全 文 ：!核 农 学 报!"#$%!"&"# $$#$ ($#+
!"#$%&"()#*+&$,-$.*#/#$&0*.+%*+1
收稿日期!"#$)*#A*$&!接受日期!"#$)*$"*"$
基金项目!江苏省基础研究计划"自然科学基金#面上项目"-i"#$)$"%#
作者简介!金磊磊!男!研究实习员!主要从事植物病毒)真菌病毒)植物组织培养研究% 0*1234$5384X34X3"#$$;$,>:71
通讯作者!陈集双!男!教授!主要从事植物生物资源的利用)植物病理研究% 0*1234$]37:6X85@;$,>:71
文章编号!$###*A%%$""#$%##%*$#$*#+
$ 株侵染白三叶草的苜蓿花叶病毒全基因组序列
分析及其寄主生物学研究
金磊磊$!张本厚"!陈集双$
" $ 南京工业大学 生物与制药工程学院!江苏 南京!"$$A##& "南京工业大学大丰海洋产业研究院!江苏 大丰!"")$)%#
摘!要!从杭州下沙公园种植的白三叶草中分离到 $ 株苜蓿花叶病毒,(&(& 8"1&.*B.$#1! .Zm(进行全
基因组序列分析与寄主生物学研究# 通过双链 LM./7=]4X*@T?28PXP LM.! P@LM.(提取和改进的单引
物扩增技术对 .Zm*Ye进行全基因组克隆!并测序获得了病毒的全基因序列RX8-28N 登录号% LM.$!
YW,$,%$ LM."! YW,$,$ LM.,! YW,$,+($ 对 .Zm的外壳蛋白:72TS?7TX38! KJ(序列进行了
进化树分析! 探讨了 .Zm病毒家族亲缘关系$ 设计了通用探针对 .Zm侵染进行了 87?T6X?8 ]47T检测
验证# .Zm在心叶烟"本生烟"苋色藜"朝天椒上能形成侵染症状# 为 .Zm的全基因组序列获得"分子
检测和寄主生物学的研究提供了基础研究方法#
关键词!白三叶草$苜蓿花叶病毒$全基因组$亲缘关系$生物学检测方法
/EF$$#G$$A&H5>3@@8>$##*A%%$G"#$%G#%>$#$
!!白三叶草"2$.(".#8$+>+%1#为豆科车轴草属多年生
草本植物!是一种重要的生态农业作物!在中国广泛种
植于公园)道路)牧场)果园与山地% 白三叶草作为建植
草坪!既能美化环境!又能固土肥田!保持水土和促进果
树生长&作为天然牧草!其粗蛋白)粗纤维等含量丰富!
特别适合作为畜)禽及鱼类的饲料 $ B"( % 引起白三叶草
的病毒病害中较为严重的为苜蓿花叶病毒 ",(&(&
8"1&.*B.$#1!.Zm#和三叶草花叶病毒 "P5./+<"B+$
8"1&.*B.$#1! _KZm# ,( !感染 .Zm的白三叶草会出现
叶片斑驳)褪绿现象!降低白三叶草的品质和产量%
.Zm是雀麦花叶病毒属"6$"8"B.$#1#苜蓿花叶病
毒属唯一报道的成员 )( % .Zm是正义单链 LM.病
毒!具有三分体基因组 LM.$)LM.")LM., 和一个亚
基因组 LM.)% LM.$ 编码约 $" i/的 J$&LM." 编
码约 &#i/的 J" 蛋白!为依赖于 LM.复制的 LM.聚
合酶 "LM.*PXSX8PX8TLM.S74<1X?2@X!LPLS#&J$ 和
J" 蛋白共同构成了 .Zm的复制酶 % B+( % LM., 编码
病毒的移动蛋白 J,!同时它还形成亚基因组 LM.)!
LM.) 编码约 ")i/的外壳蛋白 KJ% 目前的研究发现
KJ在 .Zm的复制起始起着一定的作用!KJ与基因组
LM.@的 ,r非编码区" =8T?28@42TXP ?X9378@!fUL@#的结
合形式在 LPLS 的积累与识别 LM.@等复制相关过程
中起着一定的调控作用!这种特异性使得 KJ与 LM.@
,rfUL@的互作成为 .Zm复制研究的热点 A B$)( % 鉴
于 .Zm的这种复制特性!将 KJ或 LM.@,rfUL@的基
因导入白三叶)苜蓿植物体内可以获得抗 .Zm的转
基因植物 $% B$A( % 目前 .Zm的报道株系并不多!各株
系间的KJ较为保守!基于KJ的分子检测来确定.Zm
的侵染是一种快速)灵敏)可靠的方法 $&( %
本试验从感病的白三叶草中分离到 $ 株新的
.Zm!对其的全基因组进行了测序与分析!并基于 KJ
序列探讨了 .Zm各株系间的亲缘关系% 同时本试验设
计了通用探针利用 87?T6X?8 ]47T验证了 .Zm的侵染%
!"材料与方法
!#!"病毒来源
感病的白三叶草于 "#$$ 年 & 月采自杭州下沙情
$#$
核!农!学!报 "& 卷
人岛公园!毒源通过汁液摩擦接种至模式植物心叶烟
").*"/.&%& -#/.%"1&#!并放于防虫温室中!"% (,#O!
自然光照下培养%
!#$"试剂
U) LM.4392@X)U) /M.4392@X) .`U2g S74<1X?2@X)
?U2g S74<1X?2@X)Z*Z` mLXaX?@XU?28@:?3ST2@X) SZ/$A
BU载体试剂盒)/Y%#感受态细胞)6&84F)H*"?F
和 4.%P FFF限制性内切酶为日本 U2i2L2公司产品&
/M.Z2?NX?为立陶宛 DX?1X8T2@公司产品&/M.凝胶
回收试剂盒为美国 .^<9X8 公司产品&提取 LM.的
U?3d74试剂为 F8a3T?79X8 公司产品&其它试剂均为国产
分析纯%
!#%"8:TB2检测
取 %9接种 $)P 的发病心叶烟植物叶片!采用改进
的 P@LM.提取方法进行病毒 P@LM.检测 "#( %
!#<"分子克隆
检测到的 , 条 P@LM.条带 "从大到小!标记为
LM.$)LM.")LM.,#经过纯化后!利用改进的单引物
扩 增 技 术 " @3894X S?31X?21S43[3:2T378 TX:683g=X!
IJ.U#进行加接头引物)连接产物制备和 LU*JKL!获
得其 :/M.序列 "$ B""( % 由于 LM.$)LM.")LM., 的
条带大小为 " () N]!序列较大!用普通的 JKL程序扩
增稳定性不高% 本试验的 JKL程序采用 " 个循环体
系$&) O预变性 ,138& &) O变性 ,#@!%A O 退火 ,#@!
+" O延伸 ,G% 138!$% 个循环&&) O变性 ,#@!) O 退
火 ,#@! +" O延伸 ,G% 138! "# 个循环& +" O延伸
$% 138%
由 IJ.U得到扩增产物连接到 SZ/$A BU载体!
转化入 /Y%#感受态细胞!经蓝白斑筛选和双酶切鉴
定的重组质粒送去上海英骏生物技术有限公司测序!
每个样品测序 , 个平行克隆%
!#="序列分析
所测 P@LM.序列的拼接及最终碱基组成)大小由
ZX9.4398)IXgZ28 "/M.IT2?` 2@X?RX8X+G$!fI.#软件
完成! 编码蛋白序列的推测由 0P3TIXg "/M.IT2?
2`@X?RX8X+G$!fI.#完成% 在 MK-F的-M=:4X7T3PX.数
据库中搜索与所测序列的相似序列 " 6TS$HH\\\>
8:]3>841>836>97aH8=::7?XH#!序列之间的比对分析由
ZX9.4398 软件完成!同时用K42@T24^和Z0R.) 软件进
行进化树分析 ",( %
!#>"病毒粒子及植物总 TB2:提取
对上述转接过毒源的心叶烟进行病毒粒子的提
取!方法参照研究团队前期构建的方法 ")( % 按照病毒
粒子l水"PPY"## k$l,"aHa#的比例!摩擦接种到寄主
植物 心 叶 烟) 本 生 烟 ")K=+%/5&8.&%& #) 苋 色 藜
" <5+%">"3.#8 &8&$&%/.*""$#) 朝 天 椒 " <&>1.*#8
($#/+1*+%1#的顶端新叶中!放于防虫温室中!"% (,#O!
自然光照下培养!观察病毒的侵染症状!以相同生长时
期的健康植株作为对照% 在接种 $)P 后! 取感病心叶
烟顶端新叶!参照 U?3d74试剂使用说明书提取总
LM.@!用于 87?T6X?8 ]47T检测%
!#?"9-5.M459),-.检测
根据 .Zm的 ,rfUL@有 $)% 个碱基的保守序列!
设计通用探针% 探针序列为 %rBRK.UKKKUU.RRRR
K.UUK.URK.RUUUURK.UR.RK.UUU.U.UB,r%
从 .Zm侵染的叶组织中提取的总 LM.均量转移
至尼龙膜上!尼龙膜先经过 %O预杂交 ,6 后!加入?
B,"J(标记的探针 %%O杂交 $"6% 杂交后经过洗膜)
压膜)扫屏得到杂交结果%
$"结果与分析
$#!"侵染症状观察
疑似感病的白三叶草的叶片多呈现褪绿黄色斑纹
现象!这一症状与国内报道的 .Zm的侵染白三叶草
的症状类似 "%( % 以症状叶片作为毒源转接到心叶烟
上!转接 +P 后在新叶出现了褪绿和斑驳症状!并局部
伴有蚀纹现象症状%
$#$"8:TB2检测结果
对发病的心叶烟进行 P@LM.抽提!以与 .Zm同
科的黄瓜花叶病毒属"<#*#8=+$8"1&.*B.$#1! KZm#的
标准株系 D8<作为阳性对照!P@LM.检测结果如图 $
所示% 发现在发病的心叶烟中稳定存在 ) 条 P@LM.
带!从上至下分别为$LM.$)LM.")LM.,)LM.)!大小
约为 ))"G%)")$ N]!这与 .Zm的基因组组成信息一
致!推断侵染白三叶草的病毒很可能属于 .Zm%
$#%"8:TB2的序列分析及病毒种类确定
P@LM.提取纯化后!通过改进的 IJ.U方法得到
对应的 JKL产物!再经过克隆)测序)/M.IT2?序列分
析获得 LM.$)LM.")LM., 的全长基因组序列信息%
将得到的序列与 MK-F的序列数据库进行 -42@T!发现
与 MK-F上报道的 .Zm株系 )"% "`LM.$$ #`#$,&
LM."$c#$%+"& LM.,$i#,%)"#和 @`T"LM.$$DM+&%&
LM."$DM+&&LM.,$DM+&+ # 的 LM.$)LM."
和 LM., 的同源性均在 &%Q以上!确定从白三叶草上
分离的病毒为 .Zm!命名为 .Zm*Ye!各自的全长序
列信息发布于 MK-F上!登录号分别是 YW,$,%)
YW,$, 和 YW,$,+%
"#$
! 期 $ 株侵染白三叶草的苜蓿花叶病毒全基因组序列分析及其寄主生物学研究
注$Z$ $ N] /M. 2`PPX?& $$ KZm*D8<"阳性对照# &
"$ 检测的毒源%
M7TX$Z$ $ N] /M. 2`PPX?> 2`8X$$ D8<*KZm! S7@3T3aX:78T?74>
2`8X"$ a3?=@@7=?:X[7?PXTX:T378>
图 !"接种 !<8后从心叶烟叶组织中提取的 8:TB2结果
/*01!",4I.5-+M-54:*:54:G,.:-;8:TB24W.56I.48;5-A
,46;.*::G4-;:;69"/,(+$ !< ]867 +-:.*9;4I.48"8+*#
.Zm*Ye的 LM.$ 全长 , ), 8T!$## (, )A# 的 ,
,A$ 8T序列编码J$ 蛋白&LM." 全长为 " %&% 8T!% ("
)A 的 " )$% 8T序列编码 J" 蛋白&LM., 全长为 " #)$
8T!"), ($ $)% 的 &#, 8T序列编码移动蛋白 "J, 蛋
白#!$ $&% ($ A%$ 的 %+ 8T序列编码 KJ% .Zm*Ye
与 .ZmB)"% !`.Zm*`@T的基因组序列和推测的编码
蛋白的碱基序列的同源性基本在 &%Q以上"表 $#%
表 !"2PE(_` 与 2PE(<$= X& 2PE(X:.的基因组
和编码蛋白的碱基序列同源性
L6),4!"BGI,-.*84:4RG49I4*849.*.*4:-;TB2:
69849I-848+5-.4*9:)4.C4492PE(_`
6982PE(<$= X& 2PE(X:.
株系
IT?328
碱基序列同源性
FPX8T3T3X@7[8=:47T3PX@Xg=X8:XHQ
LM.$ J$ LM." J" LM., J, KJ
)"%` &+G) &+G% &+G+ &+G &+G" &G+ &+G
@`T &AG+ &AGA &%G, &)G& &+G% &+G# &AG#
$#<"2PE的进化关系分析
.ZmLM., 编码的 KJ已经证实与 .Zm的复制
有关!KJ上关键氨基酸的差异会影响 .Zm基因组的
复制% 本研究将推测的 KJ序列与已报道的 "+ 个具
有不同地域或寄主的 .Zm的 KJ的序列信息 "表 "#
进行序列比对和进化分析!比较 KJ的保守性和差异
性!探求 KJ在 .Zm进化中的地位"图 "#%
表 $"用于比对和进化分析的 2PE
株系的序列信息表
L6),4$"O9;-5A6.*-9-;2PE:.56*9:G:48*9
6,*09A49.698+M7,-0494.*I696,7:*:
株系
IT?328
序列号
.::X@@378
株系
IT?328
序列号
.::X@@378
<`XA# "( .V$,#+#, K2$ "+( /W,$)+%
$" ."( .V$,#+#) )"% Z"A( i#"+#,
$&% .M"( .V$,#+#% )"% `"&( #`#$"
D),# "( .V$,#+# Me$ .Zf$"%#&
K22$ "( .V$,#+#+ Me" .Zf$"%$#
/2:$ "( .V$,#+#A iL$ .D"&)),"
<`6 $ "( .V$,#+#& iL" .D"&)),,
K2,+% "+( /W,$)+)&
Me$
3`8:748 ,#(
.D"$%,
K2$+% "+( /W,$)+%# Me,) ,#( .D"$%)
K2,&& "+( /W,$)+%$ I ,$( c##A$&
K2)## "+( /W,$)+%" mLf,"( .D#$%+$
K2)#$ "+( /W,$)+%, /28d2 b#&$$#
K2%#A "+( /W,$)+%) @`T,,( DM+&+
K2%$A "+( /W,$)+%%
!!进化树分析结果显示"图 " B2#! KJ的氨基酸序
列在进化上可以分为 " 个大的分枝 "F组和 FF组#%
.Zm*Ye与大部分株系聚为一大簇!而株系 K22$)
/2:$) <`6 $)mLf和 <`XA# 为独立的 $ 个分枝% 从
氨基酸序列的比对中发现 K22$)/2:$) <`6 $)mLf和
<`XA# 的 +)A))$+ 和 "$) 位点上的氨基酸一致!而
区别于其他株系!这种差异直接反应了不同的进化分
枝% 另外!KJ的核苷酸序列存在 6&8YF酶切位点差
异!F组的序列中存在 6&8YF酶切位点!而 FF组中没
有"图 " B]#% "%+ ("" 位点的氨基酸组成 6&8YF
酶切识别区!在 FF组中由于第 "%A 个位点上的碱基差
异!而导致不能被 6&8YF酶切!证实基于这种进化分
析的株系分组可以用 LD`J技术来区分 "( %
研究发现$MK-F中报道株系主要为 F组!且分布
在世界各地&而 FF组的 .Zm株系为来自法国和英国
的!且在同一国中发现的株系均为同一次研究中发现!
说明这一组 .Zm株系的分布可能受到地域的局限而
非常少见%
$#="9-5.M459),-.分析
由于 .Zm, 条基因组的 ,vfUL区域存在 $)% 多
,#$
核!农!学!报 "& 卷
注$2$KJ氨基酸进化树& ]$ KJ核苷酸 6&8YF酶切位点分布%
M7TX$2$S6<479X8XT3:2824<@3@7[KJ213872:3P @Xg=X8:X@>]$ P3@T?3]=T378 7[?X@T?3:T378 @3TX@7[6&8YF38 KJ8=:4X7T3PX@Xg=X8:X@>
图 $"不同 2PE株系间的 NS序列分析
/*01$"D4RG49I4696,7:*:-;NS)4.C4498*;;4549.2PE:.56*9:
位相似的碱基序列!设计了通用的特异性探针% 选取
$)PS3发病的心叶烟进行总 LM.的提取!提取的总
LM.进行 87?T6X?8 ]47T杂交分析% 从图 , 可知!均存
在 LM.$)LM.")LM., 和 LM.) 的积累信号!其中
LM.) 有较高的积累量!与同时期提取的的 P@LM.含
量结果相反% 推测的原因为$由于 LM.) 编码 KJ!KJ
与 .Zm的移动和复制有密切的关系!使 LM.) 的含量
较高&LM.) 的复制主要从 LM., 的复制中产生!而很
少一部分由 LM.) 自主复制而来!使得 LM.) 的
P@LM.形式很少% 因此 LM.) 含量在 P@LM.检测中
较低而在总 LM.分析中较高%
$#> 寄主生物学研究
.Zm*Ye在心叶烟)本生烟)苋色藜)朝天椒上的
典型症状如图 ) 所示%
模式植物心叶烟)本生烟接种 .Zm*Ye%P 后就出
现新叶斑驳症状!到 "# ("%P 呈现典型症状% 在感病
的心叶烟的部分顶端叶有明显的泛白斑!系统叶表现
纹状褪绿花叶& 在感病的本生烟上明脉和褪绿现象明
显% 但是!与健康植物相比!植株的叶片大小)高矮基
本上没有变化%
.Zm能侵染经济作物辣椒% 将 .Zm*Ye接种至
朝天椒上!"#P 后顶端新叶上出现泡状皱缩!主脉褪绿
现象&随着时间的推移!褪绿现象明显!从基部沿主脉
图 %"B-5.M459),-.杂交检测心叶烟中
2PE的侵染
/*01%"B-5.M459),-.M7)5*8*Z6.*-9696,7:*:
-;2PE*9;4I.*90 :;69"/,(+$
向侧脉延伸&到 ,#P 左右!症状叶出现大块的黄色亮
斑!斑纹呈橡树叶形状%
苋色藜是植物病毒学研究中的一种指示植物%
.Zm*Ye侵染 ) (%P 后!苋色藜顶端的 $)" 片系统叶
)#$
核!农!学!报 "& 卷
证了 .Zm的侵染!并研究了 .Zm在心叶烟)本生烟)
苋色藜)朝天椒上的寄主生物学表型!为深入研究
.Zm与寄主的互作关系及其复制转录模式)功能基因
研究提供毒源和试验依据%
参考文献!
$ (!王彩梅>白三叶草在现代生态农业中的应用 V(>现代园艺!
"#$,!",# $," B,,
" (!何能学!朱朝碧>白三叶草种植技术及经济价值 V(>草叶科
技! "##,!,#",# $)"
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条件研究V(>植物保护!"#$,! ,&"# $$,# B$,
) (!a28 L7@@=1 K Z .! -?XPX?7PXDU! MXX4X128 !` -74VD>
D=8:T378240g=3a24X8:X7[K71178 28P f83g=XIXg=X8:X@38 T6X,&
f8T?28@42TXP LX9378@7[.4[24[2Z7@23:m3?=@LM.@$! "! 28P ,
V(>V7=?8247[m3?7479 % (!-74VD>.4[24[217@23:a3?=@28P 342?a3?=@X@$ 38a74aX1X8T7[:72T
S?7TX38 38 1=4T3S4X@TXS@7[T6X?XS43:2T378 :<:4XV(>V7=?8247[
RX8X?24m3?7479 (!L7d287aZM! i77838 0m! R7?]24X8<2.0>K78@X?a2T378 7[T6X
S=T2T3aX1XT6<4T?28@[X?2@XP71238$ 262412?N 7[T6X+ I38P]3@*43NX,
@=SX?9?7=S 7[S7@3T3aX*@T?28P LM.a3?=@X@>V(>V7=?8247[RX8X?24
m3?7479 + (!a28 PX?i=<4.K! 2`89X?X3@i! Y7=\389KV! V2@S2?@0Z! -74V
D>:3@*2:T389X4X1X8T@38a74aXP 38 ?XS43:2T378 7[24[24[217@23:a3?=@
LM.@38 a3T?7V(>m3?7479 A (!LX=@NX8 K-! MXX4X128 !` -74VD>U6X,vB=8T?28@42TXP ?X9378 7[
&(&(& 8"1&.*B.$#1LM., :78T238@2T4X2@TT\738PXSX8PX8T]38P389
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"A# $ $,) B$,%,
& (!.8@X4BZ:i388X`LM. PXTX?13828T@7[2@SX:3[3:
LM.*:72TS?7TX38 SXST3PX 38TX?2:T378 38 &(&(& 8"1&.*B.$#1$
:78@X?a2T378 7[67174797=@[X2T=?X@38 342?a3?=@LM.@V(>V7=?8247[
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24[24[2 17@23: a3?=@ :72T S?7TX38 38 a3?24LM. ?XS43:2T378!
X8:2S@3P2T378! 28P 17aX1X8TV(>m3?7479B)#
$$(!m47T.K! MXX4X128 !` 3`8T67?@TYV! -74VDKL74X7[T6X,vB
f8T?28@42TXP LX9378@7[.4[24[2Z7@23:m3?=@LM.@38 T6XD7?12T378
7[2U?28@3X8T4<0^S?X@@XP LXS43:2@X38 J428T@28P 38 T6X.@@X1]4<
7[m3?378@V(>V7=?8247[m3?7479$"(!MXX4X128 !` E4@T677?8 LK! 3`8T67?@TYV! -74VD>U?28@42T378 7[
2878S74<2PX8<42TXP a3?24LM.3@X8628:XP ]<]38P3897[a3?24:72T
S?7TX38 7?S74<2PX8<42T378 7[T6XLM. V(>J?7:XXP389@7[T6X
M2T37824.:2PX1<7[I:3X8:X@7[T6Xf83TXP IT2TX@7[.1X?3:2!
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&(&(& 8"1&.*B.$#1?XS43:2T378 3@:78:X8T?2T378 PXSX8PX8T V(>
V7=?8247[m3?7479$)(!K6X8 I K! E4@T677?8 LK>F8 a3T?728P 38 a3a7@T=P3X@7[T6XLM.
:78[7?12T37824@\3T:6 38 .4[24[217@23:a3?=@ V(>V7=?8247[
m3?7479$%(!李颖!哈斯阿古拉!邰丽华!方天祺!张鹤龄>苜蓿花叶病毒
LM." ,r端 :/M.转基因烟草及其抗病性研究V(>内蒙古大学
学报$自然科学版!"##)!,%"# $, B+
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及转基因植株的抗病性分析 V(>西北植物学报!"##)! ") "$##
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/XTX:T378 7[,(&(& 8"1&.*B.$#@38 J7T2T7V(>J6"##! & "$$# $ $",+ B$")"
"#(! 3`= _ c! K6X8 VI>.P7=]4X*@T?28PXP LM.2@T6X9X871X7[2
S7TX8T324a3?=@38[X:T389R.*.& (&=& V(>m3?=@RX8X@! "##&! ,&
"$# $ $" B$,$
"$(!K6X8 !` K6X8! VI! 3`= !` b= c! b=KI! D= Ue! 3`= _ Y>
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