全 文 ：核 农 学 报摇 圆园员源袁圆愿渊愿冤院员源源园 耀 员源源缘
允燥怎则灶葬造 燥枣 晕怎糟造藻葬则 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 杂糟蚤藻灶糟藻泽
收稿日期院圆园员猿鄄员员鄄圆远摇 接受日期院圆园员源鄄园猿鄄圆苑
基金项目院浙江省重大科技专项渊圆园员圆悦园猿园冤袁浙江省教育厅科研项目渊再圆园员猿圆苑猿远圆冤袁浙江省自然科学基金渊再圆员园园园园圆冤
作者简介院应南娇袁女袁讲师袁主要从事高压脉冲电场应用研究遥 耘鄄皂葬蚤造院 赠蚤灶早灶躁岳 澡凿怎援 藻凿怎援 糟灶
通讯作者院杨勇袁男袁教授袁主要从事高压脉冲场应用研究遥 耘鄄皂葬蚤造院赠赠葬灶早岳 澡凿怎援 藻凿怎援 糟灶
文章编号院员园园园鄄愿缘缘员渊圆园员源冤园愿鄄员源源园鄄园远
高压脉冲电场对大肠杆菌噬菌体灭活效果初探
应南娇摇 付摇 荣摇 杨摇 勇摇 章摇 娟
渊杭州电子科技大学生命信息与仪器工程学院袁浙江 杭州摇 猿员园园员愿冤
摘摇 要院为探讨高压脉冲电场渊责怎造泽藻凿 藻造藻糟贼则蚤糟 枣蚤藻造凿袁孕耘云冤在噬菌体污染治理方面的工业应用袁研究了高压
脉冲电场对 姿噬菌体尧椎载员苑源 噬菌体以及宿主菌 耘援 糟燥造蚤 酝灾员员愿源 的灭活效果遥 采用不同电场强度 耘袁脉
冲个数 晕和脉冲宽度 卦体系对 姿噬菌体尧椎载员苑源 噬菌体以及 姿噬菌体和 耘援 糟燥造蚤 酝灾员员愿源 混合悬液进行
处理遥 结果表明在输出电压 员 耀 员园噪灾袁脉冲宽度 员 耀 员园滋泽 范围内袁灭活效率随着脉冲数的增加而提高遥
孕耘云对噬菌体的灭活效率并不依赖于噬菌体的颗粒结构袁但噬菌体颗粒结构对脉冲宽度 卦 灭活效率有
影响遥 在噬菌体与宿主菌 耘援 糟燥造蚤 酝灾员员愿源 的混合悬液中袁姿噬菌体对 孕耘云的灭活作用更加敏感袁失活率
显著高于 耘援 糟燥造蚤 酝灾员员愿源遥 高压脉冲电场可以用于常温下溶液中噬菌体的灭活处理并达到消毒水平袁是
一种高效的噬菌体灭活方法遥
关键词院大肠杆菌曰 高压脉冲电场曰 灭活曰 噬菌体
阅韵陨院员园郾 员员愿远怨 辕 躁援 蚤泽泽灶援 员园园鄄愿缘缘员郾 圆园员源郾 园愿援 员源源园
摇 摇 噬菌体是感染细菌的一种病毒袁能够通过侵染宿
主菌而造成污染袁广泛存在于适合宿主菌生存的泥土尧
污水和空气中咱员暂 遥 细菌及重组细菌被广泛的用于食
品尧药品及酶工程等发酵生产中袁而噬菌体对细菌的污
染会导致产量减少尧生产紊乱甚至造成产品污染等损
失咱圆暂 遥 工业上目前主要采用高温加热和化学消毒治
理噬菌体的污染咱猿 原 源暂 袁但高温加热会导致维生素尧糖
类尧蛋白质等的变性和降解袁而化学消毒会造成产品的
二次污染咱缘 原 远暂 遥 噬菌体污染作为发酵工业生产上的复
杂问题袁至今没有完整满意的解决方法遥
高压脉冲电场渊责怎造泽藻凿 藻造藻糟贼则蚤糟 枣蚤藻造凿袁孕耘云冤技术是
一项很有工业应用前景的非热杀菌技术咱苑暂 遥 其原理
是利用两个电极间产生的瞬时高压袁以脉冲电场形式
作用于物料袁在最接近常温下可以有效的灭菌并保持
食品的色泽尧风味和营养成分咱愿 原 怨暂 遥 部分国家与地区
已经将高压脉冲电场应用于纯净水尧鲜果汁尧鲜牛奶尧
鸡蛋尧蔬菜等食品加工与保鲜处理咱员园 原 员猿暂 遥 目前国内外
还没有报道关于 孕耘云对噬菌体的灭活研究遥
本文以 姿噬菌体和 椎载员苑源 噬菌体为研究对象袁探
讨 孕耘云在噬菌体污染治理方面的工业应用遥 主要分
析电场强度 耘袁脉冲个数 晕袁脉冲宽度 卦对噬菌体的灭
活效果影响袁并比较噬菌体与宿主菌对高压脉冲电场
作用敏感性差异遥
员摇 材料与方法
员郾 员摇 大肠杆菌和噬菌体及其培养
姿噬菌体尧椎载员苑源 噬菌体尧宿主菌大肠杆菌 耘援 糟燥造蚤
酝灾员员愿源 购自 栽葬噪葬则葬 公司遥 蕴月 培养基为胰蛋白胨
员园早袁氯化钠 缘郾 园早袁酵母提取物 缘郾 园早袁蒸馏水 员 园园园皂蕴遥
耘援 糟燥造蚤 酝灾员员愿源 接种于 蕴月 培养基袁猿苑益震荡培养到
韵阅远园园为 园郾 缘 耀 园郾 愿袁加入 员皂蕴 噬菌体悬液袁震荡培养 远耀愿澡遥 在三角锥形瓶中加入数滴氯仿袁震荡 猿园皂蚤灶袁以
缘 园园园则窑皂蚤灶 原员离心 圆园皂蚤灶袁收集上清为噬菌体悬液袁源益
保存备用遥
员郾 圆摇 噬菌体滴度测定
采用空斑形成单位法渊责造葬择怎藻 枣燥则皂蚤灶早 怎灶蚤贼袁孕云哉冤
测定噬菌体滴度遥 将待测定的噬菌体悬液做 员园 倍系
列稀释袁取 圆园园怎蕴宿主菌培养物分别加到各平皿的底
层培养琼脂渊员郾 缘豫琼脂冤袁吸取适当稀释度的噬菌体
园源源员
摇 愿 期 高压脉冲电场对大肠杆菌噬菌体灭活效果初探
悬液 圆园园怎蕴加入各平皿袁与宿主菌充分混合袁在底层培
养琼脂上倒入 猿皂蕴 冷却至 源缘益 的上层培养琼脂
渊园郾 远豫琼脂冤袁凝固后 猿苑益倒置培养 圆源澡袁计算噬菌斑
数量遥 每一稀释度接种 猿 个平皿袁取平均值计算噬菌
体效价渊孕云哉窑皂蕴 原员冤遥
员郾 猿摇 高压脉冲电场仪器与参数设置
电场强度 耘计算公式 耘 越 哉 辕 凿袁总处理时间 栽 越 晕
伊 卦袁脉冲数 晕 越 贼 伊 枣袁其中 哉要输出电压袁凿要极间距袁
卦要脉冲宽度袁贼要停留时间袁枣要脉冲频率遥 本试验采用
具有自主知识产权的高压脉冲电场渊孕耘云冤处理系统袁
输出电压 哉 为 员 耀 员园园噪灾 可调袁脉冲宽度 卦 为 员滋泽 耀
员园滋泽可调袁频率 枣 为 员 耀 员园园匀扎 可调袁极间距 凿 为 员 耀
圆园糟皂可调袁能够实现输出场强尧脉宽尧脉冲数和脉冲频
率等参数的精确控制遥 孕耘云 系统处理室示意图见图
员袁输出方波脉冲波形见图 圆遥 处理室采用平板不锈钢
电极袁绝缘部分的材料为聚四氟乙烯袁样品处理盘液体
容积 员皂蕴遥 本试验采用的脉冲频率设置为 员园园匀扎袁极
间距为 员糟皂遥
采用平板计数法渊糟燥造燥灶赠 枣燥则皂蚤灶早 怎灶蚤贼泽袁 悦云哉冤计算
大肠杆菌存活率及浓度袁采用 孕云哉法测定噬菌体存活
率遥 用于 孕耘云处理的细胞悬液用 员园皂皂燥造窑蕴 原员磷酸缓
冲液渊责匀值 苑郾 园冤稀释到 员园苑孕云哉窑皂蕴 原员 渊噬菌体冤或者
员园苑悦云哉窑皂蕴 原员渊大肠杆菌冤袁处理体积为 员皂蕴袁样品在
处理后即刻接种到 蕴月 固体培养基上袁猿苑益培养遥 实
验以同批未经 孕耘云处理的样本为阴性对照组遥
图 员摇 渊葬冤孕耘云系统静态处理室示意图曰渊遭冤样品处理盘
云蚤早援 员摇 渊葬冤杂糟澡藻皂葬贼蚤糟 蚤造造怎泽贼则葬贼蚤燥灶 燥枣 泽贼葬贼蚤糟 贼则藻葬贼皂藻灶贼
糟澡葬皂遭藻则 燥枣 孕耘云 泽赠泽贼藻皂 蚤灶 贼澡蚤泽 泽贼怎凿赠曰 渊遭冤 孕澡燥贼燥早则葬责澡
燥枣 泽葬皂责造藻 贼则藻葬贼皂藻灶贼 糟澡葬皂遭藻则
员郾 源摇 扫描电镜分析
细胞用 圆郾 缘豫戊二醛固定袁磷酸缓冲液冲洗袁员豫
锇酸处理 源澡袁清洗后乙醇脱水袁乙酸异戊酯置换袁置于
临界点干燥器进行 悦韵圆 干燥袁离子溅射金后场发射扫
描电子显微镜渊 云耘杂耘酝袁匀陨栽粤悦匀陨杂哉 原 苑园袁允粤孕粤晕冤观
察分析遥
注院实测电场强度袁脉冲宽度袁极间距遥 葬院员园噪灾袁员滋泽袁员糟皂曰遭院员园园噪灾袁
摇 摇 缘滋泽袁员糟皂曰糟院员园园噪灾袁员园滋泽袁员糟皂曰凿院员园园噪灾袁缘滋泽袁员糟皂遥
晕燥贼藻院 酝藻葬泽怎则藻凿 增葬造怎藻泽 燥枣 藻造藻糟贼则蚤糟 枣蚤藻造凿 蚤灶贼藻灶泽蚤贼赠袁 责怎造泽藻 憎蚤凿贼澡 葬灶凿
藻造藻糟贼则燥凿藻泽 凿蚤泽贼葬灶糟藻援 葬院 员园噪灾袁 员滋泽袁 员糟皂曰 遭院 员园园噪灾袁 缘滋泽袁 员糟皂曰 糟院
摇 摇 员园园噪灾袁 员园滋泽袁 员糟皂曰 凿院 员园园噪灾袁 缘滋泽袁 员糟皂援
图 圆摇 孕耘云输出微秒方波脉冲实测图
云蚤早援 圆摇 酝蚤糟则燥泽藻糟燥灶凿 泽择怎葬则藻鄄憎葬增藻 憎葬增藻枣燥则皂 燥枣 孕耘云 泽赠泽贼藻皂
员郾 缘摇 统计学分析
计算平均噬菌体存活对数值 蕴陨灾 越 渊撞渊 造燥早员园 晕贼 原造燥早员园晕园冤冤 辕 灶袁灶 越 猿遥 其中 造燥早员园 晕园为阴性对照组每 员皂蕴
中含有噬菌体的噬斑形成单位数对数值袁造燥早员园 晕贼为试
验组每 员皂蕴中含有噬菌体的噬斑形成单位数对数值袁
灶为实验重复次数遥 计算平均大肠杆菌存活对数值
运蕴 越 渊撞渊造燥早员园晕曾 原 造燥早员园晕园冤冤 辕 灶袁灶 越 猿遥 其中 造燥早员园晕园为
阴性对照组每 员皂蕴中含有活菌浓度的对数值袁造燥早员园 晕曾
为试验组每 员皂蕴中含有活菌浓度的对数值袁灶 为试验
重复次数遥 采用 杂孕杂杂 软件对数据进行差异性分析及
回归分析袁采用 韵则蚤早蚤灶软件对所得结果进行画图遥
圆摇 结果分析
圆郾 员摇 高压脉冲电场对噬菌体的灭活效果
如图 猿 所示袁在电场强度 员 耀 员园噪灾袁脉冲宽度 员 耀
员园滋泽袁脉冲数 缘园 耀 猿园园 的范围内袁姿 噬菌体和 椎载员苑源
噬菌体的生存率均有显著下降遥 如图 猿葬所示袁在场强
为 远噪灾窑糟皂 原员时袁姿噬菌体和 椎载员苑源 噬菌体的生存率
均下降了 缘 个对数级遥 证实 孕耘云 在室温下对大肠杆
菌噬菌体具有较高的灭活效率袁可以用于噬菌体的灭
活处理遥
圆郾 圆摇 电场强度 耘对灭活效果影响
如图 猿鄄葬 所示袁电场强度在 圆噪灾 时袁姿 噬菌体和
椎载员苑源 噬菌体的生存率下降 猿 个对数级袁而电场强度
提高到 员园噪灾 时袁生存率下降 苑 个对数级遥 试验结果
员源源员
核摇 农摇 学摇 报 圆愿 卷
注院葬院电场强度 耘曰遭院脉冲宽度 卦曰糟院脉冲数 晕遥
晕燥贼藻院 葬院憎蚤贼澡 凿蚤枣枣藻则藻灶贼 藻造藻糟贼则蚤糟 枣蚤藻造凿 蚤灶贼藻灶泽蚤贼赠 耘曰 遭院憎蚤贼澡 凿蚤枣枣藻则藻灶贼 责怎造泽藻 憎蚤凿贼澡 卦曰 糟院憎蚤贼澡 凿蚤枣枣藻则藻灶贼 灶怎皂遭藻则 燥枣 责怎造泽藻泽 晕援
图 猿摇 姿噬菌体和 椎载员苑源 噬菌体的生存率曲线
云蚤早援 猿摇 杂怎则增蚤增葬造 则葬贼藻 糟怎则增藻泽 燥枣 姿 责澡葬早藻 葬灶凿椎载员苑源 责澡葬早藻 遭赠 孕耘云 渊 枣 越 员园园匀扎冤
显示两种结构不同的噬菌体对电场强度敏感性差异不
显著渊孕逸园郾 园缘冤遥 噬菌体的灭活效率随着电场强度 耘
的增大而提高袁电场强度与噬菌体的灭活效率呈正相
关遥 同时测定了 孕耘云 处理前后溶液的温度变化袁孕耘云
处理前溶液温度为室温 圆缘益袁圆噪灾 和 员园噪灾 的场强处
理后袁溶液的温度分别达到了 源圆益和 缘远益袁但并没有
达到噬菌体热处理敏感所需的温度渊苑园益冤遥 说明电
场强度直接影响噬菌体的灭活效率遥
圆郾 猿摇 脉冲宽度 卦对噬菌体灭活效果影响
如图 猿 原 遭 所示袁脉冲宽度 员 耀 员园滋泽 的范围内袁姿
噬菌体和 椎载员苑源 噬菌体的灭活效率都至少下降 源 个
对数级遥 说明 姿噬菌体和 椎载员苑源 噬菌体对微秒渊员 耀
员园滋泽冤脉冲电场的作用敏感遥 根据实验结果得出 姿 噬
菌体在脉冲宽度为 猿滋泽 时灭活效率较高袁椎载员苑源 噬菌
体在脉冲宽度 缘滋泽时灭活效率较高遥 其他参数相同的
情况下袁多面体 姿噬菌体与线性 椎载员苑源 噬菌体对脉冲
宽度 卦 的敏感性差异显著袁说明噬菌体颗粒的结构差
异对灭活效率有一定的影响袁具体的机制还有待进一
步研究遥
圆郾 源摇 脉冲数 晕对噬菌体灭活效果影响
如图 猿 原 糟 所示袁姿 噬菌体和 椎载员苑源 噬菌体灭活
效率随着脉冲数 晕增加而提高袁与脉冲数 晕呈线性显
著相关渊孕臆园郾 园缘冤袁在频率 枣 固定的情况下袁脉冲数 晕
图 源摇 孕耘云作用下 姿噬菌体和 耘援 糟燥造蚤
酝灾员员愿源 在混合悬液中的生存率曲线
云蚤早援 源摇 杂怎则增蚤增葬造 则葬贼藻 糟怎则增藻泽 燥枣 姿 责澡葬早藻 葬灶凿 耘援 糟燥造蚤
酝灾员员愿源 蚤灶 贼澡藻 皂蚤曾贼怎则藻 造蚤择怎蚤凿 遭赠 孕耘云 葬贼 藻造藻糟贼则蚤糟 枣蚤藻造凿
蚤灶贼藻灶泽蚤贼赠 糟燥怎则泽藻泽 憎蚤贼澡 卦 越缘滋泽袁 晕 越员园园
与作用时间 栽 线性相关遥 同时测定 孕耘云 处理前后溶
液的温度变化袁处理溶液内温度随着脉冲数 晕 的增加
而升高遥 处理前温度为室温 圆缘益袁缘园 和 猿园园 个脉冲处
圆源源员
摇 愿 期 高压脉冲电场对大肠杆菌噬菌体灭活效果初探
摇 摇 摇 摇 摇 摇
注院葬院耘援 糟燥造蚤 酝灾员员愿源曰遭院姿噬菌体与 耘援 糟燥造蚤 酝灾员员愿源遥
晕燥贼藻院 葬院 耘泽糟澡藻则蚤糟澡蚤葬 糟燥造蚤 酝灾员员愿源曰 遭院 耘泽糟澡藻则蚤糟澡蚤葬 糟燥造蚤 糟藻造造泽 憎蚤贼澡 姿 责澡葬早藻 责葬则贼蚤糟造藻泽援
图 缘摇 孕耘云渊哉 越圆噪灾袁 卦 越缘滋泽袁 晕 越员园园冤处理后场发射扫描电镜图
云蚤早援 缘摇 栽澡藻 泽糟葬灶灶蚤灶早 藻造藻糟贼则燥灶 皂蚤糟则燥早则葬责澡 渊云耘杂耘酝冤 燥枣 凿蚤泽则怎责贼藻凿 糟藻造造 藻灶增藻造燥责藻泽 遭赠 孕耘云 渊哉 越圆噪灾袁 卦 越缘滋泽袁 晕 越员园园冤
理后袁溶液的温度分别达到了 猿远益和 远愿益遥 在实际的
应用中袁可以通过降低脉冲频率和冷循环来降低温度遥
圆郾 缘摇 耘援 糟燥造蚤 酝灾员员愿源 和 姿噬菌体对高压脉冲电场的
敏感性
将 姿 噬菌体与宿主菌 耘援 糟燥造蚤 酝灾员员愿源 悬液混和袁
比较在电场强度变化下 姿噬菌体与 耘援 糟燥造蚤 酝灾员员愿源 的
生存率遥 在场强为 圆噪灾 时袁姿 噬菌体的生存率下降 猿
个对数级袁耘援 糟燥造蚤 酝灾员员愿源 的生存率为 源苑豫 袁场强为
员园噪灾时袁姿 噬菌体的生存率下降 苑 个对数级袁耘援 糟燥造蚤
酝灾员员愿源 的生存率为 员园 原圆遥 姿 噬菌体的生存率显著低
于 耘援 糟燥造蚤 酝灾员员愿源遥 前期研究数据表明袁本系统作用下
当场强 猿园噪灾袁脉冲数 圆园园袁脉宽 缘滋泽 时袁大肠杆菌生存
率可以下降 远 个对数级遥
试验结果说明 姿噬菌体对 孕耘云 比 耘援 糟燥造蚤 酝灾员员愿源
更加敏感遥 通过扫描电镜观察发现袁 耘援 糟燥造蚤 酝灾员员愿源
细胞在 孕耘云 处理后细胞膜上有穿孔形成渊图 缘鄄葬冤袁噬
菌体在 耘援 糟燥造蚤 酝灾员员愿源 表面聚集密度低袁且呈现不规
则的结构渊图 缘鄄遭冤遥
猿摇 讨论
在本项目中袁孕耘云 可以有效地用于灭活溶液中 姿
噬菌体和椎载员苑源 噬菌体袁提示 孕耘云可以用于治理细菌
溶液中噬菌体的污染遥 在输出电压 员 耀 员园噪灾袁脉冲宽
度 员 耀 员园滋泽范围内袁灭活效率随着脉冲数的增加而提
高袁证实 孕耘云是一种高效的噬菌体灭活方法袁可以用
于常温下噬菌体的灭活处理并达到消毒水平渊蕴陨灾逸
源郾 园园造燥早员园冤 咱员源暂 遥 姿噬菌体和 椎载员苑源 噬菌体具有不同的
颗粒结构咱圆暂 遥 姿噬菌体是双链 阅晕粤 由外壳蛋白包裹
摇 摇 摇 摇 摇 摇
成的多面体结构病毒袁椎载员苑源 噬菌体是单链 阅晕粤 由
外壳蛋白包围的线性结构病毒遥 从试验结果来看袁
孕耘云对噬菌体的灭活效率并不依赖于噬菌体的颗粒结
构袁但两种不同颗粒结构的噬菌体对脉冲宽度的灭活
效率具有显著差异袁说明噬菌体的颗粒结构对灭活效
率有一定的影响遥 孕耘云 作用过程中袁溶液的温度会有
不同程度的升高袁实际应用中可以通过降低脉冲频率
或腔体外冷循环来降低溶液温度袁以最大限度的保持
物料稳定遥
在噬菌体与宿主菌 耘援 糟燥造蚤 酝灾员员愿源 的混合悬液
中袁姿噬菌体对 孕耘云的灭活作用更加敏感袁失活率显著
高于 耘援 糟燥造蚤 酝灾员员愿源遥 孕耘云 对细菌的作用目前普遍认
为是基于野细胞膜电穿孔效应冶袁是指在外加直流电场
作用下袁活体细胞膜内外表面由于带电荷不同而存在
一定的电势差袁细胞膜通透性随着电场强度的增大而
增加袁细胞膜的强度也随之降低而形成许多微
孔咱员缘 原 员远暂 遥 当外加电场为脉冲电场时袁电压剧烈波动袁
导致细胞膜失稳并在膜上形成穿孔袁从而达到杀菌目
的遥 噬菌体并不具有完整的细胞膜结构袁由外壳蛋白
质包裹 阅晕粤形成颗粒结构袁通过感染宿主菌复制与繁
殖遥 有报道证实 孕耘云 作用下使蛋白质疏水基团暴露
限制底物与活性位点的接近而抑制胰岛素 月 链活
性咱员苑暂 袁能够改变木瓜蛋白酶尧胃蛋白酶尧多酚氧化酶和
过氧化物酶的二级结构袁使蛋白质分子发生聚
集咱员愿 原 圆员暂 遥 孕耘云对噬菌体的灭活可能是依赖于 孕耘云 对
蛋白质的聚集作用袁外壳蛋白在 孕耘云 作用下产生疏水
基团与巯基的暴露咱员愿暂 袁部分二硫键交联形成蛋白质聚
集袁导致噬菌体的外壳蛋白变性而失去感染细菌的能
力遥 孕耘云对噬菌体的灭活机制还有待进一步的研究遥
猿源源员
核摇 农摇 学摇 报 圆愿 卷
源摇 结论
电场强度 耘袁脉冲个数 晕 和脉冲宽度 卦 是影响噬
菌体灭活效率的重要因素遥 在 姿 噬菌体与细菌混合
悬液中袁姿噬菌体对 孕耘云 的灭活作用更加敏感遥 高压
脉冲电场是一种高效的噬菌体灭活方法袁可以在常温
下灭活处理溶液中的噬菌体污染遥
参考文献院
咱 员 暂 摇 郧燥造葬蚤泽 云袁 匀燥造造赠 允袁 灾蚤贼噪燥增泽噪葬 允援 悦燥藻增燥造怎贼蚤燥灶 燥枣 遭葬糟贼藻则蚤葬 葬灶凿 贼澡藻蚤则
增蚤则怎泽藻泽咱允暂 援 云燥造蚤葬 酝蚤糟则燥遭蚤燥造燥早蚤糟葬袁 圆园员猿袁 缘愿渊猿冤院员苑苑 原 员愿远
咱 圆 暂 摇 粤噪泽赠怎噪 粤 粤袁砸燥泽泽皂葬灶灶 酝 郧援 月葬糟贼藻则蚤燥责澡葬早藻 葬泽泽藻皂遭造赠咱允暂 援 灾蚤则怎泽藻泽袁
圆园员员袁 猿渊猿冤院员苑圆 原 圆园猿
咱 猿 暂 摇 酝怎造造藻则 原 酝藻则遭葬糟澡 酝袁 砸葬怎泽糟澡藻则 栽袁 匀蚤灶则蚤糟澡泽 允援 陨灶葬糟贼蚤增葬贼蚤燥灶 燥枣
遭葬糟贼藻则蚤燥责澡葬早藻泽 遭赠 贼澡藻则皂葬造 葬灶凿 澡蚤早澡鄄责则藻泽泽怎则藻 贼则藻葬贼皂藻灶贼 咱 允 暂 援
陨灶贼藻则灶葬贼蚤燥灶葬造 阅葬蚤则赠 允燥怎则灶葬造袁 圆园园缘袁 员缘渊远冤院苑苑苑 原 苑愿源
咱 源 暂 摇 蕴藻藻 悦袁运蚤皂 允袁再燥燥灶 允援 陨灶葬糟贼蚤增葬贼蚤燥灶 燥枣 酝杂圆 遭葬糟贼藻则蚤燥责澡葬早藻 遭赠 泽贼则藻葬皂藻则
糟燥则燥灶葬 凿蚤泽糟澡葬则早藻 蚤灶 憎葬贼藻则咱允暂 援 悦澡藻皂燥泽责澡藻则藻袁 圆园员员袁 愿圆渊愿冤院员员猿缘 原
员员源园
咱 缘 暂 摇 悦葬责则葬 酝 蕴袁孕葬贼则蚤早灶葬灶蚤 云袁匝怎蚤遭藻则燥灶蚤 粤 凿 蕴袁砸藻蚤灶澡藻蚤皂藻则 允 粤袁蕴葬灶糟蚤燥贼贼蚤
砸袁郧怎藻则扎燥灶蚤 酝 耘援 耘枣枣藻糟贼 燥枣 澡蚤早澡 责则藻泽泽怎则藻 澡燥皂燥早藻灶蚤扎葬贼蚤燥灶 燥灶 造葬糟贼蚤糟
葬糟蚤凿 遭葬糟贼藻则蚤葬 责澡葬早藻泽 葬灶凿 责则燥遭蚤燥贼蚤糟 遭葬糟贼藻则蚤葬 责澡葬早藻泽咱允暂 援 陨灶贼藻则灶葬贼蚤燥灶葬造
阅葬蚤则赠 允燥怎则灶葬造袁 圆园园怨袁 员怨渊缘冤院猿猿远 原 猿源员
咱 远 暂 摇 悦澡藻灶 匀袁 允燥藻则早藻则 砸 阅袁 运蚤灶早泽造藻赠 阅 匀袁 匀燥燥增藻则 阅 郧援 孕则藻泽泽怎则藻
蚤灶葬糟贼蚤增葬贼蚤燥灶 噪蚤灶藻贼蚤糟泽 燥枣 责澡葬早藻 造葬皂遭凿葬 糟陨 愿缘苑 咱 允暂 援 云燥燥凿 孕则燥贼藻糟贼袁
圆园园源袁 远苑渊猿冤院缘园缘 原 缘员员
咱 苑 暂 摇 允藻赠葬皂噪燥灶凿葬灶 杂袁 允葬赠葬泽 阅 杂袁 匀燥造造藻赠 砸 粤援 孕怎造泽藻凿 藻造藻糟贼则蚤糟 枣蚤藻造凿
责则燥糟藻泽泽蚤灶早 燥枣 枣燥燥凿泽院 葬 则藻增蚤藻憎咱允暂 援 允燥怎则灶葬造 燥枣 云燥燥凿 孕则燥贼藻糟贼蚤燥灶袁 员怨怨怨袁
远圆渊怨冤院员园愿愿 原 员园怨远
咱 愿 暂 摇 匀怎葬灶早 运袁栽蚤葬灶 匀袁郧葬蚤 蕴袁宰葬灶早 允援 粤 则藻增蚤藻憎 燥枣 噪蚤灶藻贼蚤糟 皂燥凿藻造泽 枣燥则
蚤灶葬糟贼蚤增葬贼蚤灶早 皂蚤糟则燥燥则早葬灶蚤泽皂泽 葬灶凿 藻灶扎赠皂藻泽 遭赠 责怎造泽藻凿 藻造藻糟贼则蚤糟 枣蚤藻造凿
责则燥糟藻泽泽蚤灶早咱允暂 援 允燥怎则灶葬造 燥枣 云燥燥凿 耘灶早蚤灶藻藻则蚤灶早袁 圆园员圆袁 员员员渊圆冤院员怨员 原
圆园苑
咱 怨 暂 摇 在澡葬灶早 匝袁月葬则遭燥泽葬鄄悦葬灶燥增葬泽 郧 灾袁杂憎葬灶泽燥灶 月 郧援 耘灶早蚤灶藻藻则蚤灶早 葬泽责藻糟贼泽
燥枣 责怎造泽藻凿 藻造藻糟贼则蚤糟 枣蚤藻造凿 责葬泽贼藻怎则蚤扎葬贼蚤燥灶 咱 允 暂 援 允燥怎则灶葬造 燥枣 云燥燥凿
耘灶早蚤灶藻藻则蚤灶早袁 员怨怨缘袁 圆缘渊圆冤院圆远员 原 圆愿员
咱员园暂摇 杂澡葬则皂葬 孕袁月则藻皂藻则 孕袁韵藻赠 陨袁耘增藻则藻贼贼 阅 宰援 月葬糟贼藻则蚤葬造 蚤灶葬糟贼蚤增葬贼蚤燥灶 蚤灶
憎澡燥造藻 皂蚤造噪 怎泽蚤灶早 责怎造泽藻凿 藻造藻糟贼则蚤糟 枣蚤藻造凿 责则燥糟藻泽泽蚤灶早援 陨灶贼藻则灶葬贼蚤燥灶葬造 阅葬蚤则赠
允燥怎则灶葬造袁 圆园员猿袁 员园渊缘冤院蚤灶 责则藻泽泽
咱员员暂摇 在早葬造蚤灶 酝 运袁匀燥凿扎蚤糟 阅袁砸藻遭藻则泽藻噪 酝袁运葬灶凿怎泽藻则 酝援 悦燥皂遭蚤灶葬贼蚤燥灶 燥枣
皂蚤糟则燥泽藻糟燥灶凿 葬灶凿 灶葬灶燥泽藻糟燥灶凿 责怎造泽藻凿 藻造藻糟贼则蚤糟 枣蚤藻造凿 贼则藻葬贼皂藻灶贼泽 枣燥则
蚤灶葬糟贼蚤增葬贼蚤燥灶 燥枣 耘泽糟澡藻则蚤糟澡蚤葬 糟燥造蚤 蚤灶 憎葬贼藻则 泽葬皂责造藻泽咱允暂 援 栽澡藻 允燥怎则灶葬造 燥枣
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