全 文 ：书犇犗犐：１０．１１６８６／犮狔狓犫２０１５０４１４ 犺狋狋狆：／／犮狔狓犫．犾狕狌．犲犱狌．犮狀
文朝慧，南志标．甘肃省张掖地区苜蓿花叶病病原的检测．草业学报，２０１５，２４（４）：１２１１２６．
ＷｅｎＺＨ，ＮａｎＺＢ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｏｒｇａｎｉｓｍｓｉｎ犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪ｉｎＺｈａｎｇｙｅ，ＧａｎｓｕＰｒｏｖｉｎｃｅ．ＡｃｔａＰｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｅＳｉｎｉｃａ，２０１５，２４（４）：
１２１１２６．
甘肃省张掖地区苜蓿花叶病病原的检测
文朝慧１，２，南志标１
（１．兰州大学草地农业科技学院，草地农业生态系统国家重点实验室，甘肃 兰州７３００２０；２．甘肃出入境检验检疫局，甘肃 兰州７３００１０）
摘要：２０１１年７月在甘肃省张掖地区发现发生花叶病的苜蓿田块，地块中病株呈现黄斑花叶、叶柄扭曲及整株矮化
的症状。为明确其病原，采集病株后利用血清学和分子生物学方法对病样进行了检测。ＤＡＳ－ＥＬＩＳＡ、ＲＴ－ＰＣＲ
－ＲＦＬＰ及病毒ＣＰ基因序列测定分析结果表明，苜蓿病样受到番茄花叶病毒（Ｔｏｍａｔｏｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ，ＴｏＭＶ）和苜
蓿花叶病毒（Ａｌｆａｌｆａｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ，ＡＭＶ）的复合侵染。这是国际上首次报道番茄花叶病毒对苜蓿的侵染，讨论了由
这两种病毒引致病害的发生与防治。
关键词：苜蓿；番茄花叶病毒；苜蓿花叶病毒；病毒病　　
犇犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳狆犪狋犺狅犵犲狀犻犮狅狉犵犪狀犻狊犿狊犻狀犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪犻狀犣犺犪狀犵狔犲，犌犪狀狊狌犘狉狅狏犻狀犮犲
ＷＥＮＺｈａｏＨｕｉ１，２，ＮＡＮＺｈｉＢｉａｏ１
１．犆狅犾犾犲犵犲狅犳犘犪狊狋狅狉犪犾犃犵狉犻犮狌犾狋狌狉犪犾犛犮犻犲狀犮犲犪狀犱犜犲犮犺狀狅犾狅犵狔，犛狋犪狋犲犓犲狔犔犪犫狅狉犪狋狅狉狔狅犳犌狉犪狊狊犾犪狀犱犃犵狉狅犈犮狅狊狔狊狋犲犿狊，犔犪狀狕犺狅狌犝狀犻
狏犲狉狊犻狋狔，犔犪狀狕犺狅狌７３００２０，犆犺犻狀犪；２．犌犪狀狊狌犈狓犻狋犈狀狋狉狔犐狀狊狆犲犮狋犻狅狀犪狀犱犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲犅狌狉犲犪狌，犔犪狀狕犺狅狌７３００１０，犆犺犻狀犪
犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｔｗｏ犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪ｐｌａｎｔｓｗｉｔｈｓｅｖｅｒｅｌｅａｆｍｏｓａｉｃｓｙｍｐｔｏｍｓｗｅｒｅｃｏｌｅｃｔｅｄｆｒｏｍａｌｆａｌｆａｆｉｅｌｄｓｉｎ
ＬｉｎｚｅＣｏｕｎｔｙ，ＧａｎｓｕＰｒｏｖｉｎｃｅ，ｉｎＪｕｌｙ２０１１．Ｔｈｅｔｗｏｓａｍｐｌｅｓｗｅｒｅｔｅｓｔｅｄｂｙｅｎｚｙｍｅｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ
ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）ａｎｄｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ（ＲＴ－ＰＣＲ）．Ｔｈｅｔｅｓｔｅｄｓｐｅｃｉｍｅｎｓｗｅｒｅ
ｎｅｇａｔｉｖｅｆｏｒＣｕｃｕｍｂｅｒｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ，Ｔｏｂａｃｃｏｓｔｒｅａｋｖｉｒｕｓ，Ｗａｔｅｒｍｅｌｏｎｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ，ＰｏｔａｔｏｖｉｒｕｓＸ，Ｐｏｔａｔｏ
ｖｉｒｕｓＹ，Ｔｏｂａｃｃｏｒｉｎｇｓｐｏｔｖｉｒｕｓ，ＴｏｍａｔｏｒｉｎｇｓｐｏｔｖｉｒｕｓａｎｄＢｅａｎｙｅｌｏｗｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，Ｔｏｍａｔｏｍｏ
ｓａｉｃｖｉｒｕｓ（ＴｏＭＶ）ａｎｄＡｌｆａｌｆａｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ（ＡＭＶ）ｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄ．Ｔｈｅ６８７ａｎｄ３５１ｂｐｆｒａｇｍｅｎｔｓｏｂｔａｉｎｅｄ
ｆｒｏｍＰＣＲｗｉｔｈａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅｓｐｅｃｉｅｓｓｐｅｃｉｆｉｃＴｏＭＶａｎｄＡＭＶｐｒｉｍｅｒｓｓｈｏｗｅｄ９９％ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｉｍｉｌａｒｉｔｙｗｉｔｈ
ｐｕｂｌｉｓｈｅｄＴｏＭＶＣＰａｎｄＡＭＶＣＰｇｅｎｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ａ８０５ｂｐＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄｕｓｉｎｇｇｅｎｕｓｓｐｅｃｉｆｉｃ
犜狅犫犪犿狅狏犻狉狌狊ｐｒｉｍｅｒｓａｎｄｔｈｅｐｒｅｓｅｎｃｅｏｆＴｏＭＶｗａｓｃｏｎｆｉｒｍｅｄｂｙＲＴ－ＰＣＲ－ＲＦＬＰ．Ｔｏｔｈｅｂｅｓｔｏｆｏｕｒ
ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ，ｔｈｉｓｉｓｔｈｅｆｉｒｓｔｒｅｐｏｒｔｏｆＴｏＭＶｉｎａｌｆａｌｆａ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪；Ｔｏｍａｔｏｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ；Ａｌｆａｌｆａｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ；ｖｉｒｕｓｄｉｓｅａｓｅ
紫花苜蓿（犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪）是世界分布范围最广的豆科牧草，也是我国种植面积最大的人工牧草［１］。它是
我国干旱半干旱地区植被生态建设和退耕还草的重要草种，在建设和保护生态环境［２］，调整种植业结构［３］，保持
农业可持续发展［４］方面均具有潜在经济效益和重要的社会效益［５］。病害是苜蓿生产的主要限制因素之一，苜蓿
被植物病毒侵染后发生病毒病，表现花叶、矮缩或畸形等症状，产量降低，难以越冬。由于生产中应用的大多数苜
第２４卷　第４期
Ｖｏｌ．２４，Ｎｏ．４
草　业　学　报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
２０１５年４月
Ａｐｒｉｌ，２０１５
收稿日期：２０１３１０１１；改回日期：２０１３１２１６
基金项目：公益性行业（农业）科技专项（Ｎｏ．２０１３０３０５７），国家质检总局科技计划项目（２０１２ＩＫ２７０）和甘肃出入境检验检疫局科技计划项目
（２０１１ＧＫ００１）资助。
作者简介：文朝慧（１９６９），女，四川简阳人，高级农艺师，在读博士。Ｅｍａｉｌ：ｗｚｈｈｌｉ＠１６３．ｃｏｍ
通讯作者Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ．Ｅｍａｉｌ：ｚｈｉｂｉａｏ＠ｌｚｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
蓿品种为多年生品种，病毒的多年积累使苜蓿感染病毒病后田间发病率较高，而病毒病的发生也增加了其他病害
的发生率，对苜蓿的产量和饲用价值都有较大的影响。另一方面，苜蓿作为植物病毒的多年生活体寄主，为病原
物及其介体昆虫度过不良环境提供了场所，有利于病原物扩散并侵染其他作物［６］，造成农作物的产量损失。
根据国内外的研究报道，至少有３１种植物病毒可以侵染苜蓿［７］，在我国，蔡发兴和莽克强［８］分离了北京苜蓿
花叶病毒（Ａｌｆａｌｆａｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ，ＡＭＶ）Ｈ１０，并对其生物学特性进行了研究；张祥林等［９］在新疆苜蓿上分离鉴定
了菜豆黄花叶病毒（Ｂｅａｎｙｅｌｏｗｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ，ＢＹＭＶ）和豇豆花叶病毒（Ｃｏｗｐｅａｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ，ＣＰＭＶ）［１０］，对其
生物学特性、血清学和病毒衣壳蛋白亚基组成及分子量进行了研究。商文静［１１］、王雪薇等［１２］的调查表明，苜蓿
花叶病在宁夏、新疆等苜蓿产区发生普遍，严重影响苜蓿的产量和品质。目前随着苜蓿种植面积的扩大，病害问
题日益引起生产者的重视，但对病毒引致的病害研究较少［１３］，因此有必要对苜蓿病毒病在病原学、发病规律及防
治措施等方面进行深入而系统的研究。
２０１１年７月在甘肃省张掖市临泽县农户院落附近的紫花苜蓿地块中，发现苜蓿植株表现黄斑花叶、矮化等
病毒病症状。为明确其病原，采用双抗体夹心酶联免疫吸附分析（ＤＡＳ－ＥＬＩＳＡ）及反转录聚合酶链式反应
（ＲＴ－ＰＣＲ）方法对病样进行了检测，以期明确病原，为当地苜蓿病毒病的综合防治提供参考。
１　材料与方法
１．１　材料
病样于２０１１年７月苜蓿成熟期采自甘肃省张掖市临泽县，苜蓿品种为农家品种，主要症状表现为黄斑花叶、
叶柄扭曲及植株矮化，采样地块的苜蓿发病率达１００％。
采样地位于东经Ｅ１００°１５′，北纬Ｎ３９°０６′，海拔１４１０ｍ，年均温７．１℃，年降水量１２１ｍｍ，多集中在７－９
月。土壤类型为沙壤。在发病地块随机采集苜蓿黄斑花叶病株共２份，编号为ＡＳ１、ＡＳ２，置于洁净塑料袋中，保
存于４℃冰箱备用。
１．２　血清学检测
参考Ｃｌａｒｋ和Ａｄａｍｓ［１４］的方法，采用 ＤＡＳ－ＥＬＩＳＡ（Ａｇｄｉａ，美国）对２份病样分别进行烟草花叶病毒（Ｔｏ
ｂａｃｃｏｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ，ＴＭＶ）、ＡＭＶ、黄瓜花叶病毒（Ｃｕｃｕｍｂｅｒｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ，ＣＭＶ）、烟草线条病毒（Ｔｏｂａｃｃｏ
ｓｔｒｅａｋｖｉｒｕｓ，ＴＳＶ）、西瓜花叶病毒（Ｗａｔｅｒｍｅｌｏｎｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ，ＷＭＶ）、番茄花叶病毒（Ｔｏｍａｔｏｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ，
ＴｏＭＶ）、马铃薯Ｘ病毒（ＰｏｔａｔｏｖｉｒｕｓＸ，ＰＶＸ）、马铃薯Ｙ病毒（ＰｏｔａｔｏｖｉｒｕｓＹ，ＰＶＹ）、烟草环斑病毒（Ｔｏｂａｃｃｏ
ｒｉｎｇｓｐｏｔｖｉｒｕｓ，ＴＲＳＶ）和番茄环斑病毒（Ｔｏｍａｔｏｒｉｎｇｓｐｏｔｖｉｒｕｓ，ＴｏＲＳＶ）等１０种病毒的检测。阳性对照样品购
自美国Ａｇｄｉａ公司，阴性对照为健康苜蓿植株，以缓冲液为空白对照。用ＴｈｅｒｍｏＬａｂＳｙｓｔｅｍｓ酶标仪在４０５ｎｍ
处检测各反应孔的吸收值。被测样品ＯＤ值／阴性对照ＯＤ值＞２．１时判定为阳性反应。
１．３　ＲＴ－ＰＣＲ检测
参照文献［１５１７］分别合成烟草花叶病毒属（犜狅犫犪犿狅狏犻狉狌狊）病毒ＣＰ基因的通用引物，ＴｏＭＶ、ＴＭＶ、ＡＭＶ
和菜豆黄花叶病毒（ＢＹＭＶ）的ＣＰ基因特异性引物（表１），引物由宝生物工程（大连）有限公司合成。
利用ＲＮＡ提取试剂ＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，美国）提取苜蓿叶片总ＲＮＡ。称取０．１ｇ叶片，液氮研细，移入１．５
ｍＬ离心管中，加入１ｍＬ的ＴＲＩｚｏｌ，混匀，４℃１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，将上清液转入另一新离心管中；加０．５
ｍＬ氯仿，剧烈振荡１５ｓ；４℃１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ；将上层水相转移到新离心管中，加等体积异丙醇，上下颠
倒混匀；室温静置１５ｍｉｎ；４℃１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，弃上清，加入７５％的乙醇洗涤沉淀，然后４℃７５００
ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，弃乙醇；室温干燥沉淀５～１０ｍｉｎ，加入３０μＬ焦碳酸二乙酯（ＤＥＰＣ）水溶解沉淀，－７０℃保存
备用。
取叶片总ＲＮＡ及目的基因的下游引物合成ｃＤＮＡ。反转录总反应体系２０μＬ，先加入叶片总ＲＮＡ２μＬ、
ＤＥＰＣＨ２Ｏ１０μＬ、２０μｍｏｌ／Ｌ下游引物１μＬ，７０℃温育５ｍｉｎ后，冰上放置２ｍｉｎ，再加入５×ＲＴＢｕｆｆｅｒ４μＬ、
１０ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰ１μＬ、４０Ｕ／μＬＲＮａｓｉｎ１μＬ、２００Ｕ／μＬＭＭＬＶ酶１μＬ（ＴａＫａＲａ，大连），３７℃反应１ｈ后，
－２０℃保存备用。
２２１ 草　业　学　报 第２４卷
　　参照文献［１２１４］分别扩增样品组织中的５种目
的基因：犜狅犫犪犿狅狏犻狉狌狊属病毒的犆犘 基因、ＴｏＭＶ 的
犆犘基因、ＴＭＶ 的 犆犘 基因、ＡＭＶ 的 犆犘 基因或
ＢＹＭＶ的犆犘基因。ＰＣＲ扩增反应体系２５μＬ，包括
１０×ＰＣＲｂｕｆｆｅｒ２．５μＬ、５Ｕ／μＬＴａｑ酶０．２μＬ、２０
μｍｏｌ／Ｌ上、下游引物各０．５μＬ、２．５ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰ
１．０μＬ、ｃＤＮＡ３μＬ、ｄｄＨ２Ｏ１７．３μＬ。扩增条件为：
９４℃３ｍｉｎ；９４℃３０ｓ、５４℃４０ｓ、７２℃１ｍｉｎ，３０个循
环；７２℃８ｍｉｎ。取８μＬＰＣＲ产物进行１％琼脂糖凝
胶（含ＥＢ０．５μＬ／ｍＬ）电泳，电泳结束后凝胶成像仪
记录结果。
ＰＣＲ产物用纯化试剂盒（ＴａＫａＲａ，大连）纯化后，
直接用于测序，测序由宝生物工程（大连）有限公司进
表１　本实验所用引物的序列
犜犪犫犾犲１　犜犺犲狊犲狇狌犲狀犮犲狊狅犳狋犺犲狆狉犻犿犲狉狊狌狊犲犱犻狀狋犺犻狊狊狋狌犱狔
引物编号
Ｐｒｉｍｅｒｐａｉｒ
引物序列（５′－３′）
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ（５′－３′）
扩增片段
Ａｍｐｌｉｃｏｎ（ｂｐ）
ＴｏｂＵｎｉ１ ＡＴＴＴＡＡＧＴＧＧＡＳＧＧＡＡＡＡＶＣＡＣＴ ８０５
ＴｏｂＵｎｉ２ ＧＴＹＧＴＴＧＡＴＧＡＧＴＴＣＲＴＧＧＡ
ＴＭＶＦ ＣＧＧＴＣＡＧＴＧＣＣＧＡＡＣＡＡＧＡＡ ６９５
ＴｏＭＶＦ ＣＧＧＡＡＧＧＣＣＴＡＡＡＣＣＡＡＡＡＡＧ ６８７
ＡＭＶＦ ＣＣＡＴＣＡＴＧＡＧＴＴＣＴＴＣＡＣＡＡＡ ３５１
ＡＭＶＲ ＴＣＧＴＣＡＣＧＴＣＡＴＣＡＧＴＧＡＧＡＣ
ＢＹ１ ＧＣＣＴＴＡＴＧＧＴＧＴＧＧＴＧＣＡＴＡＧ ４４７
ＢＹ２ ＣＡＡＧＣＡＴＧＧＴＧＴＧＣＡＴＡＴＣＡＣＧ
行。测序结果通过ＢＬＡＳＴ与ＧｅｎＢａｎｋ中已登录的序列进行一致性比较。
１．４　ＲＴ－ＰＣＲ产物限制性酶切分析
参照文献［１５］，采用限制性内切酶犇犱犲Ｉ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，美国）酶切由犜狅犫犪犿狅狏犻狉狌狊属病毒通用引
物扩增得到的ＰＣＲ产物。酶切体系２０μＬ，包含无菌水７μＬ，未经纯化的ＰＣＲ产物１０μＬ，ＮＥＢＢｕｆｆｅｒ２．０μＬ，
犇犱犲Ｉ３Ｕ，３７℃酶切３ｈ。反应产物经１．２％琼脂糖电泳检测，记录酶切图谱。
２　结果与分析
２．１　血清学检测
对采集到的２份具有典型花叶症状的苜蓿样品进行了ＤＡＳ－ＥＬＩＳＡ检测。酶联免疫试剂盒检测结果为：２
份样品均与ＴＭＶ和ＴｏＭＶ的抗血清呈阳性反应，与其他８种病毒抗血清呈阴性反应（表２）。
表２　苜蓿样品血清学检测结果
犜犪犫犾犲２　犛犲狉狅犾狅犵犻犮犪犾犱犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳犪犾犳犪犾犳犪狊犪犿狆犾犲狊
样品
Ｓａｍｐｌｅｎａｍｅ
抗血清Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ
ＴＲＳＶ ＰＶＹ ＣＭＶ ＴＳＶ ＷＭＶ ＴｏＲＳＶ ＰＶＸ ＡＭＶ ＴＭＶ ＴｏＭＶ
阳性对照Ｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ ７．９２ ５．６５ ２．５０ １７．６８ ７．０７ ２７．１０ ２．９４ ６．８３ ６．５４ ９．１５
ＡＳ１ １．１２ １．１０ １．０３ １．１５ １．１８ １．１４ ０．９７ １．２３ ２．１１ ２．３４
ＡＳ２ １．１３ １．０９ １．１１ １．１２ １．２０ １．１６ １．０２ １．１８ ２．２０ ２．３６
　样品ＯＤ值／阴性对照ＯＤ值。ＯＤ４０５ｏｆｓａｍｐｌｅｓ／ＯＤ４０５ｏｆｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ．
２．２　ＲＴ－ＰＣＲ检测
ＤＡＳ－ＥＬＩＳＡ检测结果显示，苜蓿病样与 ＴＭＶ、ＴｏＭＶ 抗血清均呈阳性反应，为明确样品中存在的是
ＴＭＶ还是ＴｏＭＶ，一方面参照文献［１５］采用犜狅犫犪犿狅狏犻狉狌狊属病毒通用引物对病样进行ＲＴ－ＰＣＲ扩增，在获得扩
增产物的基础上，对ＰＣＲ扩增产物进行限制性内切酶犇犱犲Ｉ的酶切反应，根据酶切片段电泳图谱（限制性片段长
度多态性，ＲＦＬＰ）判断样品中存在的是ＴＭＶ还是ＴｏＭＶ；另一方面采用ＴＭＶ和ＴｏＭＶ的特异性引物对病样
进行ＲＴ－ＰＣＲ扩增，对获得的扩增片段进行测序，通过序列比对明确样品中存在的是ＴＭＶ还是ＴｏＭＶ。同
时，采用ＡＭＶ、ＢＹＭＶ的特异性引物对２份苜蓿病样进行了ＲＴ－ＰＣＲ检测，以判断样品中是否存在ＡＭＶ和
ＢＹＭＶ。检测结果表明，犜狅犫犪犿狅狏犻狉狌狊属病毒通用引物从２份病样中均扩增出约０．８ｋｂ的目标条带；ＴｏＭＶ特
异性引物从２份病样中均扩增出约０．７ｋｂ的目标条带，健康样品和空白对照无扩增条带；ＴＭＶ特异性引物未扩
３２１第４期 文朝慧　等：甘肃省张掖地区苜蓿花叶病病原的检测
增出目标条带；ＡＭＶ特异性引物从２份病样中均扩增
图１　苜蓿花叶病样的犚犜－犘犆犚检测结果
犉犻犵．１　犜犺犲狉犲狊狌犾狋狊狅犳犚犜－犘犆犚狅犳犕．狊犪狋犻狏犪
狊犪犿狆犾犲狊狊犺狅狑犻狀犵犿狅狊犪犻犮狊狔犿狆狋狅犿狊
　　　Ｍ：１００ｂｐＤＮＡ 分子量标准；１：ＴｏｂＵｎｉ１／ＴｏｂＵｎｉ２扩增；２：
ＴｏｂＵｎｉ１／ＴｏＭＶＦ扩增；３：ＴｏｂＵｎｉ１／ＴＭＶＦ扩增；４：健康对照；
５：空白对照；６：ＡＭＶＦ／ＡＭＶＲ 扩增；７：健康对照。Ｍ：１００ｂｐ
ＤＮＡｍａｒｋｅｒ；１：ＴｏｂＵｎｉ１／ＴｏｂＵｎｉ２；２：ＴｏｂＵｎｉ１／ＴｏＭＶＦ；３：
ＴｏｂＵｎｉ１／ＴＭＶＦ；４：Ｈｅａｌｔｈｃｏｎｔｒｏｌ；５：Ｂｌａｎｋｃｏｎｔｒｏｌ；６：ＡＭＶＦ／
ＡＭＶＲ；７：Ｈｅａｌｔｈｃｏｎｔｒｏｌ．
图２　犚犜－犘犆犚扩增产物的犇犱犲犐酶切图谱
犉犻犵．２　犇犱犲犐狉犲狊狋狉犻犮狋犻狅狀犲狀犱狅狀狌犮犾犲犪狊犲犱犻犵犲狊狋犻狅狀狅犳
犚犜－犘犆犚狆狉狅犱狌犮狋狊
　　　Ｍ：１００ｂｐＤＮＡｍａｒｋｅｒ；１：ＴｏｂＵｎｉ１／ＴＭＶＦ扩增产物；２：Ｔｏｂ
Ｕｎｉ１／ＴｏＭＶＦ扩增产物；３：ＴｏｂＵｎｉ１／ＴＭＶＦ 扩增产物酶切；４：
ＴｏｂＵｎｉ１／ＴｏＭＶＦ扩增产物酶切。１：ＲＴＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｏｂｔａｉｎｅｄｗｉｔｈ
ＴｏｂＵｎｉ１／ＴＭＶＦ；２：ＲＴＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｏｂｔａｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ＴｏｂＵｎｉ１／
ＴｏＭＶＦ；３：犇犱犲ＩｄｉｇｅｓｔｉｏｎｏｆＲＴ－ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｏｂｔａｉｎｅｄｗｉｔｈＴｏｂ
Ｕｎｉ１／ＴＭＶＦ；４：犇犱犲ＩｄｉｇｅｓｔｉｏｎｏｆＲＴ－ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｏｂｔａｉｎｅｄｗｉｔｈ
ＴｏｂＵｎｉ１／ＴｏＭＶＦ．
出约０．３５ｋｂ的目标条带，健康样品中无扩增条带（图
１，仅显示样品ＡＳ１ 的电泳结果）；ＢＹＭＶ引物未扩增
出目标条带。
取样品 ＡＳ１ 的ＰＣＲ产物进行测序，ＴｏＭＶ特异
性引物的扩增产物（ＧｅｎＢａｎｋ序列号ＪＸ８５７６３４）包括
完整的ＣＰ基因序列，该序列与已报道［１８］的ＴｏＭＶ德
国分离物ＣＰ基因核苷酸序列（ＤＱ８７３６９２）的同源性
为９９％，说明所测定的序列为ＴｏＭＶ的ＣＰ基因部分
序列；ＡＭＶ扩增产物经测序及序列同源性比较，该序
列（ＪＸ８５７６３５）与已报道［１９］的ＡＭＶＣＰ基因的核苷酸
序列（ＦＮ６６７９６７）的同源性为９９％、氨基酸序列的同
源性为１００％，证明所测定的 ＤＮＡ 片段为 ＡＭＶ 的
ＣＰ基因部分序列。
２．３　酶切结果
犜狅犫犪犿狅狏犻狉狌狊属病毒通用引物扩增产物经犇犱犲Ｉ
酶切产生２个约３９０ｂｐ的酶切片段（图２）。根据文献
［１５］，犜狅犫犪犿狅狏犻狉狌狊属病毒通用引物扩增产物经犇犱犲
Ｉ酶切后，ＴｏＭＶ产生大小为３９５ｂｐ，３９４ｂｐ的２个片
段，而ＴＭＶ 产生大小为２６０ｂｐ，４７５ｂｐ或３２７ｂｐ，
４７５ｂｐ的２个片段，因此，由酶切图谱可判断出，样品
中扩增到的ＤＮＡ片段是ＴｏＭＶ的部分片段。
３　讨论
本研究采用ＤＡＳ－ＥＬＩＳＡ和ＲＴ－ＰＣＲ方法检
测出甘肃省张掖地区的苜蓿花叶病株受到 ＡＭＶ和
ＴｏＭＶ侵染。ＡＭＶ为苜蓿花叶病毒属（犃犾犳犪犿狅狏犻狉
狌狊）病毒，能自然侵染５１科双子叶植物的４３０余种栽
培及野生植物，如苜蓿、三叶草（犜狉犻犳狅犾犻狌犿狉犲狆犲狀狊）、豌
豆（犘犻狊狌犿狊犪狋犻狏狌犿）、大豆（犌犾狔犮犻狀犲犿犪狓）、豇豆（犞犻犵
狀犪狌狀犵狌犻犮狌犾犪狋犪）、马铃薯（犛狅犾犪狀狌犿狋狌犫犲狉狅狊狌犿）、烟草
（犖犻犮狅狋犻犪狀犪狋犪犫犪犮狌犿）、辣椒（犆犪狆狊犻犮狌犿犪狀狀狌狌犿）、番茄
（犛狅犾犪狀狌犿犾狔犮狅狆犲狉狊犻犮狌犿）和芹菜（犃狆犻狌犿犵狉犪狏犲狅犾犲狀狊）
等。该病毒易经汁液摩擦传播，菟丝子 （犆狌狊犮狌狋犪
犮犺犻狀犲狀狊犻狊）可传毒，可被至少１４种蚜虫以非持久方式
传播，在苜蓿、大豆、辣椒上可以种传，苜蓿的种传率为
１０％［２０］。苜蓿感染ＡＭＶ后，根瘤菌根瘤数量减少、体积缩小、鲜重降低，植株的固氮作用水平降低［２１］。Ｔｕ和
Ｈｏｌｍｅｓ［２２］的田间及温室实验表明，受ＡＭＶ侵染后，苜蓿饲草产量和粗蛋白含量减少，越冬成活率降低。
ＴｏＭＶ为犜狅犫犪犿狅狏犻狉狌狊属病毒，过去曾被认为是ＴＭＶ的一个株系，自１９７１年以后从ＴＭＶ中划出，成为独
立的病毒种［２３］。该病毒寄主范围广，能侵染茄科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）、十字花科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）、禾本科（Ｐｏａｃｅａｅ）、藜科
（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉａｃｅａｅ）、豆科（Ｆａｂａｃｅａｅ）等多种植物［２４］，主要通过汁液机械传播及种子带毒传播。ＴｏＭＶ与ＴＭＶ同
为犜狅犫犪犿狅狏犻狉狌狊成员，二者碱基序列相似程度高，在多种寄主上产生相同的症状，有着较密切的血清学关系，单
４２１ 草　业　学　报 第２４卷
纯使用多抗血清难以区分。目前利用单克隆抗体制备技术和ＲＴ－ＰＣＲ技术，已可快速可靠地区分ＴｏＭＶ和
ＴＭＶ。周雪平等［２５２６］从杭州番茄上分离鉴定了ＴｏＭＶ，并对其与ＴＭＶ的差异进行了系统的比较研究。于翠
等［２７］通过制备单克隆抗体区分了ＴｏＭＶ和ＴＭＶ。Ｌｅｔｓｃｈｅｒｔ等［１５］采用通用引物的ＲＴ－ＰＣＲ－ＲＦＬＰ方法及
特异性引物的ＲＴ－ＰＣＲ方法，在种的水平区分了包括ＴＭＶ和ＴｏＭＶ在内的犜狅犫犪犿狅狏犻狉狌狊属中具有血清学关
系的５种病毒。本实验参照Ｌｅｔｓｃｈｅｒｔ等［１５］的方法，采用犜狅犫犪犿狅狏犻狉狌狊属病毒通用引物的ＲＴ－ＰＣＲ－ＲＦＬＰ及
特异性引物的ＲＴ－ＰＣＲ两种方法对样品进行检测，证明该苜蓿样品感染了ＴｏＭＶ。
花叶病是苜蓿的重要病害，在我国西北、华北地区发生较为普遍，宁夏苜蓿花叶病发病率达５０％以上［１１］，造
成鲜草损失和种子减产。受病毒感染的苜蓿植株不仅产量和质量下降，还成为终生传毒者［２８］。目前尚无防治病
毒病的化学药剂，主要采用降低作物内外的侵染源、限制介体的扩散以及降低病毒病对作物产量带来的损失等手
段控制病毒病。因此，确定侵染作物的病毒种类，对于实施有效的病毒控制措施十分关键，仅仅靠症状来诊断会
引起误导［２９］。
病毒的外壳蛋白（ＣＰ）起着保护核酸的作用，含有抗原决定簇，决定着病毒的抗原特异性，在病毒的侵染过程
中对寄主细胞具有识别作用［３０］，已广泛应用于植物病毒的检测。本实验中采用ＤＡＳ－ＥＬＩＳＡ方法未在样品中
检出ＡＭＶ，但经 ＲＴ－ＰＣＲ扩增 ＡＭＶ 的ＣＰ基因片段并通过测序分析，检测出病样感染了 ＡＭＶ，ＤＡＳ－
ＥＬＩＳＡ的阴性结果可能与该批次检测抗血清的灵敏度有关。
本研究在苜蓿花叶病病样中检出ＴｏＭＶ，但已发表文献中尚未有ＴｏＭＶ侵染苜蓿的报道，由于所研究苜蓿
样品采集于甘肃省河西地区蔬菜瓜果种植区，该地区的茄科植物存在有ＴｏＭＶ的侵染危害［３１］，这可能是苜蓿样
品病毒的侵染来源。本研究仅对病毒病病原进行了血清学和分子生物学检测，限于采样范围及样品数量，研究结
果具有一定的局限性，下一步将对病毒病毒原进行人工接种、地理分布等生物学特性研究及病毒提纯、电镜观察
等实验，以进一步确认其分类地位，为当地合理有效地进行苜蓿病毒病的防治和检测提供参考。
犚犲犳犲狉犲狀犮犲狊：
［１］　ＧｅｎｇＨＺ，ＷｕＹＦ，ＣａｏＺＺ．ＡｌｆａｌｆａｉｎＣｈｉｎａ［Ｍ］．Ｂｅｉｊｉｎｇ：ＣｈｉｎａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅＰｒｅｓｓ，１９９５：１５０．
［２］　ＸｉｅＫＹ，ＺｈａｏＹ，ＬｉＸＬ，犲狋犪犾．Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎｇｒａｓｓｅｓａｎｄｌｅｇｕｍｅｓｉｎｍｉｘｅｄｇｌａｓｓｌａｎｄ：ａｒｅｖｉｅｗ．ＡｃｔａＰｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｅＳｉｎｉｃａ，２０１３，
２２（３）：２８４２９６．
［３］　ＹａｎｇＳＱ，ＳｕｎＺＭ，ＹａｎｇＸＰ．Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇａｌｆａｌｆａｉｎｄｕｓｔｒｉａｌｉｚａｔｉｏｎｔｏｐｒｏｍｏｔｅａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｄｊｕｓｔｍｅｎｔｉｎｔｈｅｎｏｒｔｈｗｅｓｔａｒｉｄａｒｅａｏｆ
Ｃｈｉｎａ．ＡｃｔａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｅＢｏｒｅａｌｉｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓＳｉｎｉｃａ，２００３，１２（４）：１５７１６０．
［４］　ＣａｏＬ，ＱｉｎＳＨ，ＺｈａｎｇＪＬ，犲狋犪犾．Ｅｆｆｅｃｔｏｆｌｅｇｕｍｉｎｏｕｓｆｏｒａｇｅｒｏｔａｔｉｏｎｓｏｎｓｏｉｌｍｉｃｒｏｂｅｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍｓａｎｄｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｌｙ
ｃｒｏｐｐｅｄｐｏｔａｔｏｆｉｅｌｄｓ．ＡｃｔａＰｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｅＳｉｎｉｃａ，２０１３，２２（３）：１３９１４５．
［５］　ＲｅｎＪＺ．Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔｏｆａｎａｇｒｏｇｒａｓｓｌａｎｄｓｙｓｔｅｍｓｆｏｒｇｒａｉｎｓｔｏｒａｇｅ———ＡｔｈｏｕｇｈｔｏｎｒｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌｆｒａｍｅｗｏｒｋｉｎＷｅｓｔｅｒｎＣｈｉ
ｎａ．ＡｃｔａＰｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｅＳｉｎｉｃａ，２００２，１１（１）：１３．
［６］　ＦｒｅｅｍａｎＡＪ，ＡｆｔａｂＭ．ＥｆｆｅｃｔｉｖｅｍａｎａｇｅｍｅｎｔｏｆｖｉｒｕｓｅｓｉｎｐｕｌｓｅｃｒｏｐｓｉｎｓｏｕｔｈｅａｓｔｅｒｎＡｕｓｔｒａｌｉａｓｈｏｕｌｄｉｎｃｌｕｄｅｍａｎａｇｅｍｅｎｔｏｆｗｅｅｄｓ．Ａｕｓ
ｔｒａｌａｓｉａｎＰｌａｎｔＰａｔｈｏｌｏｇｙ，２０１１，４０：４３０４４１．
［７］　ＳｔｕｔｅｖｉｌｅＤＬ，ＥｒｗｉｎＤＣ（ｅｄ．）．ＣｏｍｐｅｎｄｉｕｍｏｆＡｌｆａｌｆａＤｉｓｅａｓｅｓ，２ｎｄｅｄｎ［Ｍ］．Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ，ＵＳＡ：ＡＰＳＰｒｅｓｓ，１９９０：５１５３．
［８］　ＣａｉＦＸ，ＭａｎｇＫＱ．ＳｔｕｄｙｏｆａｌｆａｌｆａｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓｉｓｏｌａｔｅＨ１０Ｉ．Ｔｈｅｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｐｈｙｓｉｃａｌ，ｃｈｅｍｉｃａｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．
ＡｃｔａＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａＳｉｎｉｃａ，１９８２，２２（３）：２３３２４０．
［９］　ＺｈａｎｇＸＬ，ＹｉｎＹＱ，ＬｉＧＹ，犲狋犪犾．Ｓｔｕｄｙｏｎｂｅａｎｙｅｌｏｗｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍａｌｆａｌｆａ．ＶｉｒｏｌｏｇｉｃａＳｉｎｉｃａ，１９９０，（１）：８８９６．
［１０］　ＺｈａｎｇＸＬ，ＹｉｎＹＱ，ＣｕｉＸＭ，犲狋犪犾．ＳｔｕｄｉｅｓｏｆＣｏｗｐｅａｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓｏｎａｌｆａｌｆａ．ＡｃｔａＰｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａＳｉｎｉｃａ，１９９４，２４（１）：６９７５．
［１１］　ＳｈａｎｇＷＪ．ＡｌｆａｌｆａｌｅａｆｄｉｓｅａｓｅｓｕｒｖｅｙａｎｄｐａｔｈｏｇｅｎｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｉｎＮｉｎｇｘｉａ．ＰｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅ，１９９７，１４（１）：２３２５．
［１２］　ＷａｎｇＸＷ，ＹｕＮＬ，ＭａＤＣ．ＴｈｅｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙｓｔｕｄｙｏｆｔｈｅｔｙｐｅｓａｎｄｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓｏｆｌｕｃｅｒｎｅｄｉｓｅａｓｅｉｎＸｉｎｊｉａｎｇ．ＡｃｔａＰｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｅＳｉｎｉｃａ，
１９９８，７（２）：４８５２．
［１３］　ＮａｎＺＢ．ＬｕｃｅｒｎｅｄｉｓｅａｓｅｓｆｏｕｎｄｉｎＣｈｉｎａａｎｄｔｈｅｉｒｉｎｔｅｇｒａｔｅｄｍａｎａｇｅｍｅｎｔｓｙｓｔｅｍ．ＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ，２００１，１８（４）：
１４．
［１４］　ＣｌａｒｋＭＦ，ＡｄａｍｓＡＮ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｔｈｅｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｍｅｔｈｏｄｏｆｅｎｚｙｍｅｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｐｌａｎｔｖｉｒｕｓｅｓ．
ＪｏｕｒｎａｌｏｆＧｅｎｅｒａｌＶｉｒｏｌｏｇｙ，１９７７，３４（３）：４７５４８５．
［１５］　ＬｅｔｓｃｈｅｒｔＢ，ＡｄａｍＧ，ＬｅｓｅｍａｎｎＤＥ，犲狋犪犾．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｙｃｒｏｓｓｒｅａｃｔｉｎｇｔｏｂａｍｏｖｉｒｕｓｅｓｏｆｅｃｏｎｏｍｉｃａｌｉｍｐｏｒ
ｔａｎｃｅｂｙＲＴＰＣＲａｎｄＲＴＰＣＲＲＦＬＰ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｉｒｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ，２００２，１０６：１１０．
［１６］　ＸｕＨ，ＮｉｅＪ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＡｌｆａｌｆａｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓｉｎｐｏｔａｔｏ．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２００６，９６：１２３７１２４２．
［１７］　ＨａｍｍｏｎｄＪ，ＨａｍｍｏｎｄＲＷ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ，ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎ犈狊犮犺犲狉犻犮犺犻犪犮狅犾犻ｏｆｔｈｅｂｅａｎｙｅｌｏｗｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓｃｏａｔｐｒｏｔｅｉｎ
５２１第４期 文朝慧　等：甘肃省张掖地区苜蓿花叶病病原的检测
ｇｅｎｅ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＧｅｎｅｒａｌＶｉｒｏｌｏｇｙ，１９８９，７０：１９６１１９７４．
［１８］　ＳｔｒａｓｓｅｒＭ，ＰｆｉｔｚｎｅｒＡＪ．ＴｈｅｄｏｕｂｌｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｂｒｅａｋｉｎｇＴｏｍａｔｏｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓｓｔｒａｉｎＴｏＭＶ１２ｃｏｎｔａｉｎｓｔｗｏｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｓｉｎｇｌｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ
ｂｒｅａｋｉｎｇｄｏｍａｉｎｓ．ＡｒｃｈｉｖｅｓｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙ，２００７，１５２（５）：９０３９１４．
［１９］　ＰａｒｒｅｌａＧ，ＡｃａｎｆｏｒａＮ，ＢｅｌａｒｄｉＭＧ．Ｆｉｒｓｔｒｅｃｏｒｄａｎｄｃｏｍｐｌｅｔｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆ犃犾犳犪犾犳犪犿狅狊犪犻犮ｖｉｒｕｓｆｒｏｍ犔犪狏犪狀犱狌犾犪狊狋狅犲犮犺犪狊ｉｎＩｔａ
ｌｙ．ＰｌａｎｔＤｉｓｅａｓｅ，２０１０，９４（７）：９２４９２４．
［２０］　ＨｅｍｍａｔｉＫ，ＭｃｌｅａｎＤＬ．Ｇａｍｅｔｅｓｅｅｄｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎｏｆ犪犾犳犪犾犳犪犿狅狊犪犻犮ｖｉｒｕｓａｎｄｉｔｓｅｆｆｅｃｔｏｎｓｅｅｄｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎａｎｄｙｉｅｌｄｏｆａｌｆａｌｆａｐｌａｎｔｓ．Ｐｈｙ
ｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１９７７，６７：５７６５７９．
［２１］　ＯｈｋｉＳＴ，ＬｅｐｓＷＴ，ＨｉｒｕｋｉＣ．ＥｆｆｅｃｔｓｏｆａｌｆａｌｆａｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎｏｎｆａｃｔｏｒｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｓｙｍｂｉｏｔｉｃＮ２ｆｉｘａｔｉｏｎｉｎａｌｆａｌｆａ．Ｃａｎａｄｉａｎ
ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｌａｎｔＰａｔｈｏｌｏｇｙ，１９８６，８：２７７２８１．
［２２］　ＴｕＪＣ，ＨｏｌｍｅｓＴＭ．Ｅｆｆｅｃｔｏｆａｌｆａｌｆａｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎｏｎｎｏｄｕｌａｔｉｏｎ，ｆｏｒａｇｅｙｉｅｌｄ，ｆｏｒａｇｅｐｒｏｔｅｉｎａｎｄｏｖｅｒｗｉｎｔｅｒｉｎｇｏｆａｌｆａｌｆａ．Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆＰｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１９８０，９７（１）：１９．
［２３］　ＨｏｌｉｎｇｓＭ，ＨｕｔｔｉｎｇａＨ．ＴｏｍａｔｏＭｏｓａｉｃＶｉｒｕｓ．ＤｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓｏｆＰｌａｎｔＶｉｒｕｓｅｓ［Ｍ］．Ｋｅｗ，Ｅｎｇｌａｎｄ：ＣｏｍｍｏｎｗｅａｌｔｈＭｙｃｏｌｏｇｙＩｎｓｔｉｔｕｔｅ／Ａｓ
ｓｏｃｉａｔｉｏｎｆｏｒＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｌｏｇｙ，１９７６．
［２４］　ＢｒｕｎｔＡＡ．ＴｏｍａｔｏＭｏｓａｉｃＶｉｒｕｓ．Ｉｎ：ＶａｎＲｅｇｅｎｍｏｒｔｅｌＭＨＶ，ＦｒａｅｎｋｅｌＣｏｎｒａｔＨ，ｅｄｓ．ＴｈｅＰｌａｎｔＶｉｒｕｓｅｓ．Ｖｏ１．２［Ｍ］．ＮｅｗＹｏｒｋ：Ｐｌｅ
ｎｕｍＰｒｅｓｓ，１９８６：１８１２０３．
［２５］　ＺｈｏｕＸＰ，ＱｉａｎＸＨ，ＬｉｕＹ，犲狋犪犾．ＳｔｕｄｉｅｓｏｆＴｏｍａｔｏｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓｏｎｔｏｍａｔｏ．ＶｉｒｏｌｏｇｉｃａＳｉｎｉｃａ，１９９６，１（３）：２６８２７６．
［２６］　ＺｈｏｕＸＰ，ＸｕｅＺＹ，ＬｉｕＹ，犲狋犪犾．ＢｉｏｌｏｇｙａｎｄｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆＴｏＭＶｔｏｍａｔｏｉｓｏｌａｔｅａｎｄＴＭＶｂｒｏａｄｂｅａｎｉｓｏｌａｔｅａｎｄｓｐｅｃｉｆｉｃｄｅｔｅｃ
ｔｉｏｎｗｉｔｈｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ．ＡｃｔａＰｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａＳｉｎｉｃａ，１９９７，２７（１）：５３５８．
［２７］　ＹｕＣ，ＷｕＪＸ，ＺｈｏｕＸＰ．ＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｔｏＴｏｍａｔｏｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎｖｉｒｕｓｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．ＡｃｔａＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａ
Ｓｉｎｉｃａ，２００２，４２（４）：４５３４５７．
［２８］　ＹｕａｎＱＨ．ＡｄｖａｎｃｅｓｉｎａｌｆａｌｆａｄｉｓｅａｓｅｓｉｎＣｈｉｎａ．ＰｌａｎｔＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎ，２００７，３３（１）：６１０．
［２９］　ＨｕｌＲ．Ｍａｔｔｈｅｗｓ’ＰｌａｎｔＶｉｒｏｌｏｇｙ，４ｔｈｅｄｎ［Ｍ］．Ｂｅｉｊｉｎｇ：ＳｃｉｅｎｃｅＰｒｅｓｓ，２００７：７３６．
［３０］　ＷｅｎＺＨ，ＬｉｕＹＬ，ＬｉｕＱ，犲狋犪犾．ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｖｉｒｕｓｅｓｉｎｆｅｃｔｉｎｇｔｏｍａｔｏｉｎＨｅｘｉｒｅｇｉｏｎｏｆＧａｎｓｕＰｒｏｖｉｎｃｅ．ＡｃｔａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｅＢｏｒｅａｌｉｏｃｃｉ
ｄｅｎｔａｌｉｓＳｉｎｉｃａ，２００９，１８（６）：２９１２９４．
参考文献：
［１］　耿华珠，吴永敷，曹致中．中国苜蓿［Ｍ］．北京：中国农业出版社，１９９５：１５０．
［２］　谢开云，赵云，李向林，等．豆－禾混播草地种间关系研究进展．草业学报，２０１３，２２（３）：２８４２９６．
［３］　杨世琦，孙兆敏，杨雄平．发展苜蓿草产业促进西北干旱地区农业结构调整．西北农业学报，２００３，１２（４）：１５７１６０．
［４］　曹莉，秦舒浩，张俊莲，等．轮作豆科牧草对连作马铃薯田土壤微生物菌群及酶活性的影响．草业学报，２０１３，２２（３）：１３９１４５．
［５］　任继周．藏粮于草施行草地农业系统———西部农业结构改革的一种设想．草业学报，２００２，１１（１）：１３．
［８］　蔡发兴，莽克强．北京苜蓿花叶病毒 Ｈ１０分离物的研究Ⅰ．病毒的生物学测定、提纯及其理化性质．微生物学报，１９８２，２２（３）：２３３２４０．
［９］　张祥林，尹玉琦，李国英，等．菜豆黄色花叶病毒（ＢＹＭＶ）－新疆苜蓿分离株的鉴定．病毒学杂志，１９９０，（１）：８８９６．
［１０］　张祥林，尹玉琦，崔星明，等．侵染苜蓿的豇豆花叶病毒的研究．植物病理学报，１９９４，２４（１）：６９７５．
［１１］　商文静．宁夏紫花苜蓿叶部病害调查和病原菌鉴定．草业科学，１９９７，１４（１）：２３２５．
［１２］　王雪薇，喻宁莉，马德成．新疆苜蓿病害的种类和分布的初步研究．草业学报，１９９８，７（２）：４８５２．
［１３］　南志标．我国的苜蓿病害及其综合防治体系．动物科学与动物医学，２００１，１８（４）：１４．
［２５］　周雪平，钱秀红，刘勇，等．侵染番茄的番茄花叶病毒的研究．中国病毒学，１９９６，１（３）：２６８２７６．
［２６］　周雪平，薛朝阳，刘勇，等．番茄花叶病毒番茄分离物与烟草花叶病毒蚕豆分离物生物学、血清学比较及ＰＣＲ特异性检测．植物病理学报，
１９９７，２７（１）：５３５８．
［２７］　于翠，吴建祥，周雪平．番茄花叶病毒单克隆抗体的制备及检测应用．微生物学报，２００２，４２（４）：４５３４５７．
［２８］　袁庆华．我国苜蓿病害研究进展．植物保护，２００７，３３（１）：６１０．
［２９］　赫尔Ｒ．马修斯植物病毒学（原书第４版）［Ｍ］．北京：科学出版社，２００７：７３６．
［３０］　文朝慧，刘雅莉，刘箐，等．甘肃河西地区番茄病毒病病原种类鉴定．西北农业学报，２００９，１８（６）：２９１２９４．
６２１ 草　业　学　报 第２４卷