全 文 :书犇犗犐:10.11686/犮狔狓犫20150414 犺狋狋狆://犮狔狓犫.犾狕狌.犲犱狌.犮狀
文朝慧,南志标.甘肃省张掖地区苜蓿花叶病病原的检测.草业学报,2015,24(4):121126.
WenZH,NanZB.Detectionofpathogenicorganismsin犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪inZhangye,GansuProvince.ActaPrataculturaeSinica,2015,24(4):
121126.
甘肃省张掖地区苜蓿花叶病病原的检测
文朝慧1,2,南志标1
(1.兰州大学草地农业科技学院,草地农业生态系统国家重点实验室,甘肃 兰州730020;2.甘肃出入境检验检疫局,甘肃 兰州730010)
摘要:2011年7月在甘肃省张掖地区发现发生花叶病的苜蓿田块,地块中病株呈现黄斑花叶、叶柄扭曲及整株矮化
的症状。为明确其病原,采集病株后利用血清学和分子生物学方法对病样进行了检测。DAS-ELISA、RT-PCR
-RFLP及病毒CP基因序列测定分析结果表明,苜蓿病样受到番茄花叶病毒(Tomatomosaicvirus,ToMV)和苜
蓿花叶病毒(Alfalfamosaicvirus,AMV)的复合侵染。这是国际上首次报道番茄花叶病毒对苜蓿的侵染,讨论了由
这两种病毒引致病害的发生与防治。
关键词:苜蓿;番茄花叶病毒;苜蓿花叶病毒;病毒病
犇犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳狆犪狋犺狅犵犲狀犻犮狅狉犵犪狀犻狊犿狊犻狀犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪犻狀犣犺犪狀犵狔犲,犌犪狀狊狌犘狉狅狏犻狀犮犲
WENZhaoHui1,2,NANZhiBiao1
1.犆狅犾犾犲犵犲狅犳犘犪狊狋狅狉犪犾犃犵狉犻犮狌犾狋狌狉犪犾犛犮犻犲狀犮犲犪狀犱犜犲犮犺狀狅犾狅犵狔,犛狋犪狋犲犓犲狔犔犪犫狅狉犪狋狅狉狔狅犳犌狉犪狊狊犾犪狀犱犃犵狉狅犈犮狅狊狔狊狋犲犿狊,犔犪狀狕犺狅狌犝狀犻
狏犲狉狊犻狋狔,犔犪狀狕犺狅狌730020,犆犺犻狀犪;2.犌犪狀狊狌犈狓犻狋犈狀狋狉狔犐狀狊狆犲犮狋犻狅狀犪狀犱犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲犅狌狉犲犪狌,犔犪狀狕犺狅狌730010,犆犺犻狀犪
犃犫狊狋狉犪犮狋:Two犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪plantswithsevereleafmosaicsymptomswerecolectedfromalfalfafieldsin
LinzeCounty,GansuProvince,inJuly2011.Thetwosamplesweretestedbyenzymelinkedimmunosorbent
assay(ELISA)andreversetranscriptionpolymerasechainreaction(RT-PCR).Thetestedspecimenswere
negativeforCucumbermosaicvirus,Tobaccostreakvirus,Watermelonmosaicvirus,PotatovirusX,Potato
virusY,Tobaccoringspotvirus,TomatoringspotvirusandBeanyelowmosaicvirus.However,Tomatomo
saicvirus(ToMV)andAlfalfamosaicvirus(AMV)weredetected.The687and351bpfragmentsobtained
fromPCRwithappropriatespeciesspecificToMVandAMVprimersshowed99%nucleotidesimilaritywith
publishedToMVCPandAMVCPgenesequences.A805bpPCRproductswasobtainedusinggenusspecific
犜狅犫犪犿狅狏犻狉狌狊primersandthepresenceofToMVwasconfirmedbyRT-PCR-RFLP.Tothebestofour
knowledge,thisisthefirstreportofToMVinalfalfa.
犓犲狔狑狅狉犱狊:犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪;Tomatomosaicvirus;Alfalfamosaicvirus;virusdisease
紫花苜蓿(犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪)是世界分布范围最广的豆科牧草,也是我国种植面积最大的人工牧草[1]。它是
我国干旱半干旱地区植被生态建设和退耕还草的重要草种,在建设和保护生态环境[2],调整种植业结构[3],保持
农业可持续发展[4]方面均具有潜在经济效益和重要的社会效益[5]。病害是苜蓿生产的主要限制因素之一,苜蓿
被植物病毒侵染后发生病毒病,表现花叶、矮缩或畸形等症状,产量降低,难以越冬。由于生产中应用的大多数苜
第24卷 第4期
Vol.24,No.4
草 业 学 报
ACTAPRATACULTURAESINICA
2015年4月
April,2015
收稿日期:20131011;改回日期:20131216
基金项目:公益性行业(农业)科技专项(No.201303057),国家质检总局科技计划项目(2012IK270)和甘肃出入境检验检疫局科技计划项目
(2011GK001)资助。
作者简介:文朝慧(1969),女,四川简阳人,高级农艺师,在读博士。Email:wzhhli@163.com
通讯作者Correspondingauthor.Email:zhibiao@lzu.edu.cn
蓿品种为多年生品种,病毒的多年积累使苜蓿感染病毒病后田间发病率较高,而病毒病的发生也增加了其他病害
的发生率,对苜蓿的产量和饲用价值都有较大的影响。另一方面,苜蓿作为植物病毒的多年生活体寄主,为病原
物及其介体昆虫度过不良环境提供了场所,有利于病原物扩散并侵染其他作物[6],造成农作物的产量损失。
根据国内外的研究报道,至少有31种植物病毒可以侵染苜蓿[7],在我国,蔡发兴和莽克强[8]分离了北京苜蓿
花叶病毒(Alfalfamosaicvirus,AMV)H10,并对其生物学特性进行了研究;张祥林等[9]在新疆苜蓿上分离鉴定
了菜豆黄花叶病毒(Beanyelowmosaicvirus,BYMV)和豇豆花叶病毒(Cowpeamosaicvirus,CPMV)[10],对其
生物学特性、血清学和病毒衣壳蛋白亚基组成及分子量进行了研究。商文静[11]、王雪薇等[12]的调查表明,苜蓿
花叶病在宁夏、新疆等苜蓿产区发生普遍,严重影响苜蓿的产量和品质。目前随着苜蓿种植面积的扩大,病害问
题日益引起生产者的重视,但对病毒引致的病害研究较少[13],因此有必要对苜蓿病毒病在病原学、发病规律及防
治措施等方面进行深入而系统的研究。
2011年7月在甘肃省张掖市临泽县农户院落附近的紫花苜蓿地块中,发现苜蓿植株表现黄斑花叶、矮化等
病毒病症状。为明确其病原,采用双抗体夹心酶联免疫吸附分析(DAS-ELISA)及反转录聚合酶链式反应
(RT-PCR)方法对病样进行了检测,以期明确病原,为当地苜蓿病毒病的综合防治提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
病样于2011年7月苜蓿成熟期采自甘肃省张掖市临泽县,苜蓿品种为农家品种,主要症状表现为黄斑花叶、
叶柄扭曲及植株矮化,采样地块的苜蓿发病率达100%。
采样地位于东经E100°15′,北纬N39°06′,海拔1410m,年均温7.1℃,年降水量121mm,多集中在7-9
月。土壤类型为沙壤。在发病地块随机采集苜蓿黄斑花叶病株共2份,编号为AS1、AS2,置于洁净塑料袋中,保
存于4℃冰箱备用。
1.2 血清学检测
参考Clark和Adams[14]的方法,采用 DAS-ELISA(Agdia,美国)对2份病样分别进行烟草花叶病毒(To
baccomosaicvirus,TMV)、AMV、黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaicvirus,CMV)、烟草线条病毒(Tobacco
streakvirus,TSV)、西瓜花叶病毒(Watermelonmosaicvirus,WMV)、番茄花叶病毒(Tomatomosaicvirus,
ToMV)、马铃薯X病毒(PotatovirusX,PVX)、马铃薯Y病毒(PotatovirusY,PVY)、烟草环斑病毒(Tobacco
ringspotvirus,TRSV)和番茄环斑病毒(Tomatoringspotvirus,ToRSV)等10种病毒的检测。阳性对照样品购
自美国Agdia公司,阴性对照为健康苜蓿植株,以缓冲液为空白对照。用ThermoLabSystems酶标仪在405nm
处检测各反应孔的吸收值。被测样品OD值/阴性对照OD值>2.1时判定为阳性反应。
1.3 RT-PCR检测
参照文献[1517]分别合成烟草花叶病毒属(犜狅犫犪犿狅狏犻狉狌狊)病毒CP基因的通用引物,ToMV、TMV、AMV
和菜豆黄花叶病毒(BYMV)的CP基因特异性引物(表1),引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。
利用RNA提取试剂TRIzol(Invitrogen,美国)提取苜蓿叶片总RNA。称取0.1g叶片,液氮研细,移入1.5
mL离心管中,加入1mL的TRIzol,混匀,4℃12000r/min离心10min,将上清液转入另一新离心管中;加0.5
mL氯仿,剧烈振荡15s;4℃12000r/min离心15min;将上层水相转移到新离心管中,加等体积异丙醇,上下颠
倒混匀;室温静置15min;4℃12000r/min离心10min,弃上清,加入75%的乙醇洗涤沉淀,然后4℃7500
r/min离心5min,弃乙醇;室温干燥沉淀5~10min,加入30μL焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解沉淀,-70℃保存
备用。
取叶片总RNA及目的基因的下游引物合成cDNA。反转录总反应体系20μL,先加入叶片总RNA2μL、
DEPCH2O10μL、20μmol/L下游引物1μL,70℃温育5min后,冰上放置2min,再加入5×RTBuffer4μL、
10mmol/LdNTP1μL、40U/μLRNasin1μL、200U/μLMMLV酶1μL(TaKaRa,大连),37℃反应1h后,
-20℃保存备用。
221 草 业 学 报 第24卷
参照文献[1214]分别扩增样品组织中的5种目
的基因:犜狅犫犪犿狅狏犻狉狌狊属病毒的犆犘 基因、ToMV 的
犆犘基因、TMV 的 犆犘 基因、AMV 的 犆犘 基因或
BYMV的犆犘基因。PCR扩增反应体系25μL,包括
10×PCRbuffer2.5μL、5U/μLTaq酶0.2μL、20
μmol/L上、下游引物各0.5μL、2.5mmol/LdNTP
1.0μL、cDNA3μL、ddH2O17.3μL。扩增条件为:
94℃3min;94℃30s、54℃40s、72℃1min,30个循
环;72℃8min。取8μLPCR产物进行1%琼脂糖凝
胶(含EB0.5μL/mL)电泳,电泳结束后凝胶成像仪
记录结果。
PCR产物用纯化试剂盒(TaKaRa,大连)纯化后,
直接用于测序,测序由宝生物工程(大连)有限公司进
表1 本实验所用引物的序列
犜犪犫犾犲1 犜犺犲狊犲狇狌犲狀犮犲狊狅犳狋犺犲狆狉犻犿犲狉狊狌狊犲犱犻狀狋犺犻狊狊狋狌犱狔
引物编号
Primerpair
引物序列(5′-3′)
Sequence(5′-3′)
扩增片段
Amplicon(bp)
TobUni1 ATTTAAGTGGASGGAAAAVCACT 805
TobUni2 GTYGTTGATGAGTTCRTGGA
TMVF CGGTCAGTGCCGAACAAGAA 695
ToMVF CGGAAGGCCTAAACCAAAAAG 687
AMVF CCATCATGAGTTCTTCACAAA 351
AMVR TCGTCACGTCATCAGTGAGAC
BY1 GCCTTATGGTGTGGTGCATAG 447
BY2 CAAGCATGGTGTGCATATCACG
行。测序结果通过BLAST与GenBank中已登录的序列进行一致性比较。
1.4 RT-PCR产物限制性酶切分析
参照文献[15],采用限制性内切酶犇犱犲I(NewEnglandBiolabs,美国)酶切由犜狅犫犪犿狅狏犻狉狌狊属病毒通用引
物扩增得到的PCR产物。酶切体系20μL,包含无菌水7μL,未经纯化的PCR产物10μL,NEBBuffer2.0μL,
犇犱犲I3U,37℃酶切3h。反应产物经1.2%琼脂糖电泳检测,记录酶切图谱。
2 结果与分析
2.1 血清学检测
对采集到的2份具有典型花叶症状的苜蓿样品进行了DAS-ELISA检测。酶联免疫试剂盒检测结果为:2
份样品均与TMV和ToMV的抗血清呈阳性反应,与其他8种病毒抗血清呈阴性反应(表2)。
表2 苜蓿样品血清学检测结果
犜犪犫犾犲2 犛犲狉狅犾狅犵犻犮犪犾犱犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳犪犾犳犪犾犳犪狊犪犿狆犾犲狊
样品
Samplename
抗血清Antibodies
TRSV PVY CMV TSV WMV ToRSV PVX AMV TMV ToMV
阳性对照Positivecontrol 7.92 5.65 2.50 17.68 7.07 27.10 2.94 6.83 6.54 9.15
AS1 1.12 1.10 1.03 1.15 1.18 1.14 0.97 1.23 2.11 2.34
AS2 1.13 1.09 1.11 1.12 1.20 1.16 1.02 1.18 2.20 2.36
样品OD值/阴性对照OD值。OD405ofsamples/OD405ofnegativecontrol.
2.2 RT-PCR检测
DAS-ELISA检测结果显示,苜蓿病样与 TMV、ToMV 抗血清均呈阳性反应,为明确样品中存在的是
TMV还是ToMV,一方面参照文献[15]采用犜狅犫犪犿狅狏犻狉狌狊属病毒通用引物对病样进行RT-PCR扩增,在获得扩
增产物的基础上,对PCR扩增产物进行限制性内切酶犇犱犲I的酶切反应,根据酶切片段电泳图谱(限制性片段长
度多态性,RFLP)判断样品中存在的是TMV还是ToMV;另一方面采用TMV和ToMV的特异性引物对病样
进行RT-PCR扩增,对获得的扩增片段进行测序,通过序列比对明确样品中存在的是TMV还是ToMV。同
时,采用AMV、BYMV的特异性引物对2份苜蓿病样进行了RT-PCR检测,以判断样品中是否存在AMV和
BYMV。检测结果表明,犜狅犫犪犿狅狏犻狉狌狊属病毒通用引物从2份病样中均扩增出约0.8kb的目标条带;ToMV特
异性引物从2份病样中均扩增出约0.7kb的目标条带,健康样品和空白对照无扩增条带;TMV特异性引物未扩
321第4期 文朝慧 等:甘肃省张掖地区苜蓿花叶病病原的检测
增出目标条带;AMV特异性引物从2份病样中均扩增
图1 苜蓿花叶病样的犚犜-犘犆犚检测结果
犉犻犵.1 犜犺犲狉犲狊狌犾狋狊狅犳犚犜-犘犆犚狅犳犕.狊犪狋犻狏犪
狊犪犿狆犾犲狊狊犺狅狑犻狀犵犿狅狊犪犻犮狊狔犿狆狋狅犿狊
M:100bpDNA 分子量标准;1:TobUni1/TobUni2扩增;2:
TobUni1/ToMVF扩增;3:TobUni1/TMVF扩增;4:健康对照;
5:空白对照;6:AMVF/AMVR 扩增;7:健康对照。M:100bp
DNAmarker;1:TobUni1/TobUni2;2:TobUni1/ToMVF;3:
TobUni1/TMVF;4:Healthcontrol;5:Blankcontrol;6:AMVF/
AMVR;7:Healthcontrol.
图2 犚犜-犘犆犚扩增产物的犇犱犲犐酶切图谱
犉犻犵.2 犇犱犲犐狉犲狊狋狉犻犮狋犻狅狀犲狀犱狅狀狌犮犾犲犪狊犲犱犻犵犲狊狋犻狅狀狅犳
犚犜-犘犆犚狆狉狅犱狌犮狋狊
M:100bpDNAmarker;1:TobUni1/TMVF扩增产物;2:Tob
Uni1/ToMVF扩增产物;3:TobUni1/TMVF 扩增产物酶切;4:
TobUni1/ToMVF扩增产物酶切。1:RTPCRproductobtainedwith
TobUni1/TMVF;2:RTPCRproductobtained with TobUni1/
ToMVF;3:犇犱犲IdigestionofRT-PCRproductobtainedwithTob
Uni1/TMVF;4:犇犱犲IdigestionofRT-PCRproductobtainedwith
TobUni1/ToMVF.
出约0.35kb的目标条带,健康样品中无扩增条带(图
1,仅显示样品AS1 的电泳结果);BYMV引物未扩增
出目标条带。
取样品 AS1 的PCR产物进行测序,ToMV特异
性引物的扩增产物(GenBank序列号JX857634)包括
完整的CP基因序列,该序列与已报道[18]的ToMV德
国分离物CP基因核苷酸序列(DQ873692)的同源性
为99%,说明所测定的序列为ToMV的CP基因部分
序列;AMV扩增产物经测序及序列同源性比较,该序
列(JX857635)与已报道[19]的AMVCP基因的核苷酸
序列(FN667967)的同源性为99%、氨基酸序列的同
源性为100%,证明所测定的 DNA 片段为 AMV 的
CP基因部分序列。
2.3 酶切结果
犜狅犫犪犿狅狏犻狉狌狊属病毒通用引物扩增产物经犇犱犲I
酶切产生2个约390bp的酶切片段(图2)。根据文献
[15],犜狅犫犪犿狅狏犻狉狌狊属病毒通用引物扩增产物经犇犱犲
I酶切后,ToMV产生大小为395bp,394bp的2个片
段,而TMV 产生大小为260bp,475bp或327bp,
475bp的2个片段,因此,由酶切图谱可判断出,样品
中扩增到的DNA片段是ToMV的部分片段。
3 讨论
本研究采用DAS-ELISA和RT-PCR方法检
测出甘肃省张掖地区的苜蓿花叶病株受到 AMV和
ToMV侵染。AMV为苜蓿花叶病毒属(犃犾犳犪犿狅狏犻狉
狌狊)病毒,能自然侵染51科双子叶植物的430余种栽
培及野生植物,如苜蓿、三叶草(犜狉犻犳狅犾犻狌犿狉犲狆犲狀狊)、豌
豆(犘犻狊狌犿狊犪狋犻狏狌犿)、大豆(犌犾狔犮犻狀犲犿犪狓)、豇豆(犞犻犵
狀犪狌狀犵狌犻犮狌犾犪狋犪)、马铃薯(犛狅犾犪狀狌犿狋狌犫犲狉狅狊狌犿)、烟草
(犖犻犮狅狋犻犪狀犪狋犪犫犪犮狌犿)、辣椒(犆犪狆狊犻犮狌犿犪狀狀狌狌犿)、番茄
(犛狅犾犪狀狌犿犾狔犮狅狆犲狉狊犻犮狌犿)和芹菜(犃狆犻狌犿犵狉犪狏犲狅犾犲狀狊)
等。该病毒易经汁液摩擦传播,菟丝子 (犆狌狊犮狌狋犪
犮犺犻狀犲狀狊犻狊)可传毒,可被至少14种蚜虫以非持久方式
传播,在苜蓿、大豆、辣椒上可以种传,苜蓿的种传率为
10%[20]。苜蓿感染AMV后,根瘤菌根瘤数量减少、体积缩小、鲜重降低,植株的固氮作用水平降低[21]。Tu和
Holmes[22]的田间及温室实验表明,受AMV侵染后,苜蓿饲草产量和粗蛋白含量减少,越冬成活率降低。
ToMV为犜狅犫犪犿狅狏犻狉狌狊属病毒,过去曾被认为是TMV的一个株系,自1971年以后从TMV中划出,成为独
立的病毒种[23]。该病毒寄主范围广,能侵染茄科(Solanaceae)、十字花科(Brassicaceae)、禾本科(Poaceae)、藜科
(Chenopodiaceae)、豆科(Fabaceae)等多种植物[24],主要通过汁液机械传播及种子带毒传播。ToMV与TMV同
为犜狅犫犪犿狅狏犻狉狌狊成员,二者碱基序列相似程度高,在多种寄主上产生相同的症状,有着较密切的血清学关系,单
421 草 业 学 报 第24卷
纯使用多抗血清难以区分。目前利用单克隆抗体制备技术和RT-PCR技术,已可快速可靠地区分ToMV和
TMV。周雪平等[2526]从杭州番茄上分离鉴定了ToMV,并对其与TMV的差异进行了系统的比较研究。于翠
等[27]通过制备单克隆抗体区分了ToMV和TMV。Letschert等[15]采用通用引物的RT-PCR-RFLP方法及
特异性引物的RT-PCR方法,在种的水平区分了包括TMV和ToMV在内的犜狅犫犪犿狅狏犻狉狌狊属中具有血清学关
系的5种病毒。本实验参照Letschert等[15]的方法,采用犜狅犫犪犿狅狏犻狉狌狊属病毒通用引物的RT-PCR-RFLP及
特异性引物的RT-PCR两种方法对样品进行检测,证明该苜蓿样品感染了ToMV。
花叶病是苜蓿的重要病害,在我国西北、华北地区发生较为普遍,宁夏苜蓿花叶病发病率达50%以上[11],造
成鲜草损失和种子减产。受病毒感染的苜蓿植株不仅产量和质量下降,还成为终生传毒者[28]。目前尚无防治病
毒病的化学药剂,主要采用降低作物内外的侵染源、限制介体的扩散以及降低病毒病对作物产量带来的损失等手
段控制病毒病。因此,确定侵染作物的病毒种类,对于实施有效的病毒控制措施十分关键,仅仅靠症状来诊断会
引起误导[29]。
病毒的外壳蛋白(CP)起着保护核酸的作用,含有抗原决定簇,决定着病毒的抗原特异性,在病毒的侵染过程
中对寄主细胞具有识别作用[30],已广泛应用于植物病毒的检测。本实验中采用DAS-ELISA方法未在样品中
检出AMV,但经 RT-PCR扩增 AMV 的CP基因片段并通过测序分析,检测出病样感染了 AMV,DAS-
ELISA的阴性结果可能与该批次检测抗血清的灵敏度有关。
本研究在苜蓿花叶病病样中检出ToMV,但已发表文献中尚未有ToMV侵染苜蓿的报道,由于所研究苜蓿
样品采集于甘肃省河西地区蔬菜瓜果种植区,该地区的茄科植物存在有ToMV的侵染危害[31],这可能是苜蓿样
品病毒的侵染来源。本研究仅对病毒病病原进行了血清学和分子生物学检测,限于采样范围及样品数量,研究结
果具有一定的局限性,下一步将对病毒病毒原进行人工接种、地理分布等生物学特性研究及病毒提纯、电镜观察
等实验,以进一步确认其分类地位,为当地合理有效地进行苜蓿病毒病的防治和检测提供参考。
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621 草 业 学 报 第24卷