全 文 ：核 农 学 报摇 圆园员源袁圆愿渊源冤院园缘远园 耀 园缘远愿
允燥怎则灶葬造 燥枣 晕怎糟造藻葬则 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 杂糟蚤藻灶糟藻泽
收稿日期院圆园员猿鄄园怨鄄圆怨摇 接受日期院圆园员猿鄄园圆鄄圆员
基金项目院国家转基因重大科技专项渊圆园员猿在载园愿园园猿 原 园园缘冤
作者简介院陈佳佳袁女袁主要从事玉米育种与分子生物学研究遥 耘鄄皂葬蚤造院皂葬早蚤糟远圆缘岳 员圆远援 糟燥皂
通讯作者院付凤玲袁女袁教授袁主要从事玉米育种与分子生物学研究遥 耘鄄皂葬蚤造院枣枣造岳 泽蚤糟葬怎援 藻凿怎援 糟灶
李晚忱袁男袁教授袁主要从事玉米遗传育种与生物技术研究遥 耘 原 皂葬蚤造院 葬怎皂凿赠皂泽岳 泽蚤糟葬怎援 藻凿怎援 糟灶
文章编号院员园园园鄄愿缘缘员渊圆园员源冤园源鄄园缘远园鄄园愿
玉米 匀灾粤圆圆基因启动子的克隆与功能验证
陈佳佳摇 牟摇 巍摇 周树峰摇 李晚忱摇 付凤玲
渊四川农业大学玉米研究所袁四川 成都摇 远员员员猿园冤
摘摇 要院利用转基因技术转化利用外源抗性基因袁可提高玉米对非生物逆境的抵抗能力袁改良其在不良环
境下的稳产性遥 但是袁在过去的研究中袁大多采用组成型启动子启动外源抗逆基因过量表达袁虽然可以
改良转基因株系的抗逆性袁但其生长发育受到不同程度抑制袁适应性代价较大遥 用非生物逆境诱导启动
子袁可培育出只在逆境胁迫下表达的转基因抗逆品种袁避免正常条件下抗逆基因过量表达的不良影响遥
本研究以水稻 匀灾粤圆圆 蛋白质的氨基酸序列为探针袁搜索玉米基因组同源 皂砸晕粤 序列 匀灾粤圆圆袁用
孕造葬灶贼悦粤砸耘软件分析并同源克隆其上游启动子序列袁实时荧光定量 孕悦砸验证 匀灾粤圆圆 基因在非生物逆境
胁迫下的差异表达袁构建 匀灾粤圆圆 基因启动子 匀灾粤圆圆泽启动 郧哉杂基因的表达载体袁基因枪法转化玉米愈伤
组织袁郧哉杂染色检测启动活性遥 结果表明袁玉米 匀灾粤圆圆泽启动子长度 员源苑愿 遭责袁含有多种与非生物逆境应
答相关的调控元件遥 匀灾粤圆圆 基因在高温胁迫袁以及脱落酸和乙烯诱导下上调表达遥 用 匀灾粤圆圆泽启动 郧哉杂
基因转化的玉米愈伤组织袁在脱落酸诱导尧甘露醇模拟高渗处理尧低温和高盐胁迫条件下袁郧哉杂 染色均
可显现靛蓝色斑点袁说明 匀灾粤圆圆泽启动子确有非生物逆境启动功能袁进一步验证其启动活性后可运用于
玉米抗逆转基因研究遥
关键词院非生物胁迫曰功能曰诱导表达曰玉米曰启动子
阅韵陨院员园郾 员员愿远怨 辕 躁援 蚤泽泽灶援 员园园鄄愿缘缘员郾 圆园员源郾 园源援 园缘远园
摇 摇 低温尧干旱尧高盐尧高温等非生物逆境严重影响玉
米的正常生长发育袁对生产的危害较大遥 但是袁玉米对
非生物逆境的抗性遗传复杂袁鉴定困难袁常规育种方法
对其改良的进展不大遥 利用转基因技术转化利用外源
抗性基因袁可提高玉米对非生物逆境的抵抗能力袁改良
其在不良环境下的稳产性咱员 原 猿暂 遥 但是袁在过去的植物
抗逆转基因研究中袁大多采用 怎遭蚤择怎蚤贼蚤灶尧悦葬酝灾猿缘杂尧葬糟贼蚤灶
等组成型强启动子启动抗逆基因过量表达遥 虽然转基
因植物的抗逆性得以提高袁但在非胁迫条件下袁外源抗
逆基因的过量表达对植物的正常生理代谢起抑制作
用袁甚至导致转基因植株较野生型植株生长缓慢尧植株
变矮袁付出了较高的适应性代价遥 诱导型启动子只在
逆境胁迫条件下或植物生长的特定阶段启动外源抗逆
基因的表达袁使转基因植物既能抵御逆境胁迫又能在
非胁迫条件下正常生长袁降低外源抗逆基因过量表达
给转基因植物带来的适应性代价咱源 原 员园暂 遥 运葬泽怎早葬 等咱远暂
用组成型启动子 悦葬酝灾猿缘杂 启动 阅砸耘月 基因转化拟南
芥袁虽然改良了对非生物逆境的抗性袁但植株矮化袁生
长畸形袁籽粒数减少遥 而改用诱导型启动子 则凿圆怨粤后袁
在改良抗逆性的同时袁又避免了对植物正常生长的不
良影响遥 另一方面袁外源启动子对基因的启动效能一
般不及内源启动子遥 再葬皂葬早怎糟澡蚤鄄杂澡蚤灶燥扎葬噪蚤 等咱员员暂和 韵灶燥
等咱员圆暂使用水稻非生物逆境诱导启动子 则葬遭员远粤 启动
郧哉杂基因分别转化烟草和水稻袁在水稻中检测到 郧哉杂
基因受外源脱落酸渊粤遭泽糟蚤泽蚤糟 葬糟蚤凿袁 粤月粤冤诱导表达袁而
在烟草却没有检测到 郧哉杂 活性遥 砸葬蚤 等咱员猿暂在水稻上
的研究证明袁有些在非生物逆境诱导下启动基因差异
表达的启动子袁并不能在转基因植物中启动外源抗逆
基因的表达遥 因此袁要充分发挥外源基因在转基因玉
米抗逆种质培育中的作用袁除抗逆基因本身的选择而
园远缘
摇 源 期 玉米 匀灾粤圆圆 基因启动子的克隆与功能验证
外袁选择性能优良的玉米内源非生物逆境诱导启动子袁
既可在逆境胁迫条件下启动外源抗逆基因表达袁改良
玉米的抗逆性袁又可在非逆境条件下避免外源抗逆基
因过量表达引起的不良反应遥 但是袁因为功能基因组
研究相对滞后袁关于玉米非生物逆境诱导启动子克隆
及功能鉴定方面的报道不多遥 月怎糟澡葬灶葬灶 等咱员源暂克隆玉
米 蕴耘粤家族 则葬遭员苑 基因的启动子袁证实在外源 粤月粤诱
导下差异表达遥 悦葬燥 等咱员缘暂克隆在种子成熟过程中起
调控作用的玉米转录因子基因 灾责员 的启动子袁其序列
中包含脱落酸应答顺式作用核心元件 粤月砸耘袁转基因
实验证明可在干旱胁迫下启动 郧哉杂 和 郧云孕 基因在玉
米营养组织韧皮部细胞中的表达遥 宰怎等咱员远暂克隆玉米
磷脂酰乙醇胺 晕 原甲基转移酶基因 在皂孕耘粤酝栽员袁发现
其启动子区域包含逆境应答顺式作用元件袁受高盐和
高温胁迫启动下游基因的表达遥 匀灾粤圆圆 基因最先发现
于大麦袁是一个受低温尧干旱等非生物逆境胁迫诱导表
达袁参与 粤月粤信号转导途径的基因袁在真核生物中具
有广泛的同源性咱员苑 原 圆园暂 遥 针对玉米非生物逆境抗性育
种困难袁组成型启动子启动外源抗逆基因转化后可能
影响玉米正常生长发育袁而玉米及单子叶植物非生物
逆境应答启动子开发研究不足的问题袁本研究以水稻
匀灾粤圆圆 蛋白质的氨基酸序列为探针袁查找玉米基因组
同源序列 匀灾粤圆圆袁用 孕造葬灶贼悦粤砸耘 软件分析并同源克隆
其上游启动子序列 匀灾粤圆圆泽袁经实时定量 孕悦砸 验证
匀灾粤圆圆基因在非生物逆境胁迫下的差异表达后袁构建
匀灾粤圆圆泽启动 郧哉杂 基因的表达载体袁基因枪法转化玉
米胚型愈伤组织袁组织化学染色法检测其启动活性袁以
期为玉米抗逆转基因玉米研究提供更好的选择遥
员摇 材料与方法
员郾 员摇 玉米匀灾粤圆圆 基因启动子序列生物信息学预测与
同源克隆
以水稻 匀灾粤圆圆 蛋白质的氨基酸编码序列
渊粤粤孕缘圆源员愿郾 圆冤为探针咱圆员暂 袁用 晕悦月陨渊澡贼贼责院 辕 辕 憎憎憎援 灶糟遭蚤援
灶造皂援 灶蚤澡援 早燥增冤网站的在线软件 贼遭造葬泽贼灶 搜索玉米中的同
源蛋白质 皂砸晕粤 序列袁然后与玉米野月苑猿冶基因组序列
比对渊月蕴粤杂栽冤查找其同源编码序列袁再用启动子分析
软件 孕造葬灶贼悦粤砸耘渊澡贼贼责院 辕 辕 遭蚤燥蚤灶枣燥则皂葬贼蚤糟泽援 责泽遭援 怎早藻灶贼援 遭藻 辕
憎藻遭贼燥燥造泽 辕 责造葬灶贼糟葬则藻冤分析其编码序列上游 员郾 缘 噪遭 左右
序列的启动子特征袁特别是 原 苑缘 遭责的 悦粤粤栽框和 原猿园
遭责的 栽粤栽粤框袁确定转录起始位点遥
根据上述生物信息学分析结果袁依据 孕悦砸引物设
计原则袁用 孕则蚤皂藻则缘郾 园 设计特异 孕悦砸 引物 渊 缘忆 原
粤粤郧悦栽栽粤悦悦粤栽粤栽郧栽栽郧粤悦郧栽郧栽悦郧悦悦悦郧栽粤 原 猿忆 辕 缘忆
原 郧郧粤栽悦悦悦栽悦栽悦郧悦栽悦栽郧悦栽悦栽悦悦栽悦悦悦悦栽郧栽 原 猿忆冤袁
并在其 缘忆端引入载体构建所需限制性酶 匀蚤灶凿芋 辕
月葬皂匀陨的识别位点 渊下划线部分冤袁以玉米自交系
野月苑猿冶基因组 阅晕粤 为模板袁用高保真 阅晕粤 聚合酶
孕则蚤皂藻杂栽粤砸 匀杂 阅晕粤 孕燥造赠皂藻则葬泽藻 渊 栽葬运葬砸葬袁日本冤扩增
匀灾粤圆圆 基因的启动子序列袁琼脂糖凝胶电泳分离后袁回
收纯化 员缘园园 遭责左右目的片段袁匀蚤灶凿芋 辕 月葬皂匀陨 双酶切
后再次分离尧回收和纯化遥
员郾 圆摇 玉米 匀灾粤圆圆 基因在非生物胁迫条件下的差异表
达
取自交系野载员苑愿冶二叶期的幼苗水培至四叶期袁分
别用 粤月粤渊员园园滋皂燥造窑蕴 原员 冤尧乙烯渊员园园滋皂燥造窑蕴 原员乙烯
利冤尧低温渊源益冤和高温渊源圆益冤处理 圆源 澡袁员远豫聚乙二
醇 原远园园园渊责燥造赠藻贼澡赠造藻灶藻 早造赠糟燥造 原 远园园园袁 孕耘郧 原 远园园园冤模
拟 原 园郾 缘 酝责葬 渗透势干旱咱圆圆暂和高盐渊圆园园皂皂燥造窑蕴 原员
晕葬悦造冤处理 苑圆 澡袁猿 次重复遥 在 粤月粤尧乙烯尧低温和高温
处理的 园尧圆尧远尧员圆尧圆源 澡 和 孕耘郧 原 远园园园 模拟干旱尧高盐
处理的 园尧员圆尧圆源尧源愿 和 苑圆 澡 取样袁用 栽则蚤扎燥造 试剂盒
渊栽葬运葬砸葬袁日本冤提取总 砸晕粤 提取袁再用 孕则蚤皂藻杂糟则蚤责贼栽酝
试剂盒渊栽葬运葬砸葬袁日本冤反转录成 糟阅晕粤袁稀释 缘 倍后作
实时定量 孕悦砸渊择怎葬灶贼蚤贼葬贼蚤增藻 则藻葬造鄄贼蚤皂藻 孕悦砸袁 择砸栽鄄孕悦砸冤
模板遥
用定量 孕悦砸 引物设计软件 月藻葬糟燥灶 阅藻泽蚤早灶藻则 苑郾 园
渊澡贼贼责院 辕 辕 憎憎憎援 责则藻皂蚤藻则遭蚤燥泽燥枣贼援 糟燥皂冤设计特异引物渊缘忆 原
悦悦栽粤悦郧粤粤栽郧悦栽粤悦粤粤郧粤 原 猿忆 辕 缘忆 原 粤粤栽悦悦粤粤栽粤悦栽鄄
郧粤悦粤悦悦粤粤 原猿忆冤袁生物工程公司渊上海袁中国冤合成袁
并以玉米 员愿杂 基因作为内参基因袁员园滋蕴 反应体系包
括院杂泽燥云葬泽贼 耘增葬郧则藻藻灶 泽怎责藻则皂蚤曾渊月蚤燥鄄砸葬凿袁美国冤缘郾 园滋蕴尧
员园郾 园滋皂燥造 辕 蕴 上 下 游 引 物 各 园郾 缘滋蕴 和 稀 释 糟阅鄄
晕粤员郾 园滋蕴遥 在 悦云载怨远 定量 孕悦砸 仪 渊 月蚤燥鄄砸葬凿袁 美国冤
上袁温度循环为院怨愿益预变性 圆 皂蚤灶曰怨愿益变性 圆 泽袁缘园 耀
远缘益最适退火延伸 员园 泽袁循环 源源 次后袁从 远缘益开始袁以
每步 园郾 缘益的温度梯度升高至 怨缘益袁每步温度保持
园郾 园员 泽袁绘制熔解曲线遥 采用双标准曲线法对 匀灾粤圆圆
基因的表达水平进行相对定量测定袁计算不同处理时
间 匀灾粤圆圆 基因表达量相对于 园澡对照的倍数遥
员郾 猿摇 匀灾粤圆圆泽启动子启动 郧哉杂基因表达载体构建
用 匀蚤灶凿 芋 辕 月葬皂匀陨 双酶切植物瞬时表达载体
责月陨圆圆员 原 哉遭蚤鄄郧哉杂咱圆猿暂 袁分离尧回收和纯化去除 哉遭蚤 启动
子序列的目的片段后袁加入上一步骤回收纯化的
匀灾粤圆圆 基因启动子 匀灾粤圆圆泽 片段袁用 栽源 阅晕粤 连接酶
渊栽葬运葬砸葬袁日本冤连接袁构建成 匀灾粤圆圆泽 启动 郧哉杂 基因
的表达载体 责月陨圆圆员 原 匀灾粤圆圆泽鄄郧哉杂渊图 员冤袁热激转化大
员远缘
核摇 农摇 学摇 报 圆愿 卷
肠杆菌 阅匀缘琢菌株感受态细胞袁氨苄青霉素抗性培养
基筛选阳性重组子袁扩大培养后经菌液 孕悦砸 和 匀蚤灶凿
芋 辕 月葬皂匀陨双酶切检测袁送生物工程公司渊上海袁中国冤
测序验证遥
图 员摇 玉米 匀灾粤圆圆 基因启动子启动 郧哉杂
基因的表达载体 责月陨圆圆员 原匀灾粤圆圆泽郧哉杂
云蚤早援 员摇 耘曾责则藻泽泽蚤燥灶 增藻糟贼燥则 责月陨圆圆员 原 匀灾粤圆圆泽郧哉杂 枣燥则
郧哉杂 早藻灶藻 怎灶凿藻则 贼澡藻 糟燥灶贼则燥造 燥枣 皂葬蚤扎藻 匀灾粤圆圆 早藻灶藻 责则燥皂燥贼藻则
员郾 源摇 玉米愈伤组织的基因枪法转化
参照 云怎等咱圆源暂介绍的方法袁取玉米优良自交系野齐
猿员怨冶授粉 员圆 凿左右尧长 员郾 缘 耀 圆郾 园 皂皂 的未成熟胚袁接
种于改良 晕远 诱导培养基袁圆苑益黑暗培养并及时除去
不定芽诱导愈伤组织袁按 粤则皂泽贼则燥灶早 等咱圆缘暂提出的鉴别
标准挑选胚性愈伤组织袁转接改良 晕远 继代培养基袁
圆苑益暗培养继代增殖遥
取浓度 员郾 园滋早窑滋蕴 原员的瞬时表达载体 责月陨圆圆员 原
匀灾粤圆圆泽鄄郧哉杂和单子叶植物组成型启动子 怎遭蚤择怎蚤贼蚤灶 启
动荧光素酶基因 蕴哉悦的表达载体 责哉遭蚤鄄蕴哉杂渊作为内参
对照平衡基因枪转化率冤质粒 阅晕粤 各 猿滋蕴袁加 圆园滋蕴
园郾 缘皂燥造窑蕴 原员亚精胺和 缘园滋蕴 圆郾 缘皂燥造窑蕴 原员 悦葬悦造圆 沉淀到
猿皂早渊远园皂早窑皂蕴 原员袁金粉窑甘油冤用乙醇和无菌蒸馏水反
复洗涤到 渍远园 滋皂 金粉上袁涡旋震荡并用色谱级
渊匀孕蕴悦级冤员源园滋蕴 苑园豫 乙醇洗涤后袁加入 远园滋蕴 无水
乙醇袁涡旋震荡 员 皂蚤灶 并超声波处理 猿 原 缘 泽 使金粉分
散悬浮遥 在 阅怎孕燥灶贼 孕阅杂员园园园 辕 匀藻 型基因枪渊月蚤燥鄄砸葬凿袁
美国冤上袁以 员员园园 责泽蚤系统压力和 圆愿 吋汞柱真空度袁每
枪 员郾 园滋早窑皂早 原员 渊质粒 辕金粉冤袁转化在 晕远 高渗培养基
上预培养 源 澡的玉米胚性愈伤组织各 员园 皿袁每皿 员园园
块愈伤组织遥
员郾 缘摇 匀灾粤圆圆泽启动 郧哉杂基因瞬时表达检测
将转化后的玉米胚型愈伤组织转移到 晕远 继代培
养基上袁圆苑益黑暗培养 圆 凿以后袁选大小形状基本一致
的瞬时表达载体 责月陨圆圆员 原 匀灾粤圆圆泽鄄郧哉杂 和内参对照质
粒 责哉遭蚤蕴哉悦转化的愈伤组织各分为 员缘 皿袁每皿 缘园 块
愈伤组织袁分别实施 愿豫 甘露醇模拟高渗处理尧
圆园园皂皂燥造窑蕴 原员 晕葬悦造 高盐处理尧员园园滋皂燥造窑蕴 原员 粤月粤 诱导
和 源益低温处理 圆源澡袁以及空白对照各 猿 皿渊生物学重
复冤遥 每皿取 缘 块愈伤组织袁按照 允藻枣枣藻则泽燥灶 等咱圆远暂介绍
的方法配制 郧哉杂 组织染色液染色袁在解剖显微镜下观
察照像遥
圆摇 结果与分析
圆郾 员摇 玉米 匀灾粤圆圆 基因启动子序列
图 圆摇 玉米 匀灾粤圆圆 基因启动子扩增片段
云蚤早援 圆摇 粤皂责造蚤枣蚤藻凿 枣则葬早皂藻灶贼 燥枣 匀灾粤圆圆
早藻灶藻 责则燥皂燥贼藻则 蚤灶 皂葬蚤扎藻
以 水 稻 匀灾粤圆圆 蛋 白 质 的 氨 基 酸 序 列
渊粤粤孕缘圆源员愿郾 圆冤为探针咱员苑暂 袁在 晕悦月陨数据库中搜索到玉
米同源蛋白 则藻糟藻责贼燥则 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶鄄藻灶澡葬灶糟蚤灶早 责则燥贼藻蚤灶 猿
渊粤悦郧猿圆员园愿冤袁与之相应的 皂砸晕粤 序列注册号为 晕酝赃
园园员员源猿缘怨缘遥 该序列与玉米野月苑猿冶基因组 粤郧孕增员 版本
的第 怨 染色体 悦澡则怨院 员猿愿园源圆圆愿苑 原 员猿愿园源缘猿猿圆 碱基的同
源性为 员园园豫 遥 用 孕造葬灶贼悦粤砸耘软件对在其编码序列上
游 员缘园园 遭责渊悦澡则怨院员猿愿园源园苑愿苑 原 员猿愿园源圆圆愿远冤所做的启动
子序列性分析发现袁除 原 苑缘 遭责 的 悦粤粤栽 框和 原 猿园 遭责
的 栽粤栽粤 框外袁还存在厌氧和热激应答元件尧酝再月 结
合位点袁以及 粤月粤尧赤霉素尧水杨酸和茉莉酸应答元件
等袁与非生物逆境应答相关的调控元件遥 此外袁还有一
些组织特异表达调控元件渊表 员冤遥 根据生物信息学学
分析结果的特异 孕悦砸 引物袁以玉米自交系野月苑猿冶基因
圆远缘
摇 源 期 玉米 匀灾粤圆圆 基因启动子的克隆与功能验证
摇 摇 摇 摇 表 员摇 玉米 匀灾粤圆圆 基因启动子的非生物逆境胁迫应答元件
栽葬遭造藻 员摇 粤遭蚤燥贼蚤糟 泽贼则藻泽泽鄄则藻泽责燥灶泽蚤增藻 藻造藻皂藻灶贼泽 燥枣 匀灾粤圆圆 早藻灶藻 责则燥皂燥贼藻则 蚤灶 皂葬蚤扎藻
元件
耘造藻皂藻灶贼
物种
杂责藻糟蚤藻泽
核心序列
悦燥则藻 泽藻择怎藻灶糟藻
定位摇 摇
蕴燥糟葬贼蚤燥灶摇 摇
非生物胁迫应答
粤遭蚤燥贼蚤糟 泽贼则藻泽泽 则藻泽责燥灶泽藻
燥圆 玉米 酝葬蚤扎藻 郧渊栽 辕 粤冤栽郧粤悦渊郧 辕 粤冤栽郧粤 原 员源怨圆 耀 原 员源愿猿 遭责袁 原 员员怨远 耀 原 员员愿缘 遭责 醇溶蛋白代谢调控元件
悦郧栽悦粤 大麦 月葬则造藻赠 悦郧栽悦粤 原 员源怨园 耀 原 员源愿远 遭责袁 原 缘源园 耀 原 缘猿远 遭责袁
原 怨苑园 耀 原 怨远远 遭责
茉莉酸应答元件
杂噪灶 原 员 水稻 砸蚤糟藻 郧栽悦粤栽 原 员员怨园 耀 原 员员愿远 遭责 胚乳特异表达调控元件
粤月砸耘 大麦 月葬则造藻赠 悦郧栽粤悦郧栽郧悦粤 原 员园源源 耀 原 员园猿缘 遭责 粤月粤应答元件
砸再 向日葵
匀藻造蚤葬灶贼澡怎泽 葬灶灶怎怎泽
悦粤栽郧悦粤栽郧 原 怨愿猿 耀 原 怨苑远 遭责 种子特异表达调控元件
悦悦郧栽悦悦 拟南芥
粤则葬遭蚤凿燥责泽蚤泽
悦悦郧栽悦悦 原 愿怨远 耀 原 愿怨员 遭责 分生组织特异表达调控元件
粤月砸耘 拟南芥
粤则葬遭蚤凿燥责泽蚤泽
渊栽 辕 悦冤粤悦郧栽郧 原 愿苑缘 耀 原 愿苑园 遭责袁 原 员园源圆 耀 原 员园猿苑 遭责袁
原 猿缘愿 耀 原 猿缘猿 遭责
粤月粤应答元件
郧粤砸耘 甘蓝
月则葬泽泽蚤糟葬 燥造藻则葬糟藻葬
栽悦栽郧栽栽郧 原 苑远缘 耀 原 苑远园 遭责 赤霉素应答元件
悦粤栽 拟南芥
粤则葬遭蚤凿燥责泽蚤泽
郧悦悦粤悦栽 原 远圆缘 耀 原 远圆园 遭责袁 原 缘远苑 耀 原 缘远圆 遭责 分生组织特异表达调控元件
栽悦粤 烟草
栽燥遭葬糟糟燥
悦悦粤栽悦栽栽栽栽栽 原 源猿远 耀 原 源圆苑 遭责 水杨酸应答元件
匀杂耘 甘蓝
月则葬泽泽蚤糟葬 燥造藻则葬糟藻葬
粤粤粤粤粤粤栽栽栽悦 原 猿猿愿 耀 原 猿圆怨 遭责 热激应答元件
粤砸耘 玉米 酝葬蚤泽藻 栽郧郧栽栽栽 原 猿圆缘 耀 原 猿圆园 遭责 厌氧应答元件
酝月杂 玉米 酝葬蚤扎藻 悦郧郧栽悦粤 原 圆苑园 耀 原 圆远缘 遭责 酝再月结合位点
悦悦粤粤栽 大麦 月葬则造藻赠 悦粤粤悦郧郧 原 圆远猿 耀 原 圆缘愿 遭责 酝再月结合位点
粤栽郧悦粤粤粤栽 水稻 砸蚤糟藻 粤栽粤悦粤粤粤栽 原 圆圆猿 耀 原 圆员远 遭责 与 栽郧粤郧栽悦粤 皂燥贼蚤枣相关的作用元件
组 阅晕粤为模板袁扩增到的片段约长 员缘园园 遭责渊图 圆冤袁测
序结果为 员源苑愿 遭责渊图 猿冤遥
圆郾 圆摇 玉米匀灾粤圆圆 基因在非生物胁迫条件下差异表达
择砸栽鄄孕悦砸分析显示袁玉米 匀灾粤圆圆 基因在模拟干
旱尧低温和高盐胁迫下均大幅下调表达渊图 源 耀 远冤袁而
在高温胁迫尧粤月粤和乙烯诱下导则表现不同程度的上
调表达渊图 苑 耀 怨冤遥 特别是 粤月粤 诱导处理 圆 澡 的大幅
上调表达渊图 苑冤袁与高温处理 远 澡 开始的上调表达相
应渊图 愿冤袁可能是玉米 粤月粤信号转导途径对高温胁迫
的迅速应答遥 但是袁随着高温胁迫及诱导条件的持续袁
体内整体代谢水平下降袁匀灾粤圆圆 基因的上调表达又有
回落遥 结合上述启动子序列分析推测袁玉米 匀灾粤圆圆 基
因的启动子很可能具有非生物逆境诱导启动活性遥
圆郾 猿摇 匀灾粤圆圆 基因启动子启动 郧哉杂 基因在胁迫条件
下瞬时表达
将上述 匀灾粤圆圆 基因启动子 匀灾粤圆圆泽扩增片段插入
责月陨圆圆员 载体后袁构建成 匀灾粤圆圆泽 启动 郧哉杂 基因的表达
载体 责月陨圆圆员 原 匀灾粤圆圆泽鄄郧哉杂袁经酶切和序列测定鉴定
后袁用以转化玉米愈伤组织遥 抗性培养基筛选后袁在
员园园滋皂燥造窑蕴 原员 粤月粤诱导尧愿豫甘露醇模拟高渗处理尧源益
低温处理和 圆园园皂皂燥造窑蕴 原员 晕葬悦造 高盐胁迫条件下袁郧哉杂
染色均可显现靛蓝色斑点渊图 员园冤袁而空白对照没有显
现袁说明 匀灾粤圆圆 基因启动子 匀灾粤圆圆泽 确有非生物逆境
启动功能遥
猿摇 讨论
用 孕造葬灶贼悦砸粤耘所做的启动子序列分析显示袁玉米
匀灾粤圆圆 基因启动子 匀灾粤圆圆泽 中含有多种不同的非生物
逆境胁迫应答元件渊表 员袁图 员冤遥 其中袁匀杂耘尧酝月杂 和
悦悦粤粤栽元件与植物对高温尧干旱尧高盐等逆境的应答
有关袁可能导致在热处理下相对表达量增加遥 值得注
猿远缘
核摇 农摇 学摇 报 圆愿 卷
注院用阴白显示的碱基与模式植物的同源序列相比有突变袁但 孕造葬灶贼悦粤砸耘软件认可遥
晕燥贼藻院 栽澡藻 憎澡蚤贼藻 造藻贼贼藻则泽 憎蚤贼澡 泽澡葬凿藻 泽澡燥憎 贼澡藻 皂怎贼葬贼藻凿 遭葬泽藻泽 糟燥皂责葬则蚤灶早 贼燥 贼澡藻 澡燥皂燥造燥早燥怎泽 泽藻择怎藻灶糟藻泽 燥枣 贼澡藻 皂燥凿藻
泽责藻糟蚤藻泽袁 遭怎贼 贼澡藻赠 憎藻则藻 则藻糟燥早灶蚤扎藻凿 遭赠 贼澡藻 孕造葬灶贼悦粤砸耘 泽燥枣贼憎葬则藻援
图 猿摇 玉米 匀灾粤圆圆 基因启动子序列及非生物逆境胁迫应答元件
云蚤早援 猿摇 杂藻择怎藻灶糟藻 燥枣 匀灾粤圆圆 早藻灶藻 责则燥皂燥贼藻则 葬灶凿 则藻泽责燥灶泽蚤增藻 藻造藻皂藻灶贼泽 贼燥 葬遭蚤燥贼蚤糟 泽贼则藻泽泽藻泽 蚤灶 皂葬蚤扎藻
意的是袁在玉米 匀灾粤圆圆泽启动子序列中袁含有多个分别
与大麦和拟南芥同源的 粤月粤 应答元件袁说明 匀灾粤圆圆泽
启动子是 粤月粤信号转导途径中一个重要的调节部位遥
然而袁在 择砸栽鄄孕悦砸 检测中袁玉米 匀灾粤圆圆 基因在模拟干
源远缘
摇 源 期 玉米 匀灾粤圆圆 基因启动子的克隆与功能验证
图 源摇 圆园豫孕耘郧模拟干旱胁迫下 匀灾粤圆圆
基因的相对表达量
云蚤早援 源摇 砸藻造葬贼蚤增藻 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 枣燥造凿 燥枣 匀灾粤圆圆
早藻灶藻 怎灶凿藻则 泽蚤皂怎造葬贼藻凿 凿则燥怎早澡贼 泽贼则藻泽泽 燥枣 圆园豫 孕耘郧
图 缘摇 源益低温胁迫下 匀灾粤圆圆
基因的相对表达量
云蚤早援 缘摇 砸藻造葬贼蚤增藻 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 枣燥造凿 燥枣 匀灾粤圆圆
早藻灶藻 怎灶凿藻则 造燥憎 贼藻皂责藻则葬贼怎则藻 泽贼则藻泽泽 燥枣 源益
图 远摇 高盐胁迫下 匀灾粤圆圆
基因的相对表达量
云蚤早援 远摇 砸藻造葬贼蚤增藻 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 枣燥造凿 燥枣 匀灾粤圆圆
早藻灶藻 怎灶凿藻则 澡蚤早澡 泽葬造贼 泽贼则藻泽泽
图 苑摇 源圆益高温胁迫下 匀灾粤圆圆
基因的相对表达量
云蚤早援 苑摇 砸藻造葬贼蚤增藻 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 枣燥造凿 燥枣 匀灾粤圆圆
早藻灶藻 怎灶凿藻则 澡蚤早澡 贼藻皂责藻则葬贼怎则藻 泽贼则藻泽泽 燥枣 源圆益
图 愿摇 粤月粤诱导下 匀灾粤圆圆
基因的相对表达量
云蚤早援 愿摇 砸藻造葬贼蚤增藻 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 枣燥造凿 燥枣
匀灾粤圆圆 早藻灶藻 蚤灶凿怎糟藻凿 遭赠 粤月粤
图 怨摇 乙烯诱导下 匀灾粤圆圆
基因的相对表达量
云蚤早援 怨摇 砸藻造葬贼蚤增藻 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 枣燥造凿 燥枣
匀灾粤圆圆 早藻灶藻 蚤灶凿怎糟藻凿 遭赠 藻贼澡赠造藻灶藻
缘远缘
核摇 农摇 学摇 报 圆愿 卷
注院 葬院 员园园滋皂燥造窑蕴 原员 粤月粤曰遭院愿豫甘露醇曰糟院源益曰凿院圆园园皂皂燥造窑蕴 原员 晕葬悦造曰藻院空白对照遥
晕燥贼藻院 葬院 员园园滋皂燥造窑蕴 原 员 粤月粤曰 遭院 愿豫 皂葬灶灶蚤贼燥造曰 糟院 源益曰 凿院 圆园园皂皂燥造窑蕴 原员 晕葬悦造曰 藻院 遭造葬灶噪 糟燥灶贼则燥造援
图 员园摇 责月陨圆圆员 原匀灾粤圆圆泽鄄郧哉杂转化玉米愈伤组织 郧哉杂的染色
云蚤早援 员园摇 郧哉杂 泽贼葬蚤灶蚤灶早 燥枣 皂葬蚤扎藻 糟葬造造怎泽 贼则葬灶泽枣燥则皂藻凿 遭赠 责月陨圆圆员 原匀灾粤圆圆泽鄄郧哉杂
旱尧低温和高盐胁迫下大幅下调表达渊图 源 耀 远冤袁与大
麦 匀灾粤圆圆 基因在干旱尧低温胁迫下上调表达的情况相
悖咱员猿 原 员远暂 遥 但是袁玉米 匀灾粤圆圆 基因在 粤月粤诱导处理 圆 澡
的大幅上调表达渊图 苑冤袁与高温处理 远 澡 开始的上调
表达相应渊图 愿冤袁可能是玉米 粤月粤信号转导途径对高
温胁迫的迅速应答遥 这可能是因为玉米与大麦起源地
的生态环境不同袁同样与非生物胁迫相关的 粤月粤信号
转导途径袁所需应答的非生物胁迫条件不同遥 玉米起
源于墨西哥南部热带地区袁面临的主要非生物逆境是
高温胁迫遥
本研究从玉米 匀灾粤圆圆 基因启动子 匀灾粤圆圆泽 的序列
分析袁匀灾粤圆圆 基因在高温尧高盐尧干旱尧低温胁迫和
粤月粤尧乙烯诱导下的差异表达袁以及 匀灾粤圆圆泽 启动 郧哉杂
基因转化玉米愈伤组织在非生物逆境胁迫条件下的瞬
时表达几个方面袁均证明玉米 匀灾粤圆圆 基因启动子
匀灾粤圆圆泽响应多种非生物逆境胁迫袁通过 粤月粤尧茉莉酸尧
水杨酸等信号转导途径袁启动下游基因上调或下调表
达袁进一步验证后可用于玉米抗逆转基因研究遥
源摇 结论
玉米 匀灾粤圆圆 基因启动子 匀灾粤圆圆泽长 员源苑愿 遭责袁含有
多种非生物逆境胁迫应答元件袁特别对高温胁迫的响
应明显袁进一步验证后可运用于玉米抗逆转基因研究遥
参考文献院
咱 员 暂 摇 月则怎糟藻 宰 月袁 耘凿皂藻葬凿藻泽 郧 韵袁 月葬则噪藻则 栽 悦援 酝燥造藻糟怎造葬则 葬灶凿
责澡赠泽蚤燥造燥早蚤糟葬造 葬责责则燥葬糟澡藻泽 贼燥 皂葬蚤扎藻 蚤皂责则燥增藻皂藻灶贼 枣燥则 凿则燥怎早澡贼 贼燥造藻则葬灶糟藻
咱允暂 援 允燥怎则灶葬造 燥枣 耘曾责藻则蚤皂藻灶贼葬造 月燥贼葬灶赠袁 圆园园圆袁 缘猿渊猿远远冤院员猿 原 圆缘
咱 圆 暂 摇 杂澡怎躁葬 酝 晕袁 粤造蚤 宰袁 陨择遭葬造 粤袁 粤造蚤 陨袁 酝怎灶蚤则 陨袁 粤澡皂葬凿 阅袁 陨灶葬皂怎造造葬澡袁
杂澡葬澡藻藻灶泽澡葬澡袁 粤澡皂葬凿 郧袁 运澡葬灶 酝 粤袁 杂憎葬贼蚤 在 粤援 酝葬蚤扎藻 遭则藻藻凿蚤灶早 枣燥则
皂葬则早蚤灶葬造 造葬灶凿泽院 孕澡赠泽蚤燥造燥早蚤糟葬造 葬灶凿 皂燥造藻糟怎造葬则 葬责责则燥葬糟澡 贼燥 凿藻糟蚤责澡藻则
则藻泽责燥灶泽藻 葬灶凿 泽藻造藻糟贼蚤燥灶 燥枣 皂葬蚤扎藻 则藻糟燥皂遭蚤灶葬灶贼 蚤灶遭则藻凿 造蚤灶藻泽 渊 砸陨蕴泽冤
怎灶凿藻则 憎葬贼藻则 凿藻枣蚤糟蚤贼 葬贼 藻葬则造赠 早则燥憎贼澡 泽贼葬早藻 咱 允暂 援 粤枣则蚤糟葬灶 允燥怎则灶葬造 燥枣
月蚤燥贼藻糟澡灶燥造燥早赠袁 圆园员员袁 员园渊员愿冤院 猿缘圆员 原 猿缘圆苑
咱 猿 暂摇 郧蚤造皂燥怎则 杂 允袁 杂藻遭燥造贼 粤 酝袁 杂葬造葬扎葬则 酝 孕袁 耘增藻则葬则凿 允 阅袁 栽澡燥皂葬泽澡燥憎 酝
云援 韵增藻则藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 燥枣 粤则葬遭蚤凿燥责泽蚤泽 悦月云猿 贼则葬灶泽糟则蚤责贼蚤燥灶葬造 葬糟贼蚤增葬贼燥则
皂蚤皂蚤糟泽 皂怎造贼蚤责造藻 遭蚤燥糟澡藻皂蚤糟葬造 糟澡葬灶早藻泽 葬泽泽燥糟蚤葬贼藻凿 憎蚤贼澡 糟燥造凿
葬糟糟造蚤皂葬贼蚤燥灶 咱允暂 援 孕造葬灶贼 孕澡赠泽蚤燥造燥早赠袁 圆园园圆袁 员圆源渊源冤院员愿缘源 原 员愿远缘
咱 源 暂摇 栽葬燥 阅袁 酝怎 再袁 云怎 云 蕴袁 蕴蚤 宰 悦援 栽则葬灶泽枣燥则皂葬贼蚤燥灶 燥枣 皂葬蚤扎藻 憎蚤贼澡
贼则藻澡葬造燥泽藻 则赠灶贼澡葬泽藻 早藻灶藻 糟造燥灶藻凿 枣则燥皂 杂葬糟糟澡葬则燥皂赠糟藻泽 糟藻则藻增蚤泽蚤葬藻 咱 允暂 援
月蚤燥贼藻糟澡灶燥造燥早赠袁 圆园园愿袁 苑渊圆冤院圆缘愿 原 圆远缘
咱 缘 暂摇 运葬则蚤皂 杂袁 粤则燥灶泽泽燥灶 匀袁 耘则蚤糟泽燥灶 匀袁 孕蚤则澡燥灶藻灶 酝袁 蕴藻赠皂葬灶 月袁 宰藻造蚤灶
月袁 酝葬灶贼赠造葬 耘袁 孕葬造增葬 耘 栽袁 灾葬灶 阅蚤躁糟噪 孕袁 匀燥造皂泽贼则燥皂 运 韵援 陨皂责则燥增藻凿
凿则燥怎早澡贼 贼燥造藻则葬灶糟藻 憎蚤贼澡燥怎贼 怎灶凿藻泽蚤则藻凿 泽蚤凿藻 藻枣枣藻糟贼泽 蚤灶 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 责造葬灶贼泽
责则燥凿怎糟蚤灶早 贼则藻澡葬造燥泽藻 咱 允暂 援 孕造葬灶贼 酝燥造藻糟怎造葬则 月蚤燥造燥早赠袁 圆园园苑袁 远源渊源冤院
猿苑员 原 猿愿远
咱 远 暂摇 运葬泽怎早葬 酝袁 蕴蚤怎 匝袁 酝蚤怎则葬 杂袁 再葬皂葬早怎糟澡蚤鄄杂澡蚤灶燥扎葬噪蚤 运袁 杂澡蚤灶燥扎葬噪蚤 运援
陨皂责则燥增蚤灶早 责造葬灶贼 凿则燥怎早澡贼袁 泽葬造贼袁 葬灶凿 枣则藻藻扎蚤灶早 贼燥造藻则葬灶糟藻 遭赠 早藻灶藻 贼则葬灶泽枣藻则
燥枣 葬 泽蚤灶早造藻 泽贼则藻泽泽鄄蚤灶凿怎糟蚤遭造藻 贼则葬灶泽糟则蚤责贼蚤燥灶 枣葬糟贼燥则 咱 允 暂 援 晕葬贼怎则藻
月蚤燥贼藻糟澡灶燥造燥早赠袁 员怨怨怨袁 员苑渊猿冤院圆愿苑 原 圆怨员
咱 苑 暂摇 万小荣袁 莫爱琼袁刘帅袁梁建华袁李玲袁余土元袁郑奕雄援 粤油 苑
号花生 粤澡晕悦耘阅员 基因启动子克隆及其活性分析咱 允暂 援 核农学
报袁 圆园员员袁 圆缘渊源冤院远怨圆 原 远怨怨
咱 愿 暂摇 在澡葬灶早 载 宰袁 蕴蚤 悦袁 允蚤葬灶早 匝 栽袁 宰藻蚤 再袁 再葬燥 匀袁 悦澡藻灶 匀袁 宰怎 匝援
悦造燥灶蚤灶早 葬灶凿 糟澡葬则葬糟贼藻则蚤扎葬贼蚤燥灶 燥枣 葬 糟燥造凿 蚤灶凿怎糟蚤遭造藻 孕葬造 责则燥皂燥贼藻则 枣则燥皂
云葬早燥责赠则怎皂 贼葬贼葬则蚤糟怎皂 咱 允暂 援 悦藻灶贼则葬造 耘怎则燥责藻葬灶 允燥怎则灶葬造 燥枣 月蚤燥造燥早赠袁
圆园员源袁 怨渊猿冤院圆怨园 原 圆怨苑
咱 怨 暂摇 砸葬增蚤噪怎皂葬则 郧袁 酝葬灶蚤皂葬则葬灶 孕袁 灾燥造藻贼蚤 杂 孕袁 杂怎遭则葬澡皂葬灶赠葬皂 阅袁
杂怎灶凿葬则葬皂 砸 酝袁 月葬灶泽葬造 运 悦袁 灾蚤则葬噪贼葬皂葬贼澡 月 悦袁 月葬造葬糟澡葬灶凿则葬灶 杂 酝援
杂贼则藻泽泽鄄蚤灶凿怎糟蚤遭造藻 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 燥枣 粤贼阅砸耘月员粤 贼则葬灶泽糟则蚤责贼蚤燥灶 枣葬糟贼燥则 早则藻葬贼造赠
蚤皂责则燥增藻泽 凿则燥怎早澡贼 泽贼则藻泽泽 贼燥造藻则葬灶糟藻 蚤灶 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 蚤灶凿蚤糟葬 则蚤糟藻 咱 允暂 援
栽则葬灶泽早藻灶蚤糟 砸藻泽藻葬则糟澡袁 圆园员源袁 凿燥蚤院员园郾 员园园苑 辕 泽员员圆源愿 原 园员猿 原 怨苑苑远 原 远
咱员园暂摇 晕葬噪葬泽澡蚤皂葬 运袁 允葬灶 粤袁 栽燥凿葬噪葬 阅袁 酝葬则怎赠葬皂葬 运袁 郧燥贼燥 杂袁 杂澡蚤灶燥扎葬噪蚤
运袁 再葬皂葬早怎糟澡蚤鄄杂澡蚤灶燥扎葬噪蚤 运援 悦燥皂责葬则葬贼蚤增藻 枣怎灶糟贼蚤燥灶葬造 葬灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 泽蚤曾
远远缘
摇 源 期 玉米 匀灾粤圆圆 基因启动子的克隆与功能验证
凿则燥怎早澡贼鄄则藻泽责燥灶泽蚤增藻 责则燥皂燥贼藻则泽 蚤灶 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 则蚤糟藻援 孕造葬灶贼葬袁 圆园员源袁 圆猿怨
渊员冤院源苑 原 远园
咱员员暂摇 再葬皂葬早怎糟澡蚤 原 杂澡蚤灶燥扎葬噪蚤 运袁 酝蚤灶燥 酝袁 酝怎灶凿赠 允袁 悦澡怎葬 晕 匀援 粤灶葬造赠泽蚤泽
燥枣 葬灶 粤月粤鄄则藻泽责燥灶泽蚤增藻 则蚤糟藻 早藻灶藻 责则燥皂燥贼藻则 蚤灶 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 贼燥遭葬糟糟燥 咱允暂 援
孕造葬灶贼 酝燥造藻糟怎造葬则 月蚤燥造燥早赠袁 员怨怨园袁 员缘渊远冤院怨园缘 原 怨员圆
咱员圆暂摇 韵灶燥 粤袁 陨扎葬憎葬 栽袁 悦澡怎葬 晕 匀袁 杂澡蚤皂葬皂燥贼燥 运援 栽澡藻 则葬遭员远月 责则燥皂燥贼藻则 燥枣
则蚤糟藻 糟燥灶贼葬蚤灶泽 贼憎燥 凿蚤泽贼蚤灶糟贼 葬遭泽糟蚤泽蚤糟 葬糟蚤凿鄄则藻泽责燥灶泽蚤增藻 藻造藻皂藻灶贼泽 咱 允暂 援
孕造葬灶贼 孕澡赠泽蚤燥造燥早赠袁 员怨怨远袁 员员圆渊圆冤院源愿猿 原 源怨员
咱员猿暂摇 砸葬蚤 酝袁 匀藻 悦袁 宰怎 砸援 悦燥皂责葬则葬贼蚤增藻 枣怎灶糟贼蚤燥灶葬造 葬灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 贼澡则藻藻
葬遭蚤燥贼蚤糟 泽贼则藻泽泽鄄蚤灶凿怎糟蚤遭造藻 责则燥皂燥贼藻则泽 蚤灶 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 则蚤糟藻 咱允暂 援 栽则葬灶泽早藻灶蚤糟
砸藻泽藻葬则糟澡袁 圆园园怨袁 员愿渊缘冤院苑愿苑 原 苑怨怨
咱员源暂摇 月怎糟澡葬灶葬灶 悦 阅袁 运造藻蚤灶 孕 耘袁 酝怎造造藻贼 允 耘援 孕澡赠造燥早藻灶藻贼蚤糟 葬灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 缘忆
原 灶燥灶糟燥凿蚤灶早 则藻早蚤燥灶泽 枣则燥皂 贼澡藻 粤月粤鄄则藻泽责燥灶泽蚤增藻 则葬遭员远 辕 员苑 早藻灶藻 枣葬皂蚤造赠
燥枣 泽燥则早澡怎皂袁 皂葬蚤扎藻 葬灶凿 则蚤糟藻 责则燥增蚤凿藻泽 蚤灶泽蚤早澡贼 蚤灶贼燥 贼澡藻 糟燥皂责燥泽蚤贼蚤燥灶袁
燥则早葬灶蚤扎葬贼蚤燥灶 葬灶凿 枣怎灶糟贼蚤燥灶 燥枣 糟蚤泽鄄则藻早怎造葬贼燥则赠 皂燥凿怎造藻泽 咱 允暂 援 郧藻灶藻贼蚤糟泽袁
圆园园源袁 员远愿渊猿冤院员远猿怨 原 员远缘源
咱员缘暂摇 悦葬燥 载袁 悦燥泽贼葬 蕴 酝袁 月蚤凿藻则则藻鄄孕藻贼蚤贼 悦袁 运遭澡葬赠葬 月袁 阅藻赠 晕袁 孕藻则藻扎 孕袁
酝糟悦葬则贼赠 阅 砸袁 郧怎贼蚤藻则则藻扎鄄酝葬则糟燥泽 允 云袁 月藻糟则葬枣贼 孕 宰援 粤遭泽糟蚤泽蚤糟 葬糟蚤凿
葬灶凿 泽贼则藻泽泽 泽蚤早灶葬造泽 蚤灶凿怎糟藻 灾蚤增蚤责葬则燥怎泽员 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 蚤灶 泽藻藻凿 葬灶凿
增藻早藻贼葬贼蚤增藻 贼蚤泽泽怎藻泽 燥枣 皂葬蚤扎藻 咱 允暂 援 孕造葬灶贼 孕澡赠泽蚤燥造燥早赠袁 圆园园苑袁 员源猿渊圆冤院
苑圆园 原 苑猿员
咱员远暂摇 宰怎 杂袁 再怎 在袁 宰葬灶早 云袁 蕴蚤 宰袁 再藻 悦袁 蕴蚤 允袁 栽葬灶早 允袁 阅蚤灶早 允袁 在澡葬燥 允袁
宰葬灶早 月援 悦造燥灶蚤灶早袁 糟澡葬则葬糟贼藻则蚤扎葬贼蚤燥灶袁 葬灶凿 贼则葬灶泽枣燥则皂葬贼蚤燥灶 燥枣 贼澡藻
责澡燥泽责澡燥藻贼澡葬灶燥造葬皂蚤灶藻 晕鄄皂藻贼澡赠造贼则葬灶泽枣藻则葬泽藻 早藻灶藻 渊 在皂孕耘粤酝栽员 冤 蚤灶
皂葬蚤扎藻 渊 在藻葬 皂葬赠泽 蕴援 冤 咱 允暂 援 酝燥造藻糟怎造葬则 月蚤燥贼藻糟澡灶燥造燥早赠袁 圆园园苑袁 猿远
渊圆冤院员园圆 原 员员圆
咱员苑暂摇 杂澡藻灶 匝袁 哉噪灶藻泽 杂 允袁 匀燥 栽鄄匀 阅援 匀燥则皂燥灶藻 则藻泽责燥灶泽藻 糟燥皂责造藻曾 蚤灶 葬
灶燥增藻造 葬遭泽糟蚤泽蚤糟 葬糟蚤凿 葬灶凿 糟赠糟造燥澡藻曾蚤皂蚤凿藻鄄蚤灶凿怎糟蚤遭造藻 遭葬则造藻赠 早藻灶藻 咱 允暂 援
栽澡藻 允燥怎则灶葬造 燥枣 月蚤燥造燥早蚤糟葬造 糟澡藻皂蚤泽贼则赠袁 员怨怨猿袁 圆远愿渊猿员冤院圆猿远缘圆 原 圆猿远远园
咱员愿暂摇 杂澡藻灶 匝袁 匀燥 栽 匀援 云怎灶糟贼蚤燥灶葬造 凿蚤泽泽藻糟贼蚤燥灶 燥枣 葬灶 葬遭泽糟蚤泽蚤糟 葬糟蚤凿 渊粤月粤冤
原 蚤灶凿怎糟蚤遭造藻 早藻灶藻 则藻增藻葬造泽 贼憎燥 蚤灶凿藻责藻灶凿藻灶贼 粤月粤鄄则藻泽责燥灶泽蚤增藻 糟燥皂责造藻曾藻泽
藻葬糟澡 糟燥灶贼葬蚤灶蚤灶早 葬 郧鄄遭燥曾 葬灶凿 葬 灶燥增藻造 糟蚤泽鄄葬糟贼蚤灶早 藻造藻皂藻灶贼 咱 允暂 援 孕造葬灶贼
悦藻造造袁 员怨怨缘袁 苑渊猿冤院圆怨缘 原 猿园苑
咱员怨暂摇 杂澡藻灶 匝袁 悦澡藻灶 悦 晕袁 月则葬灶凿泽 粤袁 孕葬灶 杂 酝袁 匀燥 栽 匀 阅援 栽澡藻 泽则藻泽泽鄄 葬灶凿
葬遭泽糟蚤泽蚤糟 葬糟蚤凿鄄蚤灶凿怎糟藻凿 遭葬则造藻赠 早藻灶藻匀灾粤圆圆院 凿藻增藻造燥责皂藻灶贼葬造 则藻早怎造葬贼蚤燥灶
葬灶凿 澡燥皂燥造燥早燥怎泽 蚤灶 凿蚤增藻则泽藻 燥则早葬灶蚤泽皂泽 咱允暂 援 孕造葬灶贼 酝燥造藻糟怎造葬则 月蚤燥造燥早赠袁
圆园园员袁 源缘渊猿冤院猿圆苑 原 猿源园
咱圆园暂摇 在燥怎 载袁 杂藻藻皂葬灶灶 允 砸袁 晕藻怎皂葬灶 阅袁 杂澡藻灶 匝 允援 粤 宰砸运再 早藻灶藻 枣则燥皂
糟则藻燥泽燥贼藻 遭怎泽澡 藻灶糟燥凿藻泽 葬灶 葬糟贼蚤增葬贼燥则 燥枣 贼澡藻 葬遭泽糟蚤泽蚤糟 葬糟蚤凿 泽蚤早灶葬造蚤灶早
责葬贼澡憎葬赠 咱 允暂 援 栽澡藻 允燥怎则灶葬造 燥枣 月蚤燥造燥早蚤糟葬造 悦澡藻皂蚤泽贼则赠袁 圆园园源袁 圆苑怨
渊缘猿冤院缘缘苑苑园 原 缘缘苑苑怨
咱圆员暂摇 月怎藻造造 悦 砸袁 宰蚤灶早 砸 粤袁 酝糟悦燥皂遭蚤藻 宰 砸袁 酝藻泽泽蚤灶早 允袁 再怎葬灶 匝袁
韵怎赠葬灶早 杂援 陨灶鄄凿藻责贼澡 增蚤藻憎 燥枣 泽贼则怎糟贼怎则藻袁 葬糟贼蚤增蚤贼赠袁 葬灶凿 藻增燥造怎贼蚤燥灶 燥枣 则蚤糟藻
糟澡则燥皂燥泽燥皂藻 员园 咱允暂 援 杂糟蚤藻灶糟藻袁 圆园园猿袁 猿园园 渊缘远圆缘冤院员缘远远 原 员缘远怨
咱圆圆暂摇 酝蚤糟澡藻造 月 耘袁 运葬怎枣皂葬灶灶 酝 砸援 栽澡藻 燥泽皂燥贼蚤糟 责燥贼藻灶贼蚤葬造 燥枣 责燥造赠藻贼澡赠造藻灶藻
早造赠糟燥造 远园园园 咱允暂 援 孕造葬灶贼 孕澡赠泽蚤燥造燥早赠袁 员怨苑猿袁 缘员渊缘冤院 怨员源 原 怨员远
咱圆猿暂摇 悦澡藻灶 孕 再袁 宰葬灶早 悦 运袁 杂燥燥灶早 杂 悦袁 栽燥 运 再援 悦燥皂责造藻贼藻 泽藻择怎藻灶糟藻 燥枣
贼澡藻 遭蚤灶葬则赠 增藻糟贼燥则 责月陨员圆员 葬灶凿 蚤贼泽 葬责责造蚤糟葬贼蚤燥灶 蚤灶 糟造燥灶蚤灶早 栽鄄阅晕粤
蚤灶泽藻则贼蚤燥灶 枣则燥皂 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 责造葬灶贼泽 咱允暂 援 酝燥造藻糟怎造葬则 月则藻藻凿蚤灶早袁 圆园园猿袁 员员
渊源冤院圆愿苑 原 圆怨猿
咱圆源暂摇 云怎 云 蕴袁 匀藻 允袁 在澡葬灶早 在 再袁 在澡燥怎 杂 云袁 在澡葬灶早 杂 在袁 蕴蚤 宰 悦援 云怎则贼澡藻则
蚤皂责则燥增藻皂藻灶贼 燥枣 晕远 皂藻凿蚤怎皂 枣燥则 糟葬造造怎泽 蚤灶凿怎糟贼蚤燥灶 葬灶凿 责造葬灶贼
则藻早藻灶藻则葬贼蚤燥灶 枣则燥皂 皂葬蚤扎藻 蚤皂皂葬贼怎则藻 藻皂遭则赠燥泽 咱 允暂 援 粤枣则蚤糟葬灶 允燥怎则灶葬造 燥枣
月蚤燥贼藻糟澡灶燥造燥早赠袁 圆园员员袁员园渊员源冤院 圆远员愿 原 圆远圆源
咱圆缘暂摇 粤则皂泽贼则燥灶早 悦 蕴袁 郧则藻藻灶 悦 耘援 耘泽贼葬遭造蚤泽澡皂藻灶贼 葬灶凿 皂葬蚤灶贼藻灶葬灶糟藻 燥枣
枣则蚤葬遭造藻袁 藻皂遭则赠燥早藻灶蚤糟 皂葬蚤扎藻 糟葬造造怎泽 葬灶凿 贼澡藻 蚤灶增燥造增藻皂藻灶贼 燥枣 蕴鄄责则燥造蚤灶藻
咱允暂 援 孕造葬灶贼葬袁 员怨愿缘袁 员远源渊圆冤院 圆园苑 原 圆员源
咱圆远暂摇 允藻枣枣藻则泽燥灶 砸 粤袁 月怎则早藻泽泽 杂 酝袁 匀蚤则泽藻澡 阅援 茁 原 早造怎糟怎则燥灶蚤凿葬泽 枣则燥皂
耘泽糟澡藻则蚤糟澡蚤葬 糟燥造蚤 葬泽 葬 早藻灶藻鄄枣怎泽蚤燥灶 皂葬则噪藻则 咱 允暂 援 孕则燥糟藻藻凿蚤灶早泽 燥枣 贼澡藻
晕葬贼蚤燥灶葬造 粤糟葬凿藻皂赠 燥枣 杂糟蚤藻灶糟藻泽 燥枣 贼澡藻 哉灶蚤贼藻凿 杂贼葬贼藻泽 燥枣 粤皂藻则蚤糟葬袁
员怨愿远袁 愿猿渊圆圆冤院愿源源苑 原 愿源缘员
苑远缘