 0.314 3 0.272 9 0.727 1 0.716 7 3.530 3 0.561 5
Shaanxi fuxian 45 0.555 6 0.444 4 0.225 0 0.775 0 0.766 4 4.281 2 0.420 1
Shaanxi luochuan 45 0.800 0 0.200 0 0.285 6 0.714 4 0.706 4 3.406 2 0.716 9
Gansu diebu 44 0.613 6 0.386 4 0.430 8 0.569 2 0.562 8 2.287 1 0.313 4
Sichuan kangding 22 0.681 8 0.318 2 0.438 7 0.561 3 0.548 6 2.215 1 0.420 0
Shanxi ningwu 27 0.555 6 0.444 4 0.270 4 0.729 6 0.716 0 3.521 7 0.379 3
Hebei zhangjiakou 48 0.020 8 0.979 2 0.475 2 0.524 8 0.519 3 2.080 4 –0.885 5
Neimeng naiman 31 0.322 6 0.677 4 0.514 0 0.486 0 0.478 1 1.916 3 –0.416 8
Jilin tongyu 43 0.674 4 0.325 6 0.446 2 0.553 8 0.547 3 2.209 1 0.405 1
Liaoning chaoyang 32 0.375 0 0.625 0 0.235 6 0.764 4 0.752 4 4.039 4 0.169 4
Henan songxian 36 0.111 1 0.888 9 0.204 2 0.795 8 0.784 7 4.645 2 –0.132 7
Henan yichuan 35 0.285 7 0.714 3 0.161 1 0.838 9 0.826 9 5.778 3 0.136 2
Henan luoning 38 0.368 4 0.631 6 0.321 1 0.678 9 0.670 0 3.030 4 0.057 4
Shandong yishui 7 0.000 0 1.000 0 0.219 8 0.780 2 0.724 5 3.629 6 –0.380 3
Average – 0.468 5 0.531 5 0.344 1 0.655 9 0.643 1 3.167 0 0.158 5

卫尊征等: 小叶杨 DREB 同源基因内 SSR 的发现及群体结构分析 563
Levene’s和Nei’s指数对随机交配模式下的期望群体
杂合度进行预测, 结果表明, 除个别群体(如华中地
区的河南嵩县、伊川和洛宁等)外, 其它地区的Leve-
ne’s期望群体杂合度与观察值相比均变化较大。其中,
以河南伊川(0.838 9)和嵩县(0.795 8)2个群体的群体
杂合度最大, 青海互助(0.378 3)群体最小, 而总体平
均值达0.805 0。同样, 采用Nei’s指数估计的期望杂
合度也得到了相似的结果, 如河南伊川(0.826 9)和嵩
县(0.784 7)群体的杂合度最大, 青海互助(0.364 8)群
体最小, 总体平均值为0.804 2。另以固定指数来衡量
群体观察杂合度与Nei’s期望杂合度间的偏差情况。当
杂合子观察频率小于随机交配情况下的预期频率时,
固定指数为负值。若存在近交效应, 杂合子频率的观
察值则会减小, 固定指数为正值。从表2显示的结果
可以看出, 仅河北张家口、内蒙古奈曼、河南嵩县和
山东沂水4个群体为负值, 其余的群体均为正值。这
一结果表明现有的多数群体在DREB同源基因内
SSR位点存在着一定程度的近交效应。
2.4.3 SSR位点在各群体内的中性选择分析
分子进化的中性理论认为自然群体中分子水平上的
遗传变异在很大程度上是中性的, 各种变异的存在与
否完全取决于遗传漂变和净化选择作用。本研究对遗
传变异情况的进化形式进行了中性选择分析。首先计
算了各群体在该基因座位上杂合度的观察值, 然后根
据中性理论进行样本含量为1 000的模拟群体的遗传
变异预测, 具体结果见表3。从表3可以看出, 除山西
宁武、辽宁朝阳和河南伊川3个群体的F值位于95%置
信区间之外, 其余各群体的F值均位于95%置信区间
内。这表明小叶杨DREB基因内检测的SSR位点在13
个群体内属于中性进化, 在另外3个群体中则受到自
然选择的压力。
2.5 讨论
Hamrick和Godt (1989)在分析了1968–1988年(20年)
内报道的165属449种裸子植物和被子植物的研究结
果之后, 发现物种的繁育系统和分布范围是影响群体


表3 小叶杨群体DREB基因内SSR位点的中性检验
Table 3 Detection of SSR loci within the DREB gene under the Ewens-Watterson neutrality test in different populations of
Populus simonii
Expected value Populations Sample
size
Observed F
F* SE*
Lower limit of 95% CI
of the mean*
UP limit of 95% CI
of the mean*
Qinghai huzhu 14 0.635 2 0.471 2 0.016 7 0.283 2 0.742 3
Qinghai qilian 26 0.395 7 0.435 2 0.018 1 0.250 0 0.754 4
Qinghai dulan 35 0.283 3 0.400 7 0.017 6 0.217 1 0.719 2
Shaanxi fuxian 45 0.233 6 0.422 2 0.020 4 0.222 5 0.758 0
Shaanxi luochuan 45 0.293 6 0.410 9 0.019 0 0.224 9 0.739 5
Gansu diebu 44 0.437 2 0.556 7 0.028 6 0.312 8 0.890 8
Sichuan kangding 22 0.451 4 0.425 1 0.018 2 0.251 7 0.764 1
Shanxi ningwu 27 0.284 0 0.451 0 0.019 6 0.367 4 0.959 0
Hebei zhangjiakou 48 0.480 7 0.664 5 0.032 7 0.363 2 0.937 0
Neimeng naiman 31 0.521 9 0.637 2 0.029 6 0.311 8 0.910 0
Jilin tongyu 43 0.452 7 0.560 4 0.030 1 0.190 4 0.646 5
Liaoning chaoyang 32 0.247 6 0.344 9 0.013 7 0.250 0 0.751 0
Henan songxian 36 0.215 3 0.349 2 0.013 1 0.199 5 0.637 0
Henan yichuan 35 0.173 1 0.354 1 0.013 7 0.202 9 0.647 3
Henan luoning 38 0.330 0 0.405 8 0.018 0 0.226 1 0.736 1
Shandong yishui 7 0.275 5 0.402 3 0.009 1 0.275 5 0.632 7
Average – 0.356 9 0.455 7 0.019 9 0.259 3 0.764 1
* 通过1 000次模拟计算得出的统计结果 * Statistics were calculated by using 1 000 simulated samples

564 植物学报 45(5) 2010
遗传结构的主要因素, 并认为异交和多年生广布种相
对于其它自交种具有更高的遗传多样性。小叶杨是比
较典型的异交树种。它属于雌雄异株, 通常依靠风力
传播花粉和种子, 而且极易扦插成活, 因此在我国北
方地区的平原、沙地 (丘陵)和山区都有分布。文献记
载其天然分布于北起黑龙江、南至四川、东达山东、
西至青海共18个省、市、自治区(吕文, 2002)。由于
小叶杨具有广泛分布和种内杂交较为容易等特点, 其
在长期进化过程中, 逐渐形成了高度杂合且遗传多样
性较为丰富的天然群体。本文以小叶杨转录因子
DREB同源基因内SSR位点检测了全国分布区内小
叶杨自然群体的遗传多样性, 结果表明小叶杨具有很
高的遗传杂合水平。通过研究发现仅此1个位点就有7
个等位基因类型, 平均有效等位基因数为3.167, 平
均观察杂合度和期望杂合度分别为0.531 5和0.655 7。
这一结果明显高于其它多年生木本植物检测的平均
值(P=49.3%, Na=1.76, He=0.148) (Hamrick et al.,
1992)。
另外, 通过对我国主要分布区小叶杨的DREB基
因内SSR位点进行Hardy-Weinberg平衡检验, 发现
其在群体内存在着极显著的不平衡。理论上认为自然
选择、群体内存在近交积累、遗传漂变以及统计上的
群体数量过小等可能是造成不平衡的主要原因(朱之
悌, 1989)。就本文来看, 样本数量少这一因素可以排
除, 因为除山东沂水和青海互助群体样本数量较少之
外, 其余群体的样本数均已达到了统计学标准。而中
性检验表明, 此位点在大多数群体中不受自然选择压
力的影响, 因此可以推测自然选择显然也不是主要原
因(表3)。而对于近交效应积累这一原因, 在本文中可
以找到明显的相关证据。例如多数群体平均观察杂合
度明显低于期望杂合度(表2), 7个纯合子位点占据了
全部基因型的近50%, 相反杂合子却表现出一定程度
的缺乏(图2)。这些遗传参数均暗示了我国目前的小叶
杨群体内可能存在一定程度的近交。而固定指数进一
步证实了小叶杨群体内部存在近交的事实。表2显示
除(如河北张家口和内蒙奈曼等)部分群体外, 其它群
体均存在一定程度的近交效应。研究结果初步表明,
造成不平衡的主要原因是群体内一定程度的近交效
应积累, 此外遗传漂变也可能起了一定的作用。一般
来讲, 杂合体的缺失, 特别是杂合体完全缺失会造成
某些基因从种群的基因库中消失, 致使种群的遗传多
样性降低, 并且还会降低其适应环境的能力。其原因
为生物体的杂合子相对于纯合子在其生长、繁殖能力
及抗逆性等方面均占有很大的优势。根据本研究结果,
为避免各地小叶杨群体遗传多样性下降和遗传资源
退化, 现提出以下3个建议。(1) 应对各地区的小叶杨
资源给予重点保护, 防止其进一步被破坏, 特别是我
国华中(河南)地区以及东北地区的小叶杨群体; (2)
可以有针对性地选择有代表性的资源(如我国西北地
区, 主要是陕西和青海小叶杨)进行异地保护; (3) 在
今后各地小叶杨杂交育种工作中, 有计划、有步骤地
引入其它地区的小叶杨资源进行随机交配, 避免基因
的丧失, 从而增加遗传多样性。
参考文献
吕文 (2002). 中国北方小叶杨. 银川: 宁夏人民出版社. pp.
15–20.
朱之悌 (1989). 林木遗传学基础. 北京: 中国林业出版社. pp.
146–162.
Chabane K, Ablett GA, Cordeiro GM, Valkoun J, Henry
RJ (2005). EST versus genomic derived microsatellite
markers for genotyping wild and cultivated barley. Genet
Resour Crop Evol 52, 903–909.
Hamrick JL, Godt MJW (1989). Allozyme diversity in plant
species. In: Brown AHD, Clegg MT, Kahler AL, Weir BS,
eds. Plant Population Genetics, Breeding and Genetic Re-
sources. Sunderland: Sinauer Associates Inc. pp. 43– 63.
Hamrick JL, Godt MJW, Sherman-Broyles SL (1992).
Factors influencing genetic diversity in woody plant spe-
cies. New For 6, 95–124.
Kasuga M, Liu Q, Miura S, Yamaguchi-Shinozaki K,
Shinozaki K (1999). Improving plant drought, salt, and
freezing tolerance by gene transfer of a single stress- in-
ducible transcription factor. Nat Biotechnol 17, 287–291.
Liu Q, Kasuga M, Sakuma Y, Abea H, Miura S, Yamagu-
chi-Shinozaki K, Shinozaki K (1998). Two transcription
factors, DREB1 and DREB2, with an EREBP/AP2 DNA
binding domain separate two cellular signal transduction
pathways in drought- and low-temperature responsive
gene expression, respectively, in Arabidopsis. Plant Cell
10, 1391–1406.
Nei M, Kumar S (2000). Molecular Evolution and Phyloge-
netics. Oxford: Oxford University Press.

卫尊征等: 小叶杨 DREB 同源基因内 SSR 的发现及群体结构分析 565
Russell J, Booth A, Fuller J, Harrower B, Hedley P, Ma-
chray G, Powell W (2004). A comparison of sequence-
based polymorphism and haplotype content in transcribed
and anonymous regions of the barley. Genome 47,
389–398.
Sakuma Y, Maruyama K, Osakabe Y, Feng Q, Seki M,
Shinozaki K, Yamaguchi-shinozaki K (2006). Func-
tional analysis of an Arabidopsis transcription factor,
DREB2A, involved in drought responsive gene expres-
sion. Plant Cell 18, 1292–1309.
Tautz D, Schmid KJ (1998). From genes to individuals:
developmental and the generation of the phenotype. Phi-
los Trans R Soc Lond B Biol Sci 353, 231–240.
Tixier MH, Sourdille P, Röder M, Leroy P, Bernard M
(1997). Detection of wheat microsatellites using a non-
radioactive silvernitrate staining method. J Genet Breed
51, 175–177.
Varshney RK, Graner A, Sorrells ME (2005). Genic mi-
crosatellite markers in plants: features and applications.
Trends Biotechnol 123, 47–55.
Zhang JZ, Creelman RA, Zhu JK (2004). From laboratory
to field. Using information from Arabidopsis to engineer
salt, cold, and drought tolerance in crops. Plant Physiol
135, 615–621.

DREB Gene and Its Application in Analyzing Population Structure
in Populus simonii
Zunzheng Wei1, 2, Qingzhang Du1, 2, Qi Guo1, 2, Jinfeng Zhang1, 2, Bailian Li1, 2, Deqiang Zhang1, 2*
1Key Laboratory of Genetics and Breeding in Forest Trees and Ornamental Plants, Ministry of Education, Beijing Forestry
University, Beijing 100083, China; 2National Engineering Laboratory for Tree Breeding, Beijing Forestry University,
Beijing 100083, China
Abstract A full-length cDNA clone encoding DREB was isolated from a cDNA library prepared under drought stress by
the gene-specific primer amplification from Populus simonii. The cDNA was 671 bp with an open reading frame (543 bp)
capable of encoding a protein of 181 amino acids. The DREB genomic sequences of 36 unrelated individuals were cloned
and analyzed. A trinucleotide repeat motif of the CAC structural unit was detected within the coding region of DREB. This
simple sequence repeat (SSR) was of 7 types, including 4(A), 5(B), 7(C), 8(D), 9(E), 10(F) and 11(G) times. To evaluate
the diversity of the target SSR in the natural populations of P. simonii, SSR specific primer pairs were used to test the
genetic structure in 16 natural populations of 528 individuals covering 11 provinces of China. The frequency distribution of
the SSR allele from high to low was D＞C＞F＞E＞A＞G＞B in 16 populations. With mean effective number of alleles of
3.167 0, the mean value of observed heterozygosis and expected heterozygosis of the SSR allele was 0.468 5 and
0.531 5, respectively. Most populations with this SSR loci exhibited more or less inbreeding effects and deviated from
Hardy-Weinberg equilibrium. Except for the populations of Ningwu (Shanxi province), Chaoyang (Liaoning province) and
Yichuan (Henan province), this locus was neutral in all the other populations by Ewens-Watterson central testing. These
results provide an important theoretical foundation for evaluating genetic diversity of germplasm resources with SSR
markers within candidate genes and its application in conservation and use of breeding resources in forest trees.
Key words DREB, population structure, Populus simonii, simple sequence repeat
Wei ZZ, Du QZ, Guo Q, Zhang JF, Li BL, Zhang DQ (2010). DREB gene and its application in analyzing population
structure in Populus simonii. Chin Bull Bot 45, 556–565.
———————————————
* Author for correspondence. E-mail: zdqcaf@yahoo.com
(责任编辑: 孙冬花)