全 文 ：华重楼内生菌 SS02的分离与抗菌活性的初步研究*
杨正强　张耀兮　陈小静　赵　明　王一丁**
(四川师范大学生命科学学院　成都　610068)
　　*四川师范大学校级科研基金资助项目
**通讯作者　Tel:028-84766411, E-mai l:wwwyid ing@vip. tom. com
收稿日期:2005-06-13, 修回日期:2005-09-14
摘要:从华重楼 (Paris polyphy lla va r. Ch inensisF ranch) 的地下块茎中分离到一株内生细菌
(SS02), 试验表明其发酵液对 13种作物致病菌的生长有抑制作用。形态和生理生化特征
表明 SS02属于芽孢杆菌属 (Bacillus sp.) 细菌。扩增 、 测序得到 SS02的部分 16S rDNA序
列 , GenBank接收号 AY842144。用 B lastn调出与菌株 16S rDNA同源的序列 , 用 C lusta lw进
行多重序列对比 , 用 Phy lip按 N eighbo r-Joining法构建 16S rDNA系统发育树。菌株 SS02与
Paenibacillus daejeonensis处于同一分支 , 相似性为 97. 7%, 将其鉴定为 Paenibacillus dae-
jeonensis SS02。
关键词:华重楼 , 内生菌 , 抗菌谱 , 16S rDNA序列分析
中图分类号:Q93-3　　文献标识码:A　　文章编号:0253-2654 (2006) 02-0054-05
S tud ies on the Isolation and An tib ioticA ctivities of Endophytes in
Paris polyphylla var. Ch inensis franch*
YANG Zheng-Qiang　ZHANG Yao-Xi　CHEN Xiao-Jing　ZHAO M ing　WANG Yi-Ding**
(College of Life Sciences, S ichuan Norma lUn iversity, Chengdu 610068)
Ab stract:One endophyt ic stain SS02was isolated from the underground stem s ofParispolyphylla var. Chinensis
franch. The ferm en ts of SS02 showed ant ib iosis act ivities agains t13 kinds of the crop causes germ s. The charac-
teristics ofm orphology, physiological and b iochem ical showed that SS02 belonged to Bacillu s sp. The 16S rDNA
of SS02wasPCR and sequenced. The accession ofGenBank isAY842144. The one 16S rDNA phylogenetic tree
was constructed by comparing w ith the pub lished 16S rDNA sequences of the relative bacteria species. In the
phylogenetic tree SS02 and Paen ibacil lus daejeonensis was the closest relative w ith 97.7% sequence sim ilarity.
A ccord ing to the phy logenetic ana lysis itw as iden tified asPaenibacillu sdaejeonensis SS02.
K eywords:Paris po lyphy lla var. ChinensisF ranch, Endophyte, Antib iotic tab le, 16S rDNA sequence analysis
真菌病害是作物损失的主要原因之一 , 80%作物病害是由病原真菌所引起 。对作
物真菌病菌害的防治主要依赖化学药剂 , 虽然它们对作物增产起了重要作用 , 但同时
也造成了严重的环境污染。目前倾向于采用生物农药防治真菌病害 , 因而寻找抗菌谱
广 、对人畜无毒 、对环境无危害的农用抗生素已成为防治作物真菌病害之一。近年来 ,
植物内生菌作为一种新的微生物资源引起了广泛的关注 , 从内生菌中发现新的活性化
合物是植物内生菌研究的一个热点。大量研究表明植物内生菌产生的次生代谢物能够
抑制多种微生物 , 不仅在抗植物病害方面有重要的意义 , 而且可能成为医用抗生素的
新资源 , 在医药行业同样具有重要的研究价值和应用前景。本文从华重楼中分离得到 1
株可抑制多种植物致病真菌生长的细菌 , 并通过形态 、 生理生化特征和 16S rDNA序列
分析对菌株进行了鉴定。
54 微 生 物 学 通 报　　　　　　　　　　　　2006年 33 (2)DOI牶牨牥牣牨牫牫牬牬牤j牣microbiol牣china牣牪牥牥牰牣牥牪牣牥牨牫
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　供试材料:新鲜野生华重楼由四川光大制药公司提供。供试菌株:绿色木霉
(Trichoderma viride)、 芦笋茎枯病菌 (Phoma asparag i Sacc)、 番茄灰霉病菌 (Botrytis
cinerea)、 苹果轮纹病菌 (Physalospora piricala)、 棉花枯萎病菌 (Fusarium oxysponum
f. sp. vasinfectum)、 杨树溃疡病菌 (Doth iorella gregaria)、 小麦全蚀病菌 (G.gram inis
var. tritici)、 油菜菌核病菌 (S.sclerotiorum )、 小麦叶锈病菌 (P.recondita var. tritici
E rikss etHenn)、冬瓜枯萎病菌 (Fusarium oxy spo rum Sch l.emend.Snyde r＆Hansen)、 稻
瘟病菌 (Magnaporthe grissea)、 小麦根腐病菌 (B ipolaris sorok inia)和黄瓜碳疽病菌
(Colletorichuum lagnarinm), 以上菌株由中国农业科学院作物科学研究所重大工程开放
实验室保存 。
1.1.2　试剂:细菌基因组 DNA提取试剂盒 、 胶回收试剂盒购于上海华舜生物工程公
司;EX Taq酶和 PCR相关试剂购于大连 TaK aRa公司;其余试剂为国产分析纯。
1.1.3　培养基:分离培养基为固体马铃薯培养基 , 其配方:马铃薯 (去皮 ):20%,
蔗糖:2%, 琼脂:1.8%, pH自然 。发酵培养基为液体马铃薯培养基 , 按文献 [ 1]
配制。
1.2　方法
1.2.1　内生菌的分离:将鲜重楼块茎 , 洗净泥土 , 无菌水冲洗 2次 , 无菌滤纸吸干水
分 。常规无菌操作下 , 75%乙醇浸泡 1m in, 水冲洗 3次 , 滤纸吸干水分;0.2%的氯化
汞浸泡 5m in, 水冲洗 10次 , 滤纸吸干水分。用无菌解剖刀将已表面消毒的重楼块茎削
去表皮 , 切成 3cm大小的正方体 , 置于分离培养基平板内 , 28℃培养 4 ～ 8d。待平板有
菌长出后 , 平板划线纯化 , 直至得到单菌落 , 斜面保存备用 。
1.2.2　待测样品制备:将分离得到的菌株 , 接入发酵培养基中 28℃, 150r /m in振荡培
养 。培养至 96h取培养液 1mL, 1,000r /m in离心 5m in, 上清为待测样品。
1.2.3　抗菌活性测定:采用杯碟法测定样品抗真菌活性 。接种供试真菌于马铃薯培养
基 (PDA)平板中央 , 28℃培养至菌落直径长为 3cm左右 , 取出置 4℃冰箱备用 。在离
菌丝前沿 5mm处放置灭过菌的牛津杯 , 取样品 100μL加入其内 , 每平板以无菌蒸馏水
或上柱缓冲液为对照 , 28℃培养 8 ～ 72h后 , 观察真菌菌丝生长受抑制情况 。
1.2.4　菌株形态和生理生化特征研究:菌株 SS02形态学观察和生理生化实验参照文
献 [ 2] 进行 。
1.2.5　PCR扩增:按试剂盒操作说明书提取细菌基因组 DNA为模板 , 以 27F (5’ -
AGAGTTTGATCATGGCTCAG -3’ ) 和 1540R (5’ -AAGGAGGTGATCCAACCGCA-3 ’ )
为上 、 下游引物 [ 3]扩增各菌株的 16S rDNA。 PCR反应体系:Ex Taq酶 0.3μL、 dNTP
4μL、 DNA模板 1μL、 上游引物 (17μmol /L) 1.3μL、 下游引物 (22μmo l /L) 1μL、
10×Buffer 5μL、双蒸水 33.4μL。反应条件:95℃ 5m in;94℃ 1m in, 55℃ 1m in, 72℃
4m in, 循环 30次;72℃ 15m in。用胶回收试剂盒回收片段 , 由上海生物芯片工程公司
测序。测序引物为 27F、 518F (5’ -CAGCAGCCGCGGTAATACGG -3’ )和 1540R。
1.2.6　16S rDNA序列分析:用 B lastn比较菌株 16S rDNA与 GenBank中已登录的序列 ,
调出与菌株 16S rDNA同源并经过菌种鉴定的序列 , 用 C lustalw进行多重序列对比 , 用
软件 Phy lip按 Ne ighbo r-Jo in ing法构建系统发育树。
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2　结果
2.1　内生菌的分离
按方法从华重楼地下块茎中分离得到 107株内生菌 , 分离过程中发现一株菌 (编
号为 SS02)强烈抑制同平板上的其他菌的生长。
2.2　抗菌谱的测定
制备 SS02的发酵液 , 同时接种供试菌株 , 测定 SS02对供试菌株的作用 (表 1)。
表 1　 SS02对致病真菌的抑制作用
致病真菌 活性 致病真菌 活性
芦笋茎枯病菌 ++ 油菜菌核病菌 +++
番茄灰霉病菌 ++ 小麦叶锈病菌 ++
苹果轮纹病菌 +++ 冬瓜枯萎病菌 +++
棉花枯萎病菌 + 稻瘟病菌 ++
杨树溃疡病菌 ++ 小麦根腐病菌 +
小麦全蚀病菌 + 绿色木霉 +++
黄瓜碳疽病菌 +
注:+++表示活性较强 , ++表示活性强, +表示有活性
2.3　菌株形态和生理生化特征
菌株 SS02的形态特征与生理生化试验结果见表 2, 检索文献 [ 4] 初步确定 SS02
为芽孢杆菌属 (Bacillus sp.)细菌 。
图 1　PCR和总 DNA提取琼脂凝胶电泳
1、 2　菌株 SS02PCR扩增的条带 , 3、 4　菌株 SS02
的总 DNA条带 , 5　M arkes (λ- DNA /E coT14)
2.4　DNA提取和 PCR扩增
从生长旺盛的菌株体内得到了细菌的总 DNA , 用引物 27F和 1540R进行 PCR扩
增 , 得到一条约为 1.5kb带 , 结果见图 1。
　表 2　菌株形态和生理生化特征
SS02
菌体形态 长杆状
排列方式 链状
菌体大小 长: 4. 5μm ～ 5μm宽:0. 5μm ～ 0. 75μm
芽孢 有
革兰氏染色 +
氧化酶实验 -
过氧化氢酶实验 -
产生吲哚实验 +
酪素水解实验 +
明胶水解实验 +
硝酸盐还原实验 +
甲基红实验 +
淀粉水解实验 +
从甘油产生二羟基丙酮实验 -
葡萄糖发酵实验 发酵型产酸
V.P实验 +
注:+表示阳性 , -表示阴性
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2.5　16S rDNA系统发育分析
委托上海生物芯片工程公司测得 SS02的部分 16S rDNA上游 539bp、 下游 644bp
(G enBank接收号为 AY842144)。 B lastn比较发现 SS02的 16S rDNA上 、 下游序列分别
与多株芽孢杆菌的 16S rDNA相似 , 调出分别与 16S rDNA上 、 下游序列相似并经过鉴
定的菌株的 16S rDNA序列 , 用 C lusta lw进行多重序列对比 , 用软件 Phy lip按 N eighbor-
Joining法构建系统发育树 , 结果见图 2。由图 2可知 SS02的 16S rDNA上 、 下游序列分
别与 AF391124 (Paenibacillus daejeonensis)处于同一分支 , 用 C lustaWl 比对计算 SS02
的部分 16S rDNA (1183bp) 与 AF391124的同源性 , 结果为 97.7%, 表明 SS02与
Paenibacillus daejeonensis同种 , 命名为 Paenibacillus daejeonensis SS 02。
图 2　SS02的 16S rDNA系统发育树
致谢　中国农业科学院作物科学研究所重大工程开放实验室潘映红等老师提供了试验
菌株 , 冯定胜 、 张晓洁在实验中做了部分工作 , 特致感谢。
参 考 文 献
[ 1] 黄秀梨 .微生物学实验指导 .北京:高等教育出版社 , 1996. 114.
[ 2] 张纪忠 .微生物分类学 .上海:复旦大学出版社 , 1990. 93 ～ 105.
[ 3] 刘志恒 .现代微生物学 .北京:科学出版社 , 2002. 62 ～ 63.
[ 4] BUCHANAN R E, G IBBONS N E.伯杰细菌鉴定手册 .中国科学院微生物研究所 《伯杰细菌鉴定手册》翻译组
译 (第 8版) .北京:科学出版社 , 1984.
[ 5] Baker B, Zam bryski P, S taskaw icz B, et a l.C rop S cience, 1997, 276:726～ 733.
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