全 文 ：第 26 卷第 9 期
2006 年 9 月
生 　　态 　　学 　　报
ACTA ECOLOGICA SINICA
Vol. 26 ,No. 9
Sep. ,2006
啶虫脒污染下土壤微生物多样性
姚晓华1 ,2 ,闵　航1 , 3 ,袁海平1
(1. 浙江大学生命科学学院 ,杭州　310029 ; 2. 广西大学农学院 ,南宁　530005)
基金项目 :国家自然科学基金资助项目 (30370048)
收稿日期 :2005212229 ;修订日期 :2006207228
作者简介 :姚晓华 (1971～) ,女 ,陕西扶风人 ,博士 ,主要从事环境微生物学研究. E2mail :xhyao @gxu. edu. cn3 通讯作者 Corresponding author. E-mail :minhang @zju. edu. cn
Foundation item :The project was supported by National Natural Science Foundation of China (No. 30370048)
Received date :2005212229 ;Accepted date :2006207228
Biography : YAO Xiao2Hua , Ph. D. , mainly engaged in environmental microbiology. E2mail :xhyao @gxu. edu. cn
摘要 :避开传统的分离培养过程 ,采用现代分子生物学方法探讨了杀虫剂啶虫脒污染条件下旱地土壤微生物种群多样性。通过
对不同培养时间、不同浓度啶虫脒污染下旱地土壤微生物进行 DGGE 基因多样性的分子指纹图谱分析 ,发现随着培养时间不
同 ,各处理之间的土壤微生物基因多样性出现了一定的差异。但在整个试验过程中 ,正常田间使用浓度 (015mg kg - 1干土) 的啶
虫脒对土壤微生物群落的影响不明显 ,DGGE图谱条带与对照没有明显差异 ,土壤微生物基因多样性没有明显下降 ,这说明在
旱地中使用正常田间浓度的啶虫脒不会对微生物群落造成较大的影响 ,高浓度啶虫脒对土壤微生物群落基因多样性有一定的
影响 ,但是影响时间不长。在培养第五周时 ,浓度为 5 mg kg - 1干土的土样出现了特异性条带 ,为对照所没有 ,其他处理浓度染
色暗淡。经序列比对分析 ,与来自土壤的 Uncultured bacterium具有 100 %的相似率 ,可能为不可培养或未培养过的细菌种。
关键词 :啶虫脒 ;PCR2DGGE;微生物多样性
文章编号 :100020933(2006) 0923074207 　中图分类号 :Q938 ,X172 　文献标识码 :A
Microbial diversity in an acetamiprid2polluted upland soil
YAO Xiao2Hua1 ,2 , MIN Hang1 , 3 , YUAN Hai2Ping1 　(1. College of Life Science , Zhejiang University , Hangzhou 310029 , China ; 2. College
of Agriculture , Guangxi University , Nanning 530005 , China) . Acta Ecologica Sinica ,2006 ,26( 9) :3074～3080.
Abstract :Acetamiprid is an insecticide used on cotton , leafy vegetables , fruit trees , and other horticultural crops to control
sucking insects. Acetamiprid has been classified as an unlikely human carcinogen and it has relatively low acute or chronic toxicity
in mammals. As an insecticide , considerable part of applied acetamiprid would enter actually soil . However , it’s possible effects
on the soil bacterial community have not be well known update. We examined bacterial community composition in an acetamiprid2
polluted upland soil in China using PCR2DGGE method which can detect variation of microbial gene diversity in environments.
Soils to which acetamiprid was applied at the normal field dose (015 mg kg - 1 dry soil) , at higher dose (5mg kg - 1 , 25 mg kg - 1 ,
50 mg kg - 1) or not applied were put in pots , respectively , incubated at 28℃, and sampled weekly after incubation for PCR2
DGGE analysis. Soil sample DNA was extracted using the SDS2high strength salt method and purified by CsCl2 . The V3 region of
16S rDNA was amplified using the universal primers (BSF8Π20 and BSR1541Π20 ; F338GC and R518) . Amplified DNA fragments
were separated by parallel denaturing gradient gel electrophoresis ( DGGE) . The DGGE results indicated that there were
differences in bacterial community diversity in upland soils treated with different concentrations of acetamiprid. There was no
significant difference in DGGE patterns between 015 mg kg - 1 dry soil of acetamiprid and the control soil during the whole
incubation time. This suggested that acetamiprid applied at the normal field dose would be unlikely to pose a threat to soil bacterial
communities. However , changes were observed in DGGE fingerprints derived from soil after one week receiving the high
concentrations of acetamiprid , such as 5 , 25 , and 50 mg kg- 1 dry soil . DNA in application2responsive bands from the acetamiprid
treatments was recovered and amplified using the universal primers ( F338 and R518) . PCR products were recovered and cloned
into pGEM2T Easy (Promega) and two clones were obtained. The two clones were sequenced using the automated Model 377 or
3730 DNA sequencing system (Applied Biosystems) . The two cloned sequences had very high similarities (100 %) to many
uncultured bacteria reported previously in database of NCBI.
Key words :acetamiprid ; PCR2DGGE; bacterial diversity
长期以来 ,农药对土壤微生物生态的影响研究主要采用平板计数等传统方法。然而 ,文献报道 ,能培养的
微生物只占土壤微生物种类总数的 011 %～1 %[1 ] ,因而分离得到的微生物并不能真实反映土壤微生物的原始
状态[2 ] ,所以传统方法越来越不能满足人们探索土壤生态的需求。目前随着分子生物技术的发展 ,一些先进
的分子生物学方法已经用来评价农药对土壤微生物群落多样性变化影响[3～6 ] 。
啶虫脒是一种正被广泛使用的比较新的类烟碱杀虫剂 ,关于啶虫脒对土壤细菌多样性的影响国内外均尚
未报道。本研究选取不同浓度啶虫脒处理土壤为研究对象 ,通过土壤微生物总 DNA 提取、PCR 扩增及变性梯
度凝胶电泳 (DGGE) ,获得土壤微生物 16S rDNA V3 可变区序列 ,对啶虫脒污染下旱地土壤细菌基因多样性变
化进行了生物信息学分析。
1 　材料与方法
111 　供试土壤
本研究土壤样品为采自浙江临平 ———从未施用过啶虫脒的长期种植旱作的灰潮土。取 2～15 cm 耕作层
新鲜土样 ,风干 ,过 1 mm 筛 ,混匀备用。供试土壤理化性质为 :pH 7184 ,有机质含量 1512 g kg - 1 ,全氮 118 g
kg - 1 ,全磷 5 g kg - 1 ,全钾 1817 g kg - 1 。
112 　试验设置与实施
取经上述处理的新鲜风干土 ,称取 115 kg ,分别装入相同带有通气玻璃管的塑料小桶 (上口直径 179 mm ,
底面直径 134 mm ,高 161 mm)中 ,将含水量调到最大田间持水量的 60 % ,以模拟田间环境 ,于 28 ℃预培养 2
周。随后分别加入不同剂量 3 %的啶虫脒乳油 ,使终浓度为 0、015、510、50 mg kg - 1干土。每个处理 3 个重复。
113 　土壤总 DNA 的提取
参照文献[7 ,8 ]中的方法进行 ,取 5g 湿土 ,加 011 molΠL 磷酸缓冲液 (pH810) 5ml ,加入直径为 011、015mm 和
5mm 玻璃珠各 015g ,并于室温下振荡 5 min ,加入溶菌酶 25 mg ,使终浓度为 215mg ml - 1 ,室温下振荡 15 min ,然
后于 4 ℃下放置 30 min。加入 600μl 20 %SDS 处理 15 min ,分装到 Ep 管中。每个 Ep 管装入 015 ml 上述混合
物 ,然后加等体积饱和酚抽提。12000r min - 1离心 15min ,取上清液 ,加入等体积的氯仿2异戊醇 (24∶1) 抽提 3
次 ;12000r - 1离心 15min ,取上清 ,加入预冷的无水乙醇 , - 20 ℃放置 2h。12000r min - 1离心 15min ,沉淀用 70 %
无水乙醇洗涤 1 次 ,去乙醇后 37 ℃干燥。干燥后每管加适量 TE 缓冲液垂悬 ,合并于一管 ,加入 CsCl2 ,使终浓
度为 (1g ml - 1 ) ,室温下静置 3h ;14000 r min - 1离心 20 min ,取上清液加入 4ml 去离子水、3ml 冷异丙醇于室温下
静置 15 min。14000 min - 1离心 15 min ,干燥 ,沉淀定容于1000μl TE中 ,加入 200μl 8 mol L - 1 KAc 溶液 ,室温放置
15min。14000r min - 1离心 15min ,去上清液 ,加入 600μl 冷异丙醇 ,混匀 ,置室温下放置 5min。14000r min - 1离心
15min ,DNA 沉淀用 70 %乙醇清洗 ,离心、干燥 ,定容于 200μl TE缓冲液中。
114 　PCR 扩增
用于 16S rDNA 的 PCR 扩增反应的引物为一对通用引物[9 ] ,其序列如下 :正向引物 BSF8Π20 ,5′2AGAGT
TTGAT CCTGG CTCAG23′( E1 coli 对应位置为 8～27) ;反向引物 BSR1541Π20 :5′2AAGGA GGTGA TCCAG CCGCA2
3′( E1 coli 对应位置 1541～1522) 。用于 DGGE 电泳的 PCR 扩增产物的引物序列为 :338F :5′2CGC CCG CCG
CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GAC TCC TAC GGGAGG CAG CAG23′;518R :5′2ATT ACC GCG
GCT GCT GG23′(正向引物的 5′端连接 GC 环主要是为了增加 DNA 双链解链区的数量) [10 ] 。
115 　PCR 反应产物的变性梯度凝胶电泳及染色
采用 Bio2Rad 公司 Dcode TM 的基因突变检测系统对 PCR 反应产物进行分离。10 %的聚丙稀酰胺凝胶变
57039 期 姚晓华 　等 :啶虫脒污染下土壤微生物多样性 　
性范围为 35 %～5215 %。150V 电压下 ,60 ℃电泳 330min。电泳结束后 ,采用银染法染色 ,最后利用 Bio2Rad 凝
胶成像分析系统进行拍照并分析。
116 　凝胶指纹图谱的生物信息学分析
DGGE指纹图谱分析借助于 Bio2Rad 公司的凝胶成像系统 (Quantity One 41111 , Bio2Rad , USA) 进行条带判
读 ,以配套软件 Quantity One 进行迁移率、强度、面积计算 ,并计算样品间的相似指数、绘制泳道间遗传图。
117 　特异性条带的割胶回收与克隆
将 DGGE图谱上的特异性条带进行割胶回收 ,回收的条带浸泡在 50μl 无菌水中 4 ℃过夜 ,取 1μl 为模板进
行基因组总DNA16S rDNA V3 区扩增体系和程序再次扩增 (此时引物 338F 不要 CG环) 。扩增产物通过V2gene
DNA 凝胶回收试剂盒进行纯化。纯化产物与 p GEM2T Easy vector ( Promega) 连接 ,产物用 CaCl2 法转化到
E1 coli DH5αΠJM109 细胞中。对于阳性克隆直接取 1μl 培养液作为反应模板 ,以原扩增引物进行 PCR 反应。
利用 PE公司的 ABI 3700 型全自动测序仪测序得到 (约 180bp) 序列 ,将所得序列通过 Blast 程序与 GenBank 中
核酸数据进行比对分析 (http :ΠΠwww1ncbi1nlm1nih1govΠblast) 。
2 　结果与分析
211 　不经培养土壤微生物总 DNA 的提取和 16S rDNA V3 区的扩增
土壤 DNA 的提取方法多样 ,但是基本原理都是裂解土壤中微生物细胞 ,去除蛋白质、腐殖酸等杂质。在
样品量不大的情况下 ,可利用土壤 DNA 提取商业试剂盒。但在样品量很大的情况下 ,利用试剂盒不经济。本
试验采取的是 SDS2酚氯仿抽提法 ,经电泳检测提取的 DNA 大小在 21kb 左右 ,并且杂质含量较少 ,基本没有拖
尾 (见图 1) 。
土壤总 DNA 经过 nest2PCR ,即以所提取土壤总 DNA 作为模板 ,以 BSFΠBSR 作为引物扩增出 16S rDNA 全
长后 ,在以 338FΠ518R 作为引物进行 2 次 PCR 扩增 ,可获得特异性 16S rDNA V3 区扩增片段 ,大小在 240bp 左
右 (图 2) 。
图 1 　采用 SDS2酚氯仿抽提法提取总 DNA 琼脂糖电泳图
Fig. 1 　Agrose gel electrophoresis of total DNA extracted from soil using SDS2
phenol2chloroform method
M , marker ; Land 1 , 2 and 3 , 0. 5 mg kg - 1 , 5 mg kg - 1 , 25 mg kg - 1
samples incubated for one week , respectively
图 2 　引物 338F、518R PCR 扩增产物的电泳条带
Fig. 2 　Agrose gel electrophoresis of V3 variable region on 16S rDNA
amplified from soil treated with acetamiprid
M , marker ; Land 1 , 2 and 3 , 015 mg kg - 1 , 5 mg kg - 1 , 25 mg kg - 1
samples incubated for one week , respectively. Land 4 , negative control
　　可见本试验土壤采用 SDS2酚氯仿抽提法提取的 DNA 结果良好 ,可以获得较为理想的 16S rDNA V3 区扩
增片段 ,便于后续实验的进行。
212 　DGGE的指纹图谱分析
通过对不同浓度啶虫脒处理的旱地土壤 16S rDNA V3 可变区片段进行 DGGE 指纹图谱分析 ,结果显示在
处理的第一周 ,不同浓度啶虫脒胁迫下的土壤微生物区系的基因条带出现较为明显的差别 (图 3) 。与对照土
壤相比 ,015 mg kg - 1干土浓度处理土样的微生物群落条带变化不大 ,表明正常田间施用量对土壤中微生物基
本没有影响 ,25 mg kg - 1 、50 mg kg - 1干土这两个高浓度处理土样之间的条带非常相似。
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通过 Bio2Rad 凝胶成像系统对 DGGE指纹图谱进行生物信息学分析 ,绘制不同浓度啶虫脒处理土样之间
的遗传簇关系 (图 4) ,图中各泳道间条带所代表的遗传簇异同表示了各土样微生物之间多样性亲缘关系远
近。聚类分析表明 ,各重复土壤聚于一簇 ,说明重复之间差别较小 ,重复性较好。对照土样与最低浓度土壤位
置较近 ,归为一簇 ,表明低浓度啶虫脒对旱地土壤微生物影响较小 ,其种群差异不明显 ,基因多样性较为一致。
随着浓度的增加 ,基因多样性差异明显。3 个高浓度处理土样聚为一簇 ,其中 25mg kg - 1和 50mg kg - 1干土两个
最高浓度的位置较近 ,它们相对于对照土样的 Jaccard 指数相似性 (6218、5717) 明显低于对 015mg kg - 1干土土
样相对于对照的指数 (8517) 。
图 3 　不同浓度啶虫脒处理第 1 周后土壤总 DNA 扩增的 16S rDNA
的 DGGE图谱
Fig. 3 　DGGE profiles of amplified 16S rDNA fragments from soil applied
with acetamiprid in different concentrations for one week
泳道Lanes :1～3 ,对照 control ;4～6 ,015 mg kg - 1 dry soil ; 7～9 ,5mg
kg - 1 dry soil ;10～12 ,25mg kg - 1 dry soil ;13～15 ,50mg kg - 1 dry soil
图 4 　不同浓度啶虫脒处理 1 周后土壤总 DNA 扩增的 16S rDNA 片
断多样性聚类分析
Fig. 4 　Cluster analyses of amplified 16S rDNA fragments from soil amended
with acetamiprid in different concentrations for one week
泳道Lanes :1～3 ,对照 control ;4～6 ,015 mg kg - 1 dry soil ; 7～9 ,5mg
kg - 1 dry soil ;10～12 ,25mg kg - 1 dry soil ;13～15 ,50mg kg - 1 dry soil ;下
同 the same below
　　培养两周后 16S rDNA 的 DGGE电泳图谱 (图 5)发生了变化 ,啶虫脒处理导致土壤中细菌种群结构改变。
电泳图谱泳道间的遗传簇关系 (图 6)同样说明了这点。在图 6 中 ,015 mg kg - 1和 5mg kg - 1干土土样聚在一簇 ,
25 mg kg - 1和 50 mg kg - 1干土土样聚在一簇 ,与对照土样距离较远。50 mg kg - 1干土土样的指数相似性 (4310)
与对照 (100)差异非常显著 ,说明啶虫脒对土壤细菌群落结构有一定的影响 ,特别是高浓度的啶虫脒对群落结
构的影响比较大。
又经过 2 周的培养 ,DGGE图谱 (图 7)又有所改变 ,低浓度处理土样的条带数量有所增加 ,与对照土样的
相似。
聚类树状图 (图 8)反映了啶虫脒处理土壤与对照土样之间的基因多样性差异 ,高浓度啶虫脒污染土壤的
微生物基因多样性继续发生较大变化 ,仍然不能与对照土样归于一簇。低浓度啶虫脒随着在土壤中降解而减
少 ,对土壤细菌种群的影响减少 ,又与对照归为一簇。
第 5 周时啶虫脒对土壤微生物群落的影响继续减小 (图 9) ,25 mg kg - 1 和 5 mg kg - 1处理土样归为一簇 ,
015mg kg - 1干土浓度处理土样与对照归为一簇 ,最高浓度土样单独成簇 (图 10) 。在 5 mg kg - 1干土、25 mg kg - 1
干土处理土样中出现染色较亮的特异性条带 (箭头所指) 。上面的特异条带在 5 mg kg - 1干土土样中染色较
亮 ,在 50 mg kg - 1干土土样中染色较暗 ;下面的特异性条带仅在 5 和 25 mg kg - 1干土这两个土样中出现。
经过长时间的培养 ,啶虫脒对土壤微生物多样性的影响趋势不明显 ,主要可能是由于啶虫脒在土壤中逐
渐被分解[11 ] ,失去有效性造成。从图 11 可以看出 ,各个泳道之间的条带差异 (无论是条带的数量还是量度)
77039 期 姚晓华 　等 :啶虫脒污染下土壤微生物多样性 　
已经不明显 ,电泳图谱泳道间的遗传簇关系 (图 12)同样验证了上述结果。50 mg kg - 1干土处理土样已经和对
照归为一簇 ,而且与其它处理也位置较近。从相似性指数对比中也可以看出 ,各个处理与对照间相似性增加。
此时不同浓度啶虫脒对处理土样间微生物种群的影响已经不明显。
图 5 　不同浓度啶虫脒处理第 2 周后土壤总 DNA 扩增的 16S rDNA
的 DGGE图谱
Fig. 5 　DGGE profiles of amplified 16S rDNA fragments from soil applied
with acetamiprid in different concentrations for two weeks
图 6 　不同浓度啶虫脒处理 2 周后土壤总 DNA 扩增的 16S rDNA 片
断多样性聚类分析
Fig. 6 　Cluster analyses of amplified 16S rDNA fragments from soil amended
with acetamiprid in different concentrations for two weeks
图 7 　不同浓度啶虫脒处理第 4 周后土壤总 DNA 扩增的 16S rDNA
的 DGGE图谱
Fig. 7 　DGGE profiles of amplified 16S rDNA fragments from soil applied
with acetamiprid in differernt concentrations for four weeks
图 8 　不同浓度啶虫脒处理 4 周后土壤总 DNA 扩增的 16S rDNA 片
断多样性聚类分析
Fig. 8 　Cluster analyses of amplified 16S rDNA fragments from soil amended
with acetamiprid in different concentrations for four weeks
213 　特异性条带测序和比对结果分析
对图 9 中出现的特征性条带所代表的微生物进行初步鉴定 ,割胶回收克隆 ,经序列测定得到长度约为
197bp 的 16S rDNA V3 区可变序列 ,碱基序列见下 :
ACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAA
TGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGA
AGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGG
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GAGTAAAGTTAATACCTTTGCTCATTGACGTTACCCGCAG
AAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAAT
图 9 　不同浓度啶虫脒处理第 5 周后土壤总 DNA 扩增的 16S rDNA
的 DGGE图谱
Fig. 9 　DGGE profiles of amplified 16S rDNA fragments from soil applied
with acetamiprid in different concentrations for five weeks
图 10 　不同浓度啶虫脒处理 5 周后土壤总 DNA 扩增的 16SrDNA 片
断多样性聚类分析
Fig. 10 　Cluster analyses of amplified 16S rDNA fragments from soil amended
with acetamiprid in different concentrations for five weeks
图 11 　不同浓度啶虫脒处理第 7 周后土壤总 DNA 扩增的 16S rDNA
的 DGGE图谱
Fig. 11 　DGGE profiles of amplified 16S rDNA fragments from soil applied
with acetamiprid in different concentrations for seven weeks
图 12 　不同浓度啶虫脒处理 7 周后土壤总 DNA 扩增的 16S rDNA 片
断多样性聚类分析
Fig. 12 　Cluster analyses of amplified 16S rDNA fragments from soil amended
with acetamiprid in different concentrations for seven weeks
　　将该序列提交 GenBank ,得到序列号DQ499993。通过Blast 程序将该序列与 GenBank 中核酸数据进行比对
分析 ,结果表明 ,该菌株序列与 2 株来自土壤的 Uncultured bacterium 具有 100 %的相似率[12 , 13 ] ,可初步确定该
菌为不可培养或尚未培养过的种。该菌在对照土壤中数量很少 ,达不到 DGGE 检测下限 ,但是啶虫脒浓度为
5 mg kg - 1干土的土壤中则可大量富集 ,在 DGGE 图谱上呈现出明显的条带 ,啶虫脒含量增大 (如浓度为 50mg
kg - 1干土)时条带变暗或者消失 ,说明在啶虫脒引起的土壤细菌群落变化过程中 ,有很多是不可培养或尚未培
养过的细菌 ,这些细菌可能对 5 mg kg - 1干土这个浓度十分敏感 ,这个是用传统平板培养方法所不能发现的。
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当然这是否可以作为一种在合适的啶虫脒污染环境中特征性细菌、并以其作为啶虫脒污染的指示基因需要进
一步试验证明。
3 　结论
不经过培养 ,从土壤中直接抽提微生物的总 DNA ,由于避免了在培养过程中的筛选和富集作用 ,能够更
直接地反映土壤中微生物多样性及种群分布情况。本方法应用于研究污染土壤环境下的土壤微生物生态多
样性研究 ,比传统培养过程更快也更准确 ,对于全面掌握污染环境微生物变化具有重要意义。同时 ,新方法的
引用 ,进一步丰富了旱地土壤农药污染环境质量的指标 ,为通过基因多样性变化评估旱地土壤啶虫脒污染程
度提供了一些理论基础。
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