全 文 ：植物学报Chinese Bulletin of Botany 2009, 44 (2): 143-158, www.chinbullbotany.com
doi: 10.3969/j.issn.1674-3466.2009.02.002
收稿日期: 2007-09-25; 接受日期: 2007-12-27
基金项目: 深圳市“双百”计划和中国博士后科学基金(No.20080430259)
* 通讯作者。E-mail: zengh@szpku.edu.cn
.特邀综述.
DNA序列在蕨类分子系统学研究中的应用
刘红梅 1, 2, 张宪春 3, 曾辉 1, 2*
1北京大学深圳研究生院城市人居环境科学与技术重点实验室, 深圳 518055; 2北京大学城市与环境学院, 北京 100871
3中国科学院植物研究所系统与进化植物学国家重点实验室, 北京 100093
摘要 在分子系统学研究中, 目的基因或者基因片段的选择是最关键的一步, 由于进化速率的差异, 不同的DNA序列适用于
不同分类阶元的系统发育研究。本文综述了目前蕨类分子系统发育研究中常用的DNA序列分析, 它们分别来自叶绿体基因组、
核基因组和线粒体基因组, 着重阐明叶绿体基因在蕨类分子系统学研究中的应用。本文还简要介绍了分子系统学研究中常见
的问题及解决方法(如内类群和外类群的选择, 适宜DNA片段的选择策略), 总结了目前蕨类植物分子系统学研究所取得的进展
和研究现状, 展望了当今国际蕨类分子系统学的研究趋势。
关键词 DNA序列, 分子系统学, 蕨类植物
刘红梅, 张宪春, 曾辉 (2009). DNA序列在蕨类分子系统学研究中的应用. 植物学报 44, 143-158.
蕨类植物以孢子繁殖, 具有维管系统是植物进化过
程中的一个关键性类群, 起着承上启下的作用(吴兆洪和
秦仁昌, 1991)。蕨类植物在泥盆纪和石炭纪分布广泛
且生长繁盛, 是组成早期陆地生态系统的主要成员。蕨
类植物也是现代植物界的一个重要成员, 它与藻类、菌
类、地衣、苔藓和种子植物并列为现代植物界的 6大
门类。蕨类植物在演化过程中很早就脱离了水体束缚,
适应陆地生态环境, 并且最早出现了真正的维管系统, 其
悠久的演化历史和在植物界中承上启下的地位对于探讨
植物界的系统演化和陆地生态系统的变迁等具有重要意
义(李春香等, 2004c), 尤其对于研究整个陆地植物的起
源和演化具有极其重要的作用(Manhart, 1994, 1995;
Kenrick and Crane, 1997; Qiu and Palmer, 1999; Pryer
et al., 2001)。
近年来, 分子生物学技术在植物系统学研究中的应
用为人们理解不同生物类群之间的系统发育关系提供了
新的证据和手段。与分子生物学技术在被子植物系统
发育研究中呈现的繁盛景象相比, 蕨类植物的分子系统
学研究仍然处于相对落后的阶段。最早的蕨类分子系
统学研究始于Stein(1985)利用叶绿体限制性内切酶对
蕨类植物进行的研究, 而首先利用DNA直接测序方法对
蕨类植物进行研究的是Hasebe等(1993)。蕨类植物的
分子系统学研究虽然起步较晚, 但是经过十多年的发展,
已经取得了很大的进展。本文仅就这方面的研究作一
简要综述, 并侧重介绍DNA序列在蕨类分子系统学研究
中的应用。
蕨类分子系统学研究所用的基因片段涉及植物的3
个基因组(核基因组、叶绿体基因组和线粒体基因组)。
不同的基因组因其结构和功能上的差异, 进化速率有所
不同, 因此为不同分类阶元的系统发育研究提供了多样
化的可供选择的性状来源。总的来说, 核基因组进化最
快, 约为叶绿体基因组的2倍, 线粒体基因组进化最慢,
约是叶绿体基因组的1/3(Wolfe et al.,1987)。目前在
蕨类分子系统学研究中应用的基因片段主要来自叶绿体
基因组。
1 DNA序列在蕨类系统学研究中的应用
1.1 叶绿体基因组
植物叶绿体基因组(chloroplast DNA, CPDNA)为闭合的
144 植物学报 44(2) 2009
双链环状DNA, 长约120-220 kb(多在120-160 kb之
间), 约占植物总DNA的10%-20%。叶绿体基因组分
为4个部分: 2个反向重复区(IRA和 IRB)、大单拷贝区
(large single copy, LSC)和小单拷贝区(small single
copy, SSC)。叶绿体基因组的长度变异主要是由2个
反向重复区序列引起的, 该反向重复序列长度约22-25
kb。与核基因组相比, 叶绿体基因组DNA具有分子量
小、多拷贝和结构简单等特点, 而且叶绿体基因在蕨类
植物中为母系遗传, 在进化过程中很少发生基因重排事
件(Gastony and Yatskievych, 1992), 因此有利于对叶
绿体基因组进行分析和系统学研究。
1.1.1 叶绿体编码基因
1.1.1.1 rbcL基因
rbcL基因编码1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/氧化酶大亚基,
位于 cpDNA的大单拷贝区, 长约 1 400 bp。Ritland
和Clegg(1987)、Zurawski和Clegg(1987)首先提出
rbcL基因是用于植物系统发育研究的合适的基因位点。
叶绿体rbcL基因是目前在蕨类植物乃至整个植物分子
系统学研究中应用最广泛且最重要的分子标记。在种
子植物中, rbcL基因一般应用于远缘属间及科以上分类
群的研究, 但在蕨类植物中rbcL基因被应用于各个分类
阶元的系统学研究。Hasebe等(1994,1995)利用rbcL
基因分别对代表真蕨类所有现存主要谱系58个类群和
蕨类现存33科中的31科99属共256条序列构建了系
统发育树, 发现紫萁科(Osmundaceae)是整个薄囊蕨类
(leptosporangiate ferns)植物的基部类群; 水龙骨科
(Polypodiaceae)、禾叶蕨科(Grammitidaceae)、骨
碎补科(Davalliaceae)、条蕨科(Oleandraceae)、肾蕨
科(Nephrolepidaceae)、 藤蕨科(Lomariopsidaceae)、
鳞毛蕨科(Dryopteridaceae)、金星蕨科(Thelypterida-
ceae)、乌毛蕨科(Blechnaceae)、铁角蕨科(Aspleni-
aceae)和睫毛蕨属(Pleurosoriopsis Fomin)构成一个大
的单系类群; 鳞毛蕨科(Dryopter idaceae)和碗蕨科
(Dennstadiaceae)均为多系类群(polyphyletic group)。
Wolf等(1994)、Gastony和Rollo(1995)与 Zhang等
(2005)运用rbcL基因分别探讨了碗蕨类(dennstaedtioid
ferns)、碎米蕨类(cheilanthoid ferns)和珠蕨类(crypto-
grammoid ferns)的系统发育关系。李春香和陆树刚
(2006a)利用rbcL基因序列构建了鳞毛蕨科的系统发育
关系, 提出鳞毛蕨科(秦仁昌系统)的概念应有所扩大, 即
认为鳞毛蕨科还应该包括秦仁昌系统的球盖蕨科
(Peranemaceae)和肋毛蕨属(Ctenitis C. Chr.)等类群,
而原鳞毛蕨科成员拟贯众属(Cyclopeltis J. Smith)与鳞
毛蕨科其它类群的关系较远, 系统位置需要重新确定。
Liu 等(2007a)利用rbcL基因并综合形态学和孢粉学特征
对东亚特有的玉龙蕨属(Sorolepidium Christ)进行了系
统发育分析, 不支持玉龙蕨属作为独立的属, 认为其应
该作为世界广布属耳蕨属(Polystichum Roth)的异名处
理。Dubuisson(1997)和Dubuisson等(2003)利用rbcL
基因对瓶蕨属(Trichomanes L.)的范围和属下划分进行
了研究。其它基于 rbcL序列进行的科属研究还有球子
蕨族(Onocleeae)(Gastony and Ungerer, 1997)、
Matoniaceae(Kato and Setoguchi, 1998)、铁角蕨科
(Murakami et al., 1999)、Hymenophyllopsidaceae和
Lophosoriaceae(Wolf et al., 1999)、紫萁科(Yatabe
et al., 1999)、卷柏科(Selaginellaceae)(Korall et al.,
1999)、蹄盖蕨族(Physemat ieae)(Sano et a l. ,
2000)、耳蕨属(Little and Barrington, 2003)、亚洲
耳蕨类(polystichoid ferns)(Lu et al., 2007)和鳞毛蕨科
(Liu et al., 2007b)。
1.1.1.2 atpB基因
atpB基因位于叶绿体基因组的大单拷贝区, 编码ATP合
成酶的b亚基, 两边邻接atpE和rbcL基因, 长约1 497
bp。atpB基因进化速率慢, 序列保守但能提供足够的
潜在系统发育信息等特性使其在较高分类阶元(目、科
和属)的系统学研究中具有一定的价值。Wolf(1997)对
23种蕨类植物进行了atpB基因测序并构建系统发育树,
基于atpB基因的系统树拓扑结构与基于rbcL的研究结
果一致, 且两个基因的联合分析能够提高系统发育的分
辨率。刘红梅等(2007)利用atpB和rbcL两个基因对国
产叉蕨科(Tectariaceae)植物进行了系统发育重建, 来自
atpB和rbcL基因的系统发育树在拓扑结构上高度一致,
145刘红梅等: DNA序列在蕨类分子系统学研究中的应用
且两者的联合分析提高了系统发育关系的分辨率和支持
率。刘红梅等(2007)的研究显示传统的叉蕨科植物是
一个多系类群, 其中的肋毛蕨属、轴鳞蕨属(Dryopsis
Holttum et Edwards)和节毛蕨属(Lastreopsis Ching)应
为鳞毛蕨科成员, 黄腺羽蕨属(Pleocnemia Presl)也被暂
时放入鳞毛蕨科; 其余的 5 个属, 即轴脉蕨属(Ctenit-
opsis Ching)、沙皮蕨属(Hemigramma Christ)、牙
蕨属(Pteridrys C. Chr. et Ching)、地耳蕨属(Quercifilix
Cop.)和叉蕨属(Tectaria Cav.)在系统树上构成一个强支
持的分支, 是一自然的单系类群。而Guillon(2007)在利
用atpB基因构建木贼属(Equisetum L.)的系统发育关系
时发现, atpB基因进化速率慢, 能提供的系统发育信息
有限, 对系统树的分辨率不高, 且发现atpB基因的研究
结果不同于其它 3 个叶绿体基因( rb cL、t rn L -F 和
rps4 )。
1.1.1.3 rps4基因
rps4基因编码叶绿体小亚基蛋白4, 其进化速率较rbcL
快, 在蕨类植物中的长度约为 500 bp。rps4基因一般
与 rbcL、atpB、trnL-F和 rps4-trnS基因或基因间隔
区联合使用进行系统发育分析, 但亦有单独利用rps4基
因进行的系统学研究(例如木贼属)(Guillon, 2004)。
Smith和Cranfill(2002)利用 rps4、trnS和 trnL-F对金
星蕨科进行了系统发育重建, 支持金星蕨科的单系性, 并
将科下分为2个类群: 卵果蕨类群(phegopteroid)和金星
蕨类群(thelypteroid)。Schneider等(2002)根据 rbcL
和rps4基因并综合形态学特征, 认为雨蕨属(Gymnog-
rammitis Griffith)是水龙骨类(polygrammoid ferns)成员,
而不是传统观点认为的骨碎补科成员。李春香和陆树
刚(2005)利用 rbcL、rps4、rps4-trnS和 trnL-F共4个
基因(片段)对龙骨星蕨(Microsorum membranaceum
var. carinatum W. M. Chu & Z. R. He)与其原变种膜叶
星蕨(M. membranaceum var. membranaceum)的关系
进行研究时发现, 两种植物形态上很容易区分, 其4个基
因片段的序列差异均很小, 因此不支持龙骨星蕨变种的
成立。Schneider等(2004c)和Sánchez-Baracaldo
(2004)利用rps4基因并联合其它基因片段分别对水龙骨
类、Jamesonia Hook. & Grev.和Eriosorus Fée进行
了系统发育和生物地理学研究。
1.1.1.4 16S rDNA基因
16S rDNA编码叶绿体基因组核糖体小亚基, 在蕨类植
物中长约1 474 bp, 进化速率较rbcL基因慢, 适用于较
高分类阶元的系统学研究。Manhart(1995)对12种蕨
类、2种苔藓和8种种子植物进行类群取样, 利用16S
rDNA序列构建了系统发育树, 结果显示紫萁属(Osm-
unda L.)是薄囊蕨类的基部类群, 松叶蕨科(Psilotaceae)
和瓶尔小草科(Ophioglossaceae)形成姐妹群关系, 该结
果与基于 rbcL的结果(Manhart, 1994)一致。
1.1.1.5 atpA基因
atpA位于叶绿体基因组的大单拷贝区, 编码ATP合成酶
的a亚基, 在蕨类植物中一般长约1 524 bp。Schuett-
pelz等(2006)对atpA基因在蕨类分子系统学研究中的
可行性进行了探讨, 研究显示, atpA基因较之其它4个
常用基因片段(rbcL、atpB、18S和 rps4)具有更多的
序列变异位点, 系统发育关系的支持率和分辨率强, 且能
够分辨其它4个基因片段所不能解决的系统发育关系。
因此, 作者认为atpA基因对于构建蕨类植物较深节点的
系统发育关系和对蕨类植物进行密集取样构建蕨类植物
大系统均具有很高的应用价值。同时, 作者认为 atpA
基因也可以应用到其它植物类群(如种子植物)的系统发
育研究中。虽然具有较好的应用潜力, 但目前 atpA基
因在蕨类分子系统学研究中的应用还不够广泛。Korall
等(2006)利用 atpA基因和其它 3 个叶绿体基因片段
(rbcL、atpB和rps4)对树蕨类(tree ferns)植物进行了
系统发育重建, 研究显示所有树蕨类植物构成了一个很
好的单系群, 并可以划分出4个单系分支, 但是传统概念
上的蚌壳蕨科(Dicksoniaceae)和桫椤科(Cyatheaceae)
需要重新进行定义, 以确保科的单系性。
1.1.1.6 accD基因
accD基因编码乙酰辅酶 A羧化酶的 b亚基。Ebihara
等(200 4)综合 rbc L、acc D和 rbc L - acc D片段对
146 植物学报 44(2) 2009
Microtrichomanes (Mett. ex Prantl) Copeland进行系
统发育重建, 研究结果表明Microtrichomanes为一多系
类群, 作者根据分子系统学的研究结果并结合形态特征
对Microtrichomanes做了种的归并和处理。
1.1.2 叶绿体基因间隔区
基因间隔区因不参加转录翻译过程, 在功能上的限制较
少, 受到的选择压力也较小, 变异较为自由, 因此比编码
基因能够提供更多的系统发育信息。现介绍3种目前在
蕨类分子系统学研究中应用较多的叶绿体基因间隔区。
1.1.2.1 trnL-F基因间隔区
编码转运RNA(tRNA)的trnL基因位于叶绿体的大单拷
贝区, 中间被一长约390-615 bp的内含子分隔为两部
分(Taberlet et al., 1991)。在结构上, 此区段与trnF基
因相邻, 两者之间有一长160-440 bp的基因间隔区, 该
间隔区( trnL-F)常被用于系统学研究。在蕨类植物中,
trnL-F序列一般用于科内属间或者属下的系统学研究,
且常与其它基因片段(rbcL、rps4和rps4-trnS)联合进
行系统发育分析。王玛丽等(2003)利用 trnL-F序列重
建蹄盖蕨科(Athyriaceae)的系统发育关系, 将其划分为
冷蕨亚科、蹄盖蕨亚科、双盖蕨亚科、轴果蕨亚科和
Deparioideae 5个亚科, 并在属的等级上进行了相应的
处理。Hauk等(2003)利用 rbcL和 trnL-F基因片段对
瓶尔小草科(Ophioglossaceae)进行系统发育分析, 研究
表明该科为一单系类群, 科下分为2个大的分支; rbcL
和trnL-F的联合分析显示, 狭义小阴地蕨属(Botrychium
s.s.)和狭义瓶尔小草属(Ophioglossum s.s.)均为单系类
群, 而假阴地蕨属(Botrypus Michx)是并系(paraphyletic)
类群。Geiger和Ranker(2005)根据 rbcL和 trnL-F对
产自夏威夷岛的鳞毛蕨属(Dryopteris Adanson)进行了
系统发育重建和生物地理学研究, 认为鳞毛蕨属特有分
布在夏威夷地区的物种不是一个自然的单系类群, 它们
各自的近缘类群均来自东南亚, 先后经过5次扩散事件
形成了夏威夷岛鳞毛蕨属植物现在的分布格局; 作者同
时根据DNA序列证据建议把肉刺蕨属(Nothoperanema
Ching)作为鳞毛蕨属的异名处理, 以保证鳞毛蕨属的单
系性。Rouhan等(2004)和Skog等(2004)分别利用
trnL-F和rps4-trnS, trnL-F、rbcL和rps4-trnS序列对
舌蕨属(Elaphoglossum J. Smith)进行了分子系统发育
重建。此外, Li 等(2004)根据trnL-F序列对国产凤尾蕨
属(Pteris L.)进行了系统发育重建。李春香等(2004a)
运用trnL-F序列确定了滇南桫椤(Alsophila austroyu-
nnanensis S. G. Lu)的系统位置。王艇等(2003)和Su
等(2005a)利用trnL-F序列对中国桫椤科(Cyatheaceae)
植物进行了系统学和居群遗传学研究。van den Heede
等(2003)和Lu等(2005)分别联合ITS和rbcL序列对铁
角蕨属(Asplenium L.)和贯众属(Cyrtomium C. Presl)进
行了系统发育分析。
1.1.2.2 rps4-trnS基因间隔区
该基因间隔区位于rps4基因和trnS基因之间, 序列长度
变异较大, 甚至同一个属的不同物种在序列长度、插入
和缺失的程度上也存在较大变异(Hennequin et a l.,
2003)。因此它多用于较低分类阶元的系统学研究, 且
常与其它基因片段(rbcL、trnL-F和 rps4)结合使用。
Hennequin等(2003)综合3条基因序列(rbcL、rps4和
rps4-trnS)对广义膜蕨属(Hymenophyllum s.l.)进行了系
统发育分析, 认为应该把Cardiomanes C. Presl、
Serpyl lops is van den Bosch和 Rosenstockia
Copeland归并入膜蕨属(Hymenophyllum J. E. Sm.)。
Kreier和Schneider(2006)利用 rbcL、trnL-F、rps4
和rps4-trnS序列对鹿角蕨属(Platycerium Desv.)进行系
统学和谱系地理学分析, 认为鹿角蕨属可以分为两支, 一
支由分布在非洲、马达加斯加和南美洲的类群组成, 另
一支则由澳大利亚的类群组成, 这两支又分别划分为不
同的亚支。Schneider等(2004a)利用 4 个基因片段
(rbcL、trnL-F、rps4和 rps4-trnS)对 Thylacopteris
Kunze ex J. Smith进行了系统发育重建。多基因联合
分析显示, Thylaco-pteris与Goniophlebium (Bl.) C.
Pres l具有较近的亲缘关系, 并且 Goniophleb ium、
Lecanopteris Reinwardt、瓦韦属(Lepisorus Ching)和
星蕨属(Microsorum Link)均起源于马来西亚, 然后分别
扩散到亚洲、澳大利亚、非洲和太平洋地区。
147刘红梅等: DNA序列在蕨类分子系统学研究中的应用
1.1.2.3 atpB-rbcL基因间隔区
该基因间隔区在被子植物中长约900 bp, 多用于科间、
族间和属间的研究(田欣和李德铢, 2002)。atpB-rbcL
基因间隔区在蕨类植物中长约650 bp, 目前该基因间隔
区在蕨类植物中的应用还不广泛。Su等(2004, 2005b)
利用atpB-rbcL序列分别对分布于中国海南、广东和广
西的桫椤(Alsophila spinulosa Wall. ex Hook. Tryon)
和黑桫椤(A. podophylla Hook.)居群进行了遗传结构和
系统地理学分析。Wang等(2004)对桫椤进行了atpB-
rbcL序列测定和居群遗传学分析。
1.2 核基因组
核基因组(nuclear DNA, nDNA)DNA为双亲遗传, 因此
可以更客观真实地反映物种本来的亲缘关系, 有利于解
决网状进化的问题。但由于核基因组结构复杂, 且大部
分核基因存在直系同源(orthologous)和旁系同源(paralo-
gous)基因的问题, 因此使核基因的应用复杂化。目前
核基因组序列在植物系统学中的应用主要集中在编码核
糖体RNA的重复区(田欣和李德铢, 2002), 且一般是应
用于较高分类阶元的系统发育或者揭示早期陆地植物演
化事件等方面的研究。
1.2.1 核核糖体DNA(nrDNA)
核糖体广泛存在于植物的叶绿体、线粒体和细胞质中,
分为大小两个亚基, 每个亚基又由核糖体RNA(rRNA)及
其相关蛋白组成, 其中编码核糖体小亚基 r RNA的
18S、5.8S和 26S基因共同构成一个转录单位, 串联
排列在核染色体上(田欣和李德铢, 2002)。在高等植物
中, nrDNA的编码区序列高度保守, 序列差异主要表现
在非编码区, 因此编码区序列(18S和26S rDNA)一般用
于较高分类阶元的系统发育重建和陆地植物早期演化事
件的研究, 而非编码区(ITS, IGS)序列则用于较低分类阶
元的系统学和生物地理学研究。
1.2.1.1 18S rDNA基因
在植物核基因组中, 18S基因编码核糖体小亚基的18S
rRNA, 在蕨类植物中长约1 800 bp(Wolf, 1995)。Wolf
(1995)通过对碗蕨科18S rDNA与rbcL基因的比较研究
发现, 18S rDNA的变异速率较 rbcL慢, 约是后者演化
速率的1/9。因此18S rDNA基因适用于解决蕨类植物
高级分类阶元(科或者科以上)的系统关系和对蕨类植物
早期演化事件的研究。Kranz和Huss(1996)利用18S
rRNA基因序列探讨了蕨类植物的分子进化问题及蕨类
植物与种子植物的关系, 材料涉及蕨类植物的所有现存
谱系及所有现存陆生植物中大的谱系。结果显示, 石松
类(lycophytes)植物为一单系类群, 是现存维管植物的最
早分支; 较之其它蕨类植物, 松叶蕨类(psilophytes)与种
子植物具有更近的亲缘关系。
1.2.1.2 26S rDNA基因
编码核糖体大亚基的26S rRNA, 在蕨类植物中的变异
速率介于18S rDNA和rbcL基因之间。Wolf(1996)通
过对几种蕨类植物26S rDNA扩增和系统学分析认为,
26S rDNA在解决蕨类植物较深节点上的关系时能够提
供系统学信息, 但是序列难以扩增且序列中较多不确定
位点限制了其在系统学研究中的应用。Korall和Kenr-
ick (2004)利用26S rDNA对卷柏科进行了系统学分析,
26S rDNA的结果与rbcL结果一致, 并且发现卷柏科植
物在3个基因组中均存在基因变异速率较其它蕨类类群
快的特点。
1.2.2 核糖体基因间隔区
1.2.2.1 内转录间隔区
内转录间隔区(internal transcribed spacer, ITS)位于
18S和26S rRNA基因之间, 被5.8S rRNA基因分为两
段, 即ITS-1和ITS-2。Wolf(1996)认为ITS-1区段可以
用于研究蕨类植物属内种间或者种下关系, 而对分析属
间关系没有分辨率。van den Heede等(2003)利用
rbcL、trnL-F和 nrITS序列, 并综合细胞学和形态学
性状对铁角蕨属药蕨亚属(subgenus Ceterach (Wil-
ld.) Bir)进行了系统发育分析, 研究结果显示药蕨亚属
为一多系类群, 可以分为两个进化支, 作者同时依据
DNA序列及细胞学证据对该亚属的形态学性状进行了
重新定义。
148 植物学报 44(2) 2009
1.2.2.2 外转录间隔区
nrDNA重复单位中的外转录间隔区(external transcribed
spacer, ETS)位于18S基因的上游, 其长度在不同类群
间的变异较大, 因此在近缘类群的系统发育重建、杂交
及物种谱系地理学研究方面具有潜力。S ánc h e z-
Baracaldo(2004)利用18S-26S nrDNA的ETS序列结
合rps4、rps4-trnS基因片段对Jamesonia和Eriosorus
进行了系统发育重建和谱系地理学研究, 结果显示,
Jamesonia和Eriosorus两属均不是单系, 分别为多系
和并系, 而且Jamesonia在演化上经历了一次快速的辐
射分化事件。
1.3 线粒体基因组
植物线粒体基因组(mitochondria DNA, mtDNA)的进化
速率较叶绿体基因组更慢, 因此能够提供的系统发育信
息有限, 而且线粒体基因组在大小和结构上十分不稳定
(高频率重排、重复或缺失以及外源 DNA的转入等)
(Duff and Nickrent, 1999; 郭亚龙和葛颂, 2004)。Duff
和Nickrent(1999)利用线粒体小亚基序列(19S rDNA)对
陆地植物各个主要谱系进行的系统分析显示, 石松类植
物形成一个单系群, 是整个维管植物的基部类群; 厚囊蕨
类(eusporangiate ferns)和薄囊蕨类共同构成一个单系
类群, 木贼类是薄囊蕨类的姐妹群。目前线粒体基因在
蕨类分子系统学研究中的应用还不广泛, 所用的线粒体
基因片段主要有: atp1、na d2、na d5、co x I II和
mtI TS。
1.4 蕨类分子系统学研究的多性状和多基因联
合分析
不同的DNA序列在分类群间的进化速率存在差异, 因此
适用于不同分类阶元的系统学研究。但是单一基因片
段所能提供的系统学信息仍然十分有限, 因此愈来愈多
的研究者开始注重将多个不同来源或者功能的适用DNA
序列相互结合, 或与传统的形态学(广义)性状结合起来共
同分析, 以期获得更多的系统发育信息, 进而得到更接近
真实系统发育关系的研究结果。目前蕨类分子系统学
研究基于这种多性状和多基因联合分析(multiple gene
analyses)已经取得了一系列的重要进展。
1.4.1 分子数据与形态性状(广义)的联合分析
Pryer等(1995)利用77个形态和解剖学性状并结合rbcL
基因对蕨类现存各个主要谱系的50个分类群构建了系
统发育树, 来自形态学的研究结果与 rbcL结果基本一
致, 两者均支持薄囊蕨类为一单系类群, 紫萁属是薄囊蕨
类的基部类群, 而且形态数据(广义)与rbcL基因的联合
分析提高了系统发育树的分辨率和支持率。Pryer等
(2001)综合形态学和来自叶绿体基因组(rbcL、atpB和
rps4)和核基因组(18S rDNA)的4个基因片段对现存维管
植物的主要谱系进行系统发育重建。研究结果显示, 现
存维管植物分为3个单系类群: (1)石松类; (2)种子植物;
(3)松叶蕨类、木贼类和其它所有蕨类植物。其中, 石
松类是其它现存维管植物的姐妹群, 木贼和真蕨类
(ferns)是种子植物现存的最近姐妹群。Pryer等(2001)
的研究表明蕨类植物为一并系类群, 因此对传统认为蕨
类植物是一个单系类群的观点提出了挑战和异议。
1.4.2 多基因联合分析
Wolf(1995)利用叶绿体rbcL和核18S rRNA基因探讨广
义碗蕨科(Dennstaedtiaceae s.l.)的科下关系, 两个基因
的分析显示广义碗蕨科和碗蕨属(Dennstaedtia Bernh)
均不是单系类群, 稀子蕨属(Monachosorum Kunze)应作
为碗蕨科成员。Lu等(2005)利用rbcL和 trnL-F序列对
贯众属的系统发育重建表明, 传统的贯众属不是单系类
群, 贯众属羽裂亚系(Cyrtomium subseries Balansana
Ching et Shing)与柳叶蕨属(Cyrtogonellum Ching)、 鞭
叶蕨属(Cyrtomidictyum Ching)和多羽耳蕨(Polysti-
chum subacutidens Ching ex L. L. Xiang)构成一个单
系类群, 而贯众属羽裂亚系之外的其它类群构成一个单
系群。Korall等(2006)综合rbcL、rps4、atpA和atpB
共4个基因对树蕨类进行的系统发育研究显示, 所有的
树蕨类植物组成一个单系群, 其中瘤足蕨科(Plagiog-
yriaceae)、Loxomataceae和Metaxyaceae为单系类
群, 而桫椤科和蚌壳蕨科的单系性没有得到分辨和支持,
因此需要进一步的研究和范围界定。Schneider等
149刘红梅等: DNA序列在蕨类分子系统学研究中的应用
(2004b)根据rbcL和rps4基因推断蕨类植物和其它维管
植物的起源和分化时间, 认为现存蕨类植物起源于一次
近期的分化事件, 现存水龙骨类(物种数占现存蕨类总数
的80%以上)的分化时间约在白垩纪, 晚于种子植物的起
源时间。
2 DNA序列为蕨类系统学研究引入新的
观点和证据
蕨类植物是一群非常古老的植物, 在其漫长的演化过程
中丢失了大量的系统发育信息, 同时蕨类植物可用的形
态学性状较少(相比种子植物大量可用的繁殖性状而言),
且存在同源性状不易判定等因素, 因此仅利用形态学性
状对蕨类植物进行系统发育重建面临着很多困难。与
形态学性状相比, DNA序列记录了进化过程中发生的每
一事件, 含有极丰富的进化信息, 可以为系统发育研究提
供更为直接和可靠的证据(顾红雅, 1999), 且DNA序列
不易受到环境和生物体自身特点的影响, 因此系统发育
重建中分子性状的引入为蕨类系统学研究增加了新的证
据和手段, 使系统发育分析数据剧增, 在一定程度上弥补
了形态学研究的局限性和不足, 并为我们对这一类群的
研究和理解带来了新的观点和认识。
Hymenophyllopsidaceae为一单型科, 仅分布在
Roraima、Guyana和巴西最北部地区。不同分类学
家关于Hymenophyllopsidaceae在薄囊蕨类中的系统
位置存在较大争议。Lellinger(Wolf et al., 1999)根据
孢子囊群边生及孢子的特征认为Hymenophyllopsid-
aceae与碗蕨科近缘。Tryon和Lugardon(1990)通过
孢子扫描电镜观察, 发现Hymenophyllopsidaceae和桫
椤科植物均具有深疣状的孢子纹饰, 因此认为两者的关
系更近。Mickel(1973)依据羽片狭缩和羽片无气孔的特
点, 认为Hymenophyllopsidaceae与膜蕨科(Hymenop-
hyllaceae)近缘。W olf等(1999)利用 rbcL 基因对
Hyme nophy llops idac eae 进行系统学研究, 发现
Hymenophyllopsidaceae在系统树上与树蕨类形成一
支, 尤其是与Cyathea J.E. Smith形成姐妹群关系。
Schneider等(2002)通过对rbcL和rps4基因的联
合分析, 确定了雨蕨属属于水龙骨类成员, 改变了原来基
于形态学证据(主要是羽片的分裂式样)一直把雨蕨属置
于骨碎补科的观点。同时, 通过对一些形态性状的重新
研究分析, 作者发现雨蕨属亦有很好的形态学性状(如无
囊群盖且染色体基数为36等)支持其与水龙骨类成员的
近缘关系。Schneider等(2002)的研究对以后在其它类
群进行系统学研究给出了启示, 即利用单一的形态学性
状对分类群进行处理往往是不可靠的, 分子证据的引入
为我们重新审视形态学性状以及这些性状在类群中的演
化提供了新的思路和手段。
长期以来, 蕨类植物各个主要谱系之间的系统关系
以及蕨类植物在整个陆地植物中的地位一直是蕨类系统
学家力图澄清的问题。比较形态学研究认为松叶蕨类
是现存蕨类植物的最基部类群, 也是整个维管植物的基
部类群(Pichi Sermolli, 1959; Parenti, 1980; Bremer,
1985; Bremer et al., 1987), 但是近年来的分子证据支
持石松类是其它现存维管植物的姐妹群(Kenrick and
Crane, 1991, 1997; Raubeson and Jansen, 1992;
Kranz and Huss, 1996; Pryer et al., 2001, 2004), 而
松叶蕨类位于monilophytes内部, 与瓶尔小草科构成姐
妹群关系(Hasebe et al., 1995; Manhart, 1995; Wolf,
1997; Qiu et al., 1998; Pryer et al., 2001, 2004)。
蕨类植物有真正的根、茎和叶的分化, 具有维管系
统, 在生活史中具有两个彼此独立生活的世代交替, 且仍
以孢子繁殖, 因此传统观点认为蕨类植物是一个单系类
群, 并通俗地划分为真蕨类和拟蕨类(fern allies)。随着
分子生物学手段在蕨类系统学中的引入和应用, 这些观
点均受到了分子证据的挑战和质疑(Pryer et al., 2004)。
Smith等(2006)综合目前蕨类分子系统学的研究结果,
提出了一个基于形态和分子证据(多基因联合分析)的全
新蕨类植物系统(科级水平)(图1)。在这个分类系统中,
现存蕨类植物被分为两大支, 一支由石松类组成, 包括石
松目(Lycopodiales, clubmosses)、水韭目(Isoétales,
quillworts)和卷柏目(Selaginellales, spikemosses), 占
现存维管植物总数不到1%; 另一支由monilophytes组
成, 包括 5 个大的谱系: 松叶蕨目( whi s k f er ns ,
Ps i lo t a les)、瓶尔小草目(ophio glossoid f erns ,
150 植物学报 44(2) 2009
Ophioglossales)、木贼目(horsetails, Equisetales)、
合囊蕨目(marattioid ferns, Marattiales)和薄囊蕨类, 被
划分为4纲11目共37个科(其中32个科为单系类群)。
在这个新的分类系统中, 传统上基于形态学证据定义的
一些目和科被拆分、归并和重新组合, 如鳞毛蕨科
(Kramer et al., 1990)的成员被分别放置在5个独立的
科: 岩蕨科(W oods iaceae)、球子蕨科(Onoc leac-
eae)、鳞毛蕨科、叉蕨科和藤蕨科。Smith等(2006)
的分类系统综合了形态学和分子系统学研究的结果, 反
映了最新的蕨类植物的内部关系以及蕨类植物与其它维
管植物之间的关系。但是该分类系统主要是在目和科
的水平, 一些在目前研究中仍不是单系的科(如鳞毛蕨
科、岩蕨科和水龙骨科)以及大部分的科下属间及属下
分类问题还需要大量的形态和分子方面的研究。
3 蕨类分子系统学研究中的常见问题及
解决策略
3.1 内类群和外类群的选择策略
在进行系统学研究时, 内类群和外类群的选择非常重
要。在进行一个类群的系统学研究时, 所要研究类群
(即内类群)的选择范围及取样密度对研究结果有很大的
影响, 包括在分析中的类群越多, 越能降低甚至避免分
析中的误差和错误。因此, 最理想的做法应是对尽可能
多的分类单元进行取样, 这样才能使所选类群有充分的
代表性。但是尽可能多的类群取样在实际操作中受到
很多因素的制约, 比如实验材料的来源(对于拥有较多灭
绝谱系的类群, 类群取样是一个制约因素), 而且对于庞
大的数据矩阵, 进行数据分析也会受到计算机和分析软
件的限制。因此, 一般情况下, 内类群的选择既要能够
代表所研究类群在分类学上的多样性, 也要能够代表形
态性状或者地理分布上的多样性。在进行大尺度的系
统发育重建时, 是选择尽可能多的内类群还是选择尽可
能多的性状(如包括在分析中的基因片段的数量)往往存
在不同的观点。Qiu等(2007)的研究认为, 在进行大尺
度的系统发育研究时, 可以采取折中的方法, 即选择适当
数量的内类群, 同时选择适当数量的性状。
合适的外类群对于理解类群间的系统关系、性状
的演化和演化极性起着决定性的作用。在选择外类群
时, 外类群必须与内类群关系很近, 同时外类群与内类群
之间的序列差异也必须较内类群之间的差异更显著。
由于较远的外类群与内类群序列间存在较多的随机特性,
因此选择亲缘关系太远的类群作为外类群将会导致出现
长枝吸引效应(long branch attraction, LBA)和对系统树
的错误预测(Mount, 2003)。最适宜的外类群应该为内
类群最近的姐妹群。
3.2 基因或者基因片段的选择策略
针对特定的系统学问题选择合适的基因片段是分子系统
学研究中最基础也是最关键的一步。如果所选的基因
片段在进化上过于保守, 就不能提供足够的系统学信息,
使得对于所研究类群间的系统关系几乎没有分辨; 反之,
如果所选片段在研究类群间的变异太大, 就会给序列排
序带来很大困难并且容易造成排序的不确定性, 同样不
利于解决系统学问题。一般来说, 编码基因或者较为保
守的基因片段可以用于解决较高分类阶元(如科间, 甚至
目间)的系统学问题, 而变异较快的基因或者基因片段,
如内含子或者基因间隔区, 可以用来解决较低分类阶元
(如属间或者种间)的系统学问题(田欣和李德铢, 2002)。
但近年来的一些系统学研究显示, 进化速率快的基因在
分析一些较高分类阶元的系统关系以及较保守的基因在
推断早期分化事件上能够提供更多的系统发育信息, 因
此可以提高系统发育关系的分辨率和支持率(Borsch et
al., 2003; Hilu et al., 2003; Müller et al., 2006)。在
进行系统学研究时, 保守的基因和变异较快的基因或者
基因片段结合使用, 不仅可以解决较高阶元上的系统关
系, 而且较深节点上的系统关系也可以得到分辨。目前
蕨类分子系统学研究中常用的基因序列及其适用的分类
阶元见表 1。
3.3 多种分析方法结合使用
用以进行分子序列数据分析和系统发育重建的方法有很
多种, 一般可归纳为3类: 距离法(distance matrix)、简
约法(parsimony)和似然法(likelihood)。最大似然法
151刘红梅等: DNA序列在蕨类分子系统学研究中的应用
图 1 一个新的真蕨类分类系统(重绘自Smith et al., 2006)
Figure 1 Consensus phylogeny of fern relationships based upon the new fern classification (redrawn from Smith et al., 2006)
152 植物学报 44(2) 2009
(maximum likelihood, ML)具有很多有利于进行系统学
分析的特性, 比如在运算时基于某种分子进化模型, 能够
在一定程度上避免因为序列本身的进化特点对系统发育
关系产生影响, 另外ML方法可以有效地避免长枝吸引
效应(详见下文), 因此能够相对准确地反映类群之间真实
的系统关系。但是ML作为寻找最适系统树的选择方法
则受限于它所能包容在一个分析中的分类群的数量。
简约法和距离法较之ML能处理更多的分类单元, 并且
简约性分析已成为大多数植物系统发育研究所选用的方
法, 而且简约法还允许进行性状(如密码子位置)加权和性
状状态转换; 距离法能比简约法在短时内处理更大的数
据矩阵, 因此便于对大的数据矩阵进行分析和处理(陈之
旻端和冯 , 1998)。
由于简约法容易受到类群取样密度和长枝吸引等因
素的影响, 完全的ML方法又受限于所能分析的分类群
的数量。近年来新的研究和分析方法不断被提出并且
在实际应用中得到检验和优化, 如贝叶斯推论(Bayesian
inference, BI)(Ronquist and Huelsenbeck, 2003)和一
种快速简化的最大似然分析——PHYML (Guindon and
Gascuel, 2003)。目前的系统学分析一般不单独采用某
一种分析方法(比如NJ、MP、ML或者Bayesian法),
而是几种分析方法结合使用。
在进行系统发育分析, 尤其是进行简约性分析时经
常遇到的一个问题是长枝吸引现象。长枝吸引效应是
指在系统分析中, 系统树的误差或者错误是由长枝造成
的, 即在系统树上具长枝的类群被错误地聚在一起, 但是
它们本身并不是近缘类群。LBA在系统树上一般表现
为以下3种情况: (1)在有根树上(rooted tree), 所有具长
枝的类群都以梳子状聚在外类群的附近; (2)聚在一起的
两个分类群, 共有枝(common branch)很短, 而各自的
末端分枝(terminal branch)很长; (3)当用MP分析时, 出
现了异常的系统关系或者拓扑结构, 而在ML等分析方
法中这种关系或者拓扑结构并不存在。长枝吸引现象
反映出类群取样不足、所用基因序列的进化速率异质
或者存在homoplasy等问题。避免出现长枝吸引的方
法一般有以下 3 种。(1)增加类群取样。对于由类群代
表性不够造成的长枝吸引, 一般可以通过增加类群取样
避免出现这种情况。(2)选取来自不同基因组的基因或者
序列片段进行联合分析。对于由进化速率异质引起的
长枝吸引, 可以采取不同基因组多个基因片段联合分析
来避免。(3)多种分析方法结合。目前常用的系统学分
析方法中, MP法较易出现长枝吸引, 而ML和Bayesian
方法在构建系统树时由于基于一定的序列进化模型, 故
在一定程度上可以有效地避免长枝吸引现象。因此, 在
进行系统发育重建时, 可以多种分析方法结合使用, 而且
在进行分析之前应该结合所用的基因序列选择合适的进
化模型(Siddall and Whiting, 1998; Anderson and
Swofford, 2004)。
4 国内蕨类分子系统学研究现状和展望
我国蕨类植物资源丰富, 是世界蕨类植物多样性中心之
一, 约有2 100种, 并且特有属种众多(Zhang, 2003), 便
于开展蕨类植物的各项研究工作。我国的蕨类植物学
研究自20世纪20年代至今, 已取得了很大的进展。世
界著名的蕨类植物学家秦仁昌先生先后在 1940年和
1978年发表的《水龙骨科的自然分类》 (Ching, 1940)
和《中国蕨类植物科属的系统排列和历史来源》(秦仁
表 1 蕨类分子系统学研究中常用的DNA片段及适用范围(+表示对可信程度的估计)
Table 1 Summary of estimated utility of different genomic regions for phylogenetic studies in pteridophytes (Number of ticks
proportional to estimated level of utility)
分类阶元 r bc L atpB rps4 16S trnL-F rps4-trnS 18S 26S nrITS
种内居群间 ++ ++ +++ +++
属内种间 ++ + +++ +++ +++ ++
科内属间 +++ +++ +++ +++ ++ +
近缘科间 +++ +++ + + +
亲缘较远的科间 ++ ++ ++ + ++
部分内容引自Wolf (1996)。Some data are from Wolf (1996).
153刘红梅等: DNA序列在蕨类分子系统学研究中的应用
昌, 1978)享誉海内外, 使我国的蕨类植物学研究在世界
蕨类学界占有了一席之地。近年来,《中国植物志》蕨
类部分共6卷10册已全部出版, 地方性的植物志也陆续
编写完成并相继出版。
相对于经典分类学研究来说, 国内的蕨类分子系统
学研究才刚刚起步, 目前已经完成或者正在进行的分子
系统学工作主要有:周铜水(1999)j在槲蕨科(Drynari-
aceae)中进行的分子系统学研究; 王玛丽等(2003)利用
trnL-F序列在蹄盖蕨科、王艇等(2003)利用 trnL内含
子和 t rn L -F 间隔区序列对中国桫椤科植物、S u 等
(2004)和Wang等(2004)利用atpB-rbcL片段对桫椤进
行的居群遗传学和谱系地理学研究; Su等(2005a)利用
trnL-F序列对桫椤以及Su等(2005b)利用atpB-rbcL片
段对黑桫椤进行的居群遗传学研究; Lu等(2005)利用
rbcL和trnL-F在贯众属, 卢金梅和李德铢(2006)在拟贯
众属、Lu等(2007)在亚洲耳蕨类植物、Zhang等(2005,
2007)利用 rbcL基因在碎米蕨类、Li等(2004)在凤尾
蕨属、Li和Lu(2006)在国产鳞毛蕨属、李春香和陆树
刚(2005, 2006a, 2006b)分别在星蕨属、鳞毛蕨科和国
产观音座莲植物、李春香等(2004a, 2004b)分别在滇南
桫椤(Alsophila austroyunnanensis)和耳蕨属、陆树刚
和李春香(2006)在篦齿蕨属(Metapolypodium Ching)、
刘红梅等在玉龙蕨属(Liu et al., 2007a)、鳞毛蕨科(Liu
et al., 2007b)、拟贯众属(未发表)、柳叶蕨属和鞭叶
蕨属(Cyrtogonellum and Cyrtomidictyum, 未发表)、刘
红梅等(2007)在叉蕨科开展的分子系统学研究工作, 利
用的DNA序列涉及 rbcL、atpB、trnL-F、rps4和rps4-
trnS等基因或基因片段。
中国是世界蕨类植物区系的一个重要组成部分, 是
东亚蕨类植物区系的主体部分, 现代蕨类植物十分丰富,
从原始到进化的类群, 全世界绝大多数的科在我国均有
分布, 拥有大量亚洲分布和集中分布在中国及邻居地区
的属, 以及东亚和中国特有的属种, 为我们进行各项研究
提供了大量素材。传统分类学研究已经取得了很大进
展, 不仅体现在有一个为世界分类学界所熟知的分类系
统(秦仁昌系统), 《中国植物志》蕨类部分全部6卷共
10册已全部出版, 地方性的植物志也陆续编写完成和出
版。近年来, 国际上已经开展了蕨类植物的分子系统学
研究, 对各个分类阶元的分子系统发育重建和谱系地理
学研究正如火如荼地进行, 并且取得了一系列重要研究
成果, 使我们对于蕨类这个古老类群有了新的了解和认
识。随着研究的不断深入, 国际上对现代蕨类植物系统
发育关系的认识逐渐趋向一致, 一个全新的基于多学科
多手段的国际性的蕨类分类框架已基本形成(Smith et
al., 2006)。较之国内已经开展的经典分类学研究和国
外目前的分子系统学研究水平, 国内的分子系统学研究
还十分欠缺和薄弱, 处于刚刚起步的阶段。但是已有一
系列的研究成果相继发表在国际重要的学术刊物上, 如
Li等(2004)对中国凤尾蕨属的研究; Li和Lu (2006b)在
国产鳞毛蕨属、Su等(2004, 2005a, 2005b)在桫椤和
黑桫椤中开展的居群遗传学研究; Lu等(2007)对耳蕨类
植物的研究; Zhang等(2005, 2007)在碎米蕨类和Liu等
(2007a, 2007b)对鳞毛蕨科和一些特有属的研究。虽然
国内的分子系统学研究工作已经开展, 且呈现良好的发
展趋势, 但是国内整体的研究队伍和研究力量还很薄弱,
目前开展的研究工作还不能很好地同国际接轨。因此,
紧跟国外研究的动态, 积极开展国内蕨类分子系统学研
究, 尤其是对一些以东亚和中国为起源和分布中心的类
群的研究, 不仅有助于了解这些类群的起源和演化历史,
而且对理解整个东亚蕨类植物的起源和演化以及阐明东
亚植物区系在整个世界植物区系中的地位和作用都有十
分重要的意义。同时, 对蕨类植物各大谱系以及蕨类植
物与其它陆地植物之间系统关系的深入研究和正确认
识, 不仅对探讨维管植物的系统发育和演化, 也为理解
整个陆地植物的起源和演化有着非常重要的意义。
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Application of DNA Sequences in Pteridophyte Phylogenetic Study
Hongmei Liu1, 2, Xianchun Zhang3, Hui Zeng1, 2*
1 The Key Laboratory for Environmental and Urban Sciences, Shenzhen Graduate School, Peking University, Shenzhen 518055, China;
2 Department of Urban and Environmental Sciences, Peking University, Bei j ing 100871, China; 3State Key Laboratory of
Systematic and Evolutionary Botany, Insti tute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Bei j ing 100093, China
Abstract DNA sequences, because of their disparity in rate of evolution, are suitable for phylogenetic study at different
taxonomic levels. Therefore, selecting the most appropriate DNA sequence to address a certain phylogenetic issue is important.
This paper summarizes the appropriate range of some DNA sequences that are commonly used in current pteridophyte molecular
phylogenetics, which comprises sequences from three plant genomes (chloroplast, nucleotide, and mitochondria), especially
focuses on the usage of chloroplast DNA regions. Problems in reconstructing the fern phylogeny and strategies to overcome these
problems (including ingroup and outgroup selection, and the choice of the appropriate DNA region) are briefly discussed. This paper
represents recent progress in molecular phylogenetics and points out the status of and prospects for pteridological research in
China.
Key words DNA sequences, molecular phylogeny, pteridophyte
Liu HM, Zhang XC, Zeng H (2009). Application of DNA sequences in pteridophyte phylogenetic study. Chin Bull Bot 44, 143-158.
* Author for correspondence. E-mail: zengh@szpku.edu.cn
(责任编辑: 孙冬花)