全 文 ：核 农 学 报摇 圆园员猿袁圆苑渊圆冤院园员缘愿 耀 园员远苑
允燥怎则灶葬造 燥枣 晕怎糟造藻葬则 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 杂糟蚤藻灶糟藻泽
收稿日期院圆园员圆鄄园猿鄄园怨摇 接受日期院圆园员圆鄄园缘鄄园苑
基金项目院国家转基因专项课题渊圆园园怨在载园愿园园怨鄄员圆圆月冤袁苹果产业技术体系渊悦粤砸杂鄄圆愿冤
作者简介院卢彬彬渊员怨愿源鄄冤袁女袁河北保定人袁硕士袁研究方向为果树逆境生理与分子生物学遥 栽藻造院园员园鄄远圆愿员缘猿猿园曰耘鄄皂葬蚤造院造怎遭蚤灶遭蚤灶援 圆园园愿岳 员远猿援 糟燥皂
通讯作者院韩振海渊员怨远猿鄄冤袁男袁陕西西安人袁教授袁研究方向为果树逆境生理与分子生物学遥 栽藻造院园员园鄄远圆苑猿圆源远苑曰耘鄄皂葬蚤造院则泽糟澡葬灶岳 糟葬怎援 藻凿怎援 糟灶
文章编号院员园园园鄄愿缘缘员渊圆园员猿冤园圆鄄园员缘愿鄄园员
小金海棠 枣藻则则蚤贼蚤灶基因的克隆和表达分析
卢彬彬摇 王摇 忆摇 殷丽丽摇 张新忠摇 韩振海
渊中国农业大学园艺植物研究所袁北京摇 员园园员怨猿冤
摘摇 要院本试验从小金海棠渊酝葬造怎泽 曾蚤葬燥躁蚤灶藻灶泽蚤泽藻灶泽蚤泽冤中克隆得到 圆 个具有 悦阅杂全长的 枣藻则则蚤贼蚤灶基因渊员员愿圆遭责
和 怨源园遭责冤和 源 个具有 悦阅杂片段的 枣藻则则蚤贼蚤灶基因渊怨猿源遭责尧缘怨源遭责尧员园苑园遭责和 愿猿源遭责冤遥 序列分析表明它们均
具有真核生物铁蛋白保守区渊耘怎噪赃云藻则则蚤贼蚤灶冤这一典型的植物铁蛋白结构特征遥 预测蛋白质相对分子量
在 圆员郾 缘愿噪阅葬和 猿源郾 猿圆噪阅葬之间遥 进化树分析表明小金海棠的 枣藻则则蚤贼蚤灶 基因与梨的 枣藻则则蚤贼蚤灶 基因在同一进
化分支上遥 根据 择孕悦砸和半定量 砸栽鄄孕悦砸 结果袁可将小金海棠 枣藻则则蚤贼蚤灶 基因的时间表达模式划分为早期
表达型渊酝曾云藻则员冤尧晚期表达型渊酝曾云藻则圆冤尧组成表达型渊酝曾云藻则远冤和波动表达型渊酝曾云藻则猿鄄缘冤曰就组织部位
而言袁酝曾云藻则员 的表达具有组织特异性袁只在叶中特异表达袁而 酝曾云藻则圆鄄远 在根和叶中均有表达遥
关键词院铁蛋白曰克隆曰择孕悦砸曰半定量 砸栽鄄孕悦砸曰 小金海棠
悦造燥灶蚤灶早 葬灶凿 耘曾责则藻泽泽蚤燥灶 粤灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 枣藻则则蚤贼蚤灶 郧藻灶藻泽
枣则燥皂 酝葬造怎泽 曾蚤葬燥躁蚤灶藻灶泽蚤泽
蕴哉 月蚤灶鄄遭蚤灶摇 宰粤晕郧 再蚤摇 再陨晕 蕴蚤鄄造蚤摇 在匀粤晕郧 载蚤灶鄄扎澡燥灶早摇 匀粤晕 在澡藻灶鄄澡葬蚤
渊 陨灶泽贼蚤贼怎贼藻 燥枣 匀燥则贼蚤糟怎造贼怎则葬造 孕造葬灶贼袁 悦澡蚤灶葬 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 哉灶蚤增藻则泽蚤贼赠袁 月藻蚤躁蚤灶早摇 员园园员怨猿冤
粤遭泽贼则葬糟贼院云怎造造鄄造藻灶早贼澡 悦阅杂 燥枣 贼憎燥 枣藻则则蚤贼蚤灶 早藻灶藻泽 渊员员愿圆遭责 葬灶凿 怨源园遭责冤 葬灶凿 责葬则贼蚤葬造 悦阅杂 燥枣 枣燥怎则 枣藻则则蚤贼蚤灶 早藻灶藻泽 渊怨猿源遭责袁 缘怨源遭责袁 员园苑园遭责 葬灶凿
愿猿源遭责冤 憎藻则藻 糟造燥灶藻凿 枣则燥皂 酝葬造怎泽 曾蚤葬燥躁蚤灶藻灶泽蚤泽援 杂藻择怎藻灶糟藻 葬灶葬造赠泽蚤泽 泽澡燥憎藻凿 贼澡葬贼 贼澡藻赠 葬造造 糟燥灶贼葬蚤灶藻凿 耘怎噪赃云藻则则蚤贼蚤灶袁 贼澡藻 贼赠责蚤糟葬造 糟燥灶泽藻则增藻凿 凿燥皂葬蚤灶 燥枣
责造葬灶贼 枣藻则则蚤贼蚤灶援 栽澡藻 责则藻凿蚤糟贼藻凿 皂燥造藻糟怎造葬则 皂葬泽泽 燥枣 贼澡藻 凿藻凿怎糟藻凿 责则燥贼藻蚤灶泽 憎藻则藻 遭藻贼憎藻藻灶 圆员郾 缘愿噪阅葬 葬灶凿 猿源郾 猿圆噪阅葬援 韵灶 贼澡藻 遭葬泽蚤泽 燥枣 责澡赠造燥早藻灶藻贼蚤糟
葬灶葬造赠泽蚤泽袁 贼澡藻 酝援 曾蚤葬燥躁蚤灶藻灶泽蚤泽 枣藻则则蚤贼蚤灶 早藻灶藻泽 泽澡葬则藻凿 泽葬皂藻 藻增燥造怎贼蚤燥灶葬则赠 遭则葬灶糟澡 憎蚤贼澡 责藻葬则援 郧藻灶藻 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 葬灶葬造赠泽蚤泽 增蚤葬 择孕悦砸 葬灶凿 泽藻皂蚤鄄
择怎葬灶贼葬贼蚤增藻 砸栽鄄孕悦砸 泽澡燥憎藻凿 枣燥怎则 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 贼赠责藻泽院 藻曾责则藻泽泽藻凿 蚤灶 藻葬则造赠 贼蚤皂藻 渊酝曾云藻则员冤袁 藻曾责则藻泽泽藻凿 蚤灶 造葬贼藻 贼蚤皂藻 渊酝曾云藻则圆冤袁 藻曾责则藻泽泽藻凿 澡蚤早澡造赠 葬造造
贼澡藻 贼蚤皂藻 渊酝曾云藻则远冤 葬灶凿 藻曾责则藻泽泽藻凿 怎责 葬灶凿 凿燥憎灶 渊酝曾云藻则猿 耀 缘冤援 月藻泽蚤凿藻泽袁 酝曾云藻则员 憎葬泽 藻泽责藻糟蚤葬造造赠 藻曾责则藻泽泽藻凿 蚤灶 造藻葬增藻泽 憎澡蚤造藻 贼澡藻 燥贼澡藻则 早藻灶藻泽
藻曾责则藻泽泽藻凿 遭燥贼澡 蚤灶 则燥燥贼泽 葬灶凿 造藻葬增藻泽援
运藻赠 憎燥则凿泽院枣藻则则蚤贼蚤灶 早藻灶藻曰 悦造燥灶蚤灶早曰 择孕悦砸曰 杂藻皂蚤鄄择怎葬灶贼葬贼蚤增藻 砸栽鄄孕悦砸曰 酝葬造怎泽 曾蚤葬燥躁蚤灶藻灶泽蚤泽
摇 摇 铁蛋白渊 枣藻则则蚤贼蚤灶冤是一种广泛存在于植物尧动物和
微生物中贮存铁的功能蛋白袁它由 圆源 个同源或者异源
亚基组成袁分子量为 源缘园噪阅葬袁每分子铁蛋白可以储存
大约 源缘园园 个游离的 云藻猿 垣 咱员暂 遥 植物铁蛋白存在于质体
中袁具有铁存储和避免铁毒害的双重功能院其在种子形
成尧叶片衰老及环境中铁过量时积累铁袁在种子萌发和
质体绿化等过程中释放铁袁从而调节植物对铁的吸收
和释放袁维持铁的动态平衡咱圆暂 遥 此外袁铁蛋白还是一
种与胁迫反应相关的蛋白遥 研究发现在病害尧干旱以
及乙烯尧粤月粤等化学物质处理条件下袁植物体中铁蛋
白基因在转录水平增加数倍袁并合成大量的铁蛋
白咱猿 原 远暂 袁以提高植物对外界胁迫的适应能力遥 因此袁铁
蛋白基因作为提高植物铁营养及抗外界胁迫能力的候
选基因而倍受关注遥
愿缘员
摇 圆 期 小金海棠 枣藻则则蚤贼蚤灶基因的克隆和表达分析
匀赠凿藻等咱苑暂于 员怨远猿 年在动物中首次报道了铁蛋白
基因袁之后国内外分别从大豆尧拟南芥尧玉米尧水稻尧嘎
啦苹果尧皇冠梨等植物中克隆得到铁蛋白基因咱愿 原 员猿暂 袁
莱茵衣藻和团藻中的 枣藻则则蚤贼蚤灶 基因序列也相继获
得咱员源袁 员缘暂 袁 且植物铁蛋白基因的同源性较高遥 研究表
明利用转基因技术将外源铁蛋白基因导入植物体以提
高铁含量袁是缓解铁缺乏症状行之有效的方法之
一咱员远暂 遥 如将大豆铁蛋白基因分别转入莴苣和烟草后袁
均发现转基因植物的铁含量明显提高袁生长速度也较
对照快咱员苑 原 员怨暂 遥
植物铁蛋白基因的合成调控主要发生在转录水
平袁如在铁诱导条件下袁烟草铁蛋白基因的 皂砸晕粤 含
量显著增加袁而 晕贼云藻则员 基因比 晕贼云藻则圆 对铁的诱导更敏
感咱员员暂 遥 在玉米中 在皂云藻则员 受铁和还原信号调控袁而
在皂云藻则圆 受 粤月粤 诱导咱员园暂 遥 前人在玉米和拟南芥的启
动子区发现铁依赖型顺式作用元件 陨阅砸杂袁且 陨阅砸杂 是
在皂云藻则员 和 粤贼云藻则员 两个基因铁响应调控不可缺少的元
件咱圆园暂 遥 但对于 枣藻则则蚤贼蚤灶 基因的表达调控过程所涉及的
通路及这些通路中的诱导子和抑制子等一系列调控因
子尚不清楚遥
本文以铁高效基因型砧木小金海棠为试验材料袁
通过 砸栽鄄孕悦砸技术结合生物信息学方法克隆得到小金
海棠铁蛋白家族基因袁并分析这些基因的序列同源性尧
进化关系袁及时空表达特性袁为进一步探究该基因家族
的功能及利用该家族基因改良植物铁营养奠定基础遥
员摇 材料和方法
员郾 员摇 试验材料
以中国农业大学园艺植物研究所的铁高效苹果基
因型砧木小金海棠水培苗为材料袁试验过程中所用试
剂均购自 栽葬运葬砸葬公司遥
员郾 圆摇 试验方法
员郾 圆郾 员摇 植物材料培养与取样摇 小金海棠试管苗首先
在添加 园郾 缘皂早窑蕴 原员 陨月粤袁 园郾 缘皂早窑蕴 原员 远鄄月粤袁 猿豫 渊憎 辕 增冤
蔗糖和 园郾 苑豫 渊憎 辕 增冤琼脂的 酝杂 培养基上扩繁生长 员
个月遥 选择生长健壮袁高度 源糟皂 以上的试管苗转接到
添加 园郾 缘皂早窑蕴 原员 陨月粤袁 猿豫 渊憎 辕 增冤蔗糖和 园郾 苑豫 渊憎 辕 增冤
琼脂的 员 辕 圆 酝杂 培养基进行生根生长遥 当根伸长至
圆糟皂左右袁炼苗后进行水培遥 首先在半完全营养液中
培养 员 周袁然后转入完全营养液中培养 源 周左右袁完全
营养液的配方见 匀葬灶 在 匀 等咱圆员暂 遥 营养液 责匀 值为
远郾 猿袁每周换 员 次袁每天定时通气遥 生长室白天温度
圆缘益 依 圆益袁夜间 员苑益 依 圆益曰光照时长 员远澡袁光密度
员缘园园滋皂燥造窑渊皂圆窑泽冤 原员遥
选择在完全营养液中生长 员 个月左右袁长势一致
的小金海棠水培苗袁用蒸馏水冲洗 圆 次袁吸水纸擦干袁
放入缺铁营养液渊耘阅栽粤鄄晕葬云藻袁园滋皂燥造窑蕴 原员曰铁离子螯
合剂 云藻则则蚤扎蚤灶藻袁缘滋皂燥造窑蕴 原员冤中处理袁 正常供铁渊耘阅栽粤鄄
晕葬云藻袁源园滋皂燥造窑蕴 原员 冤为对照遥 分别取正常供铁及缺铁
处理 猿澡尧远澡尧员圆澡尧员凿尧圆凿尧猿凿尧源凿尧远凿和 怨凿的小金海棠的
白色初生根和成熟叶渊自顶部起的 猿 耀 远 片叶冤袁液氮
速冻后置于 原愿园益冰箱保存备用遥
员郾 圆郾 圆摇 砸晕粤提取和反转录摇 砸晕粤提取采用本实验室
改进的 悦栽粤月法咱圆圆暂 袁反转录参照 栽葬运葬砸葬试剂说明书遥
员郾 圆郾 猿摇 小金海棠 云藻则 家族基因的克隆和测序摇 利用
本实验室小金海棠转录组高通量测序结果中 怎灶蚤早藻灶藻
的功能注释袁以 枣藻则则蚤贼蚤灶为关键词进行检索获得 员圆 个序
列曰利用已报道的嘎啦苹果铁蛋白基因序列咱愿暂在金冠
基因组数据库 渊 澡贼贼责院 辕 辕 早藻灶燥皂蚤糟泽援 则藻泽藻葬则糟澡援 蚤葬泽皂葬援 蚤贼 辕
遭造葬泽贼 辕 遭造葬泽贼援 澡贼皂造冤进行 月蕴粤杂栽检索获得 员愿 条与嘎啦铁
蛋白基因具有较高相似度的序列遥 将上述序列进行同
源性比对后袁选择其中保守性高且长度较长的 远 条序
列袁利用 孕则蚤皂藻则缘郾 园 设计特异克隆引物渊表 员冤遥 以正常
生长的小金海棠根叶混合 糟阅晕粤 为模板袁进行小金海
棠 云藻则基因的 孕悦砸 扩增遥 其反应体系为院员圆郾 缘滋造 圆 伊
孕悦砸 酝蚤曾袁圆郾 园滋造渊缘园皂早窑蕴 原员冤模板袁上下游引物各 员滋蕴袁
加 凿凿匀圆 韵 至 圆缘滋蕴遥 扩增特异产物的 孕悦砸 反应条件
为院怨源益预变性 缘皂蚤灶曰怨源益变性 猿园泽袁适宜退火温度渊表
员冤下退火 猿园泽袁苑圆益延伸渊延伸时间见表 员冤袁 共 猿员 个
循环曰最后 苑圆益延伸 员园皂蚤灶遥 砸栽鄄孕悦砸 结束后袁取 缘滋造
孕悦砸产物进行琼脂糖凝胶电泳检测遥 将剩余所有扩
增产物进行电泳袁胶回收袁连接转化袁挑斑摇菌和测序袁
方法参照叶分子克隆实验指南曳遥
员郾 圆郾 源摇 摇 序列分析 摇 使用 晕悦月陨 提供的蛋白保守区
数据库 渊 悦阅阅冤进行保守结构域预测 渊 澡贼贼责院 辕 辕 憎憎憎援
灶糟遭蚤援 灶造皂援 灶蚤澡援 早燥增 辕 杂贼则怎糟贼怎则藻 辕 糟凿凿 辕 凿燥糟泽 辕 糟凿凿 赃 泽藻葬则糟澡援
澡贼皂造冤曰使用 晕悦月陨提供的 韵砸云 云蚤灶凿藻则 进行开放阅读框
预测渊澡贼贼责院 辕 辕 憎憎憎援 灶糟遭蚤援 灶造皂援 灶蚤澡援 早燥增 辕 早燥则枣 辕 早燥则枣援 澡贼皂造冤曰
使用 悦造怎泽贼葬造载 进行多序列比对曰使用 酝藻早葬源郾 园 构建进
化树曰使用 耘曾孕粤杂再在线软件计算蛋白的理论相对分
子质量尧等电点尧正负电荷残基总数及不稳定系数遥
员郾 圆郾 缘摇 小金海棠 云藻则家族基因的表达分析摇 采用 砸栽鄄
孕悦砸和 择孕悦砸技术进行 云藻则 家族基因的表达分析遥 取
反转录合成的对照和缺铁处理 猿澡尧远澡尧员圆澡尧员凿尧圆凿尧猿凿尧
源凿尧远凿尧怨凿的小金海棠白色初生根尧成熟叶 糟阅晕粤 为模
板袁采用表 圆 所示引物和 茁鄄粤糟贼蚤灶 内参引物进行 砸栽鄄
孕悦砸分析遥 反应程序为院怨源益预变性 缘皂蚤灶曰怨源益变性
怨缘员
核摇 农摇 学摇 报 圆苑 卷
猿园泽袁适宜退火温度下退火 猿园泽袁苑圆益延伸 猿园泽袁 共 圆缘 个
循环曰最后 苑圆益延伸 员园皂蚤灶遥 反应体系与小金海棠 云藻则
基因相同遥
表 员摇 小金海棠 云藻则基因家族扩增引物
栽葬遭造藻员摇 孕则蚤皂藻则泽 怎泽藻凿 枣燥则 糟造燥灶蚤灶早
基因名
郧藻灶藻 灶葬皂藻
目标片
段长度
栽葬则早藻贼 造藻灶早贼澡渊遭责冤
引物名称
孕则蚤皂藻则 灶葬皂藻
引物序列渊缘忆 原 猿忆冤
孕则蚤皂藻则 泽藻择怎藻灶糟藻
渊枣则燥皂 缘忆 贼燥 猿忆冤
孕悦砸反应的退火温度
和延伸时间
粤灶灶藻葬造蚤灶早 贼藻皂责藻则葬贼怎则藻 葬灶凿
藻曾贼藻灶泽蚤燥灶 造藻灶早贼澡 燥枣 孕悦砸
酝曾云藻则员 员员愿圆 酝曾云藻则员鄄云
酝曾云藻则员鄄砸
粤郧粤粤悦粤郧悦粤粤粤粤悦郧粤郧粤栽栽粤栽栽
栽栽悦粤粤粤悦栽悦栽悦栽栽悦栽栽栽悦悦粤粤栽悦粤悦
缘源益袁员皂蚤灶猿园泽
酝曾云藻则圆 怨源园 酝曾云藻则圆鄄云
酝曾云藻则圆鄄砸
粤栽郧悦栽栽悦栽悦粤粤粤郧悦悦栽悦栽郧悦粤郧
悦粤郧悦栽粤悦粤粤栽悦粤粤悦郧悦粤悦悦粤郧
远园益袁员皂蚤灶
酝曾云藻则猿 怨猿源 酝曾云藻则猿鄄云
酝曾云藻则猿鄄砸
悦栽悦粤悦栽悦粤粤粤悦悦悦栽悦悦粤栽栽栽悦悦栽悦
栽悦粤悦郧悦栽郧悦粤粤悦粤郧悦粤栽悦悦悦悦郧栽栽郧
缘愿益袁员皂蚤灶
酝曾云藻则源 员园苑园 酝曾云藻则源鄄云
酝曾云藻则源鄄砸
悦栽郧郧栽栽栽栽栽栽悦栽悦栽郧悦栽栽悦栽悦栽郧粤悦
郧粤粤粤郧郧粤栽粤粤郧栽粤郧栽栽悦粤悦粤粤郧悦栽郧悦粤栽
缘愿益袁员皂蚤灶员缘泽
酝曾云藻则缘 缘怨源 酝曾云藻则缘鄄云
酝曾云藻则缘鄄砸
粤栽郧悦栽栽悦栽悦粤粤粤郧悦悦栽悦栽郧悦粤郧悦悦
悦栽粤粤悦悦粤栽粤悦粤粤粤郧悦粤栽悦栽悦悦栽栽栽悦栽悦栽郧郧
缘源益袁源缘泽
酝曾云藻则远 愿猿源 酝曾云藻则远鄄云
酝曾云藻则远鄄砸
粤栽郧悦栽栽悦栽悦粤粤粤郧悦悦栽悦栽郧悦粤郧悦栽悦悦粤悦栽悦
栽悦粤悦郧悦栽郧悦粤粤悦粤郧悦粤栽悦悦悦悦郧栽栽郧
缘源益袁员皂蚤灶
摇 摇 择孕悦砸检测采用两步法袁采用 杂再月砸 郧则藻藻灶 为荧光
染料袁以 茁鄄粤糟贼蚤灶 为参照基因袁所用模板和引物与小金
海棠 云藻则 基因扩增时相同袁在 粤月陨 苑猿园园 砸栽鄄孕悦砸 上进
行检测袁反应体系为院怨缘益预变性 猿园泽袁怨缘益变性 缘泽袁适
宜退火温度下退火 猿园泽渊表 圆冤袁共 源园 个循环遥 每处理
重复 猿 次袁采用 圆 原吟吟悦 栽法进行相对定量分析遥
表 圆摇 小金海棠 云藻则家族基因的半定量与实时荧光定量引物
栽葬遭造藻 圆摇 孕则蚤皂藻则泽 怎泽藻凿 枣燥则 砸栽鄄孕悦砸 葬灶凿 择孕悦砸
基因名
郧藻灶藻 灶葬皂藻
目标片段长度
栽葬则早藻贼 造藻灶早贼澡渊遭责冤
引物名称
孕则蚤皂藻则 灶葬皂藻
引物序列渊缘忆 原 猿忆冤
孕则蚤皂藻则 泽藻择怎藻灶糟藻 渊枣则燥皂 缘忆 贼燥 猿忆冤
孕悦砸反应的退火温度
粤灶灶藻葬造蚤灶早 贼藻皂责藻则葬贼怎则藻
燥枣 孕悦砸
酝曾云藻则员 员苑员 云藻则员鄄云
云藻则员鄄砸
悦栽悦栽栽郧悦悦悦郧栽悦粤郧悦郧栽栽粤
栽悦栽郧悦粤栽郧悦栽悦粤粤粤悦栽悦悦郧栽粤
缘怨益
酝曾云藻则圆 员愿圆 云藻则圆鄄云
云藻则圆鄄砸
粤郧悦悦郧栽栽栽郧粤郧郧粤郧郧栽郧粤粤
栽悦粤悦栽悦栽栽悦悦粤悦悦粤悦郧悦栽栽粤栽
缘苑益
酝曾云藻则猿 员缘源 云藻则猿鄄云
云藻则猿鄄砸
郧悦悦郧栽栽栽郧粤郧郧粤郧郧栽郧粤粤郧粤
粤悦栽悦粤郧粤悦粤粤粤郧郧悦粤栽悦粤郧粤粤栽粤郧粤
缘怨益
酝曾云藻则源 员缘远 云藻则源鄄云
云藻则源鄄砸
悦郧粤郧栽郧粤郧郧粤粤郧粤粤粤郧郧郧粤栽
郧栽悦粤粤粤栽粤悦栽悦郧悦栽栽栽悦粤粤悦粤粤
缘缘益
酝曾云藻则缘 员苑苑 云藻则缘鄄云
云藻则缘鄄砸
悦郧悦悦粤悦悦郧悦栽郧栽悦悦粤栽
栽悦悦粤悦粤栽栽郧粤栽悦栽郧悦栽悦郧栽栽粤粤
缘愿益
酝曾云藻则远 员愿猿 云藻则远鄄云
云藻则远鄄砸
悦粤悦栽栽郧悦栽栽郧悦栽悦郧栽郧郧郧栽粤
郧悦栽悦悦栽栽悦栽栽悦粤悦悦栽悦悦栽悦粤粤粤
缘愿益
茁鄄粤糟贼蚤灶 员远愿 茁鄄粤糟贼蚤灶鄄云
茁鄄粤糟贼蚤灶鄄砸
栽郧郧栽郧粤郧郧悦栽悦栽粤栽栽悦悦粤粤悦鄄
栽郧郧悦粤栽粤栽粤悦栽悦栽郧郧粤郧郧悦栽
远园益
圆摇 试验结果和分析
圆郾 员摇 小金海棠铁蛋白基因家族的扩增尧鉴定及序列分
析
以小金海棠正常生长条件下的叶片 糟阅晕粤 为模
板袁使用如表 员 所示引物进行基因扩增袁扩增产物经
员豫 琼脂糖凝胶电泳检测袁得到的条带大小与预期结
果一致遥 孕悦砸扩增共得到 圆 个 枣藻则则蚤贼蚤灶 基因的 悦阅杂 全
长袁长度分别为 员员愿圆遭责 和 怨源园遭责袁此外还获得 源 个
枣藻则则蚤贼蚤灶基因的 悦阅杂 片段袁长度分别为 怨猿源遭责尧缘怨源遭责尧
员园苑园遭责和 愿猿源遭责遥
通过 晕悦月陨提供的蛋白保守区数据库渊悦阅阅冤对这
远 个基因的蛋白保守区进行预测袁发现均含有真核生
园远员
摇 圆 期 小金海棠 枣藻则则蚤贼蚤灶基因的克隆和表达分析
摇 摇 摇 摇 摇 摇
图 员摇 酝曾云藻则基因家族成员的扩增结果
云蚤早援 员摇 孕悦砸 则藻泽怎造贼泽 燥枣 酝曾云藻则 早藻灶藻 枣葬皂蚤造赠 灶怎皂遭藻则泽
酝院阅蕴圆园园园 标记曰员 耀 远院小金海棠 枣藻则则蚤贼蚤灶基因家族
酝院阅蕴圆园园园 酝葬则噪藻则曰 员 耀 远院酝曾云藻则 早藻灶藻 枣葬皂蚤造赠 灶怎皂遭藻则泽
物铁蛋白保守区渊耘怎噪赃云藻则则蚤贼蚤灶冤遥 耘怎噪赃云藻则则蚤贼蚤灶 保守区
的组成如图 圆 所示袁包括亚铁氧化酶活性中心
渊枣藻则则燥曾蚤凿葬泽藻 凿蚤蚤则燥灶 糟藻灶贼藻则 冤袁水合氧化铁成核中心
渊枣藻则则蚤澡赠凿则蚤贼藻 灶怎糟造藻葬贼蚤燥灶 糟藻灶贼藻则冤及铁离子通道遥 说明本
试验克隆得到的 远 个基因均属于 枣藻则则蚤贼蚤灶家族基因遥
同源性分析表明渊图 猿冤袁小金海棠的 枣藻则则蚤贼蚤灶 基因
家族与拟南芥尧梨和大豆的 枣藻则则蚤贼蚤灶 基因家族的核酸序
列相似度较高袁为 缘苑郾 缘豫 耀 苑猿郾 缘豫 遥 其中与梨的相似
度最高袁其次是大豆袁之后是拟南芥遥 根据同源性分
析 袁将与 孕责云藻则 员同源性最高的 悦阅杂序列命名为
图 圆摇 酝曾云藻则的 耘怎噪赃云藻则则蚤贼蚤灶保守区
云蚤早援 圆摇 栽澡藻 耘怎噪赃云藻则则蚤贼蚤灶 糟燥灶泽藻则增藻凿 则藻早蚤燥灶 燥枣 酝曾云藻则
酝曾云藻则员袁与 孕责云藻则圆 同源性最高的命名为 酝曾云藻则圆袁 与
孕责云藻则源 同源性最高的命名为 酝曾云藻则源袁剩余序列命名为
酝曾云藻则猿尧酝曾云藻则缘 和 酝曾云藻则远遥
对 酝曾云藻则员 耀 远 进行开放阅读框预测袁韵砸云 云蚤灶凿藻则
预测结果表明 酝曾云藻则员 耀 远 的阅读框长度分别为
苑愿怨遭责尧怨猿怨遭责尧愿猿猿遭责尧缘怨源遭责尧愿猿源遭责和 愿猿源遭责袁对应编码
圆远圆尧猿园怨尧圆苑苑尧员怨缘尧圆苑苑 和 圆苑苑 个氨基酸遥 悦造怎泽贼葬造载 比
对结果表明小金海棠 枣藻则则蚤贼蚤灶 基因家族 韵砸云 编码氨基
酸的同源性为 苑缘郾 猿缘豫 袁序列间的保守性较高渊图 源冤遥
耘曾孕粤杂再在线软件预测小金海棠 枣藻则则蚤贼蚤灶 基因编码蛋白
质的情况如表 猿 所示袁小金海棠 枣藻则则蚤贼蚤灶 基因编码蛋白
的相对分子量在 圆员郾 缘愿 耀 猿源郾 猿圆噪阅 之间袁理论等电点
在 缘郾 员愿 耀 远郾 员源 之间遥 负电荷残基总数渊粤泽责 垣 郧造怎冤和
正电荷残基总数渊粤则早 垣 蕴赠泽冤最大的是 酝曾云藻则圆袁分别为
猿怨 和 猿远曰最小的是 酝曾云藻则源袁分别为 圆源 和 员缘遥 不稳定
指数表明 酝曾云藻则远 为稳定蛋白袁其它为不稳定蛋白遥
表 猿摇 小金海棠 枣藻则则蚤贼蚤灶基因家族序列分析
栽葬遭造藻 猿摇 杂藻择怎藻灶糟藻 葬灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 枣藻则则蚤贼蚤灶 早藻灶藻 枣葬皂蚤造赠 燥枣 酝援 曾蚤葬燥躁蚤灶藻灶泽蚤泽
基因名称
郧藻灶藻
灶葬皂藻
基因长度
郧藻灶藻
造藻灶早贼澡
韵砸云长度
蕴藻灶早贼澡 燥枣
韵砸云
编码氨基
酸数目
晕燥援 燥枣 藻灶糟燥凿藻凿
葬皂蚤灶燥 葬糟蚤凿
相对分子量
酝燥造藻糟怎造葬则
憎藻蚤早澡贼
理论等电点
栽澡藻燥则藻贼蚤糟葬造 孕陨
负电荷残基总数
渊粤泽责 垣 郧造怎冤
栽燥贼葬造 晕燥援 燥枣 灶藻早葬贼蚤增藻造赠
糟澡葬则早藻凿 则藻泽蚤凿怎藻泽
渊粤泽责 垣 郧造怎冤
正电荷残基总数
渊粤则早 垣 蕴赠泽冤
栽燥贼葬造 晕燥援 燥枣
责燥泽蚤贼蚤增藻造赠 糟澡葬则早藻凿
则藻泽蚤凿怎藻泽
渊粤则早 垣 蕴赠泽冤
不稳定系数
陨灶泽贼葬遭蚤造蚤贼赠
糟燥藻枣枣蚤糟蚤藻灶贼
酝曾云藻则员 员员愿圆 苑愿怨 圆远圆 猿园愿怨员郾 怨 缘郾 源苑 猿苑 圆怨 源源郾 远怨
酝曾云藻则圆 怨源园 怨猿怨 猿园怨 圆员缘愿猿郾 圆 缘郾 源猿 圆源 员怨 缘圆郾 怨怨
酝曾云藻则猿 怨猿源 愿猿猿 圆苑苑 猿园愿苑愿郾 愿 缘郾 员愿 猿愿 圆苑 源缘郾 源缘
酝曾云藻则源 缘怨源 缘怨源 员怨缘 猿源猿圆猿郾 圆 远郾 员猿 猿怨 猿远 远远郾 圆
酝曾云藻则缘 员园苑园 愿猿源 圆苑苑 猿园愿怨员郾 怨 缘郾 源苑 猿苑 圆怨 源源郾 远怨
酝曾云藻则远 愿猿源 愿猿源 圆苑苑 猿园愿怨员郾 怨 缘郾 源苑 猿苑 圆怨 源源郾 远怨
圆郾 圆摇 小金海棠和其他物种间的 枣藻则则蚤贼蚤灶基因进化树
由图 缘 可知袁植物 枣藻则则蚤贼蚤灶 基因的进化明显分为 猿
个亚族院单子叶植物亚族渊包括水稻尧小麦 枣藻则则蚤贼蚤灶 基
因冤尧藻类亚族渊包括团藻尧莱茵衣藻 枣藻则则蚤贼蚤灶 基因冤和双
子叶植物亚族渊包括小金海棠尧梨尧拟南芥尧大豆尧苜
蓿尧羽扇豆等的 枣藻则则蚤贼蚤灶 基因冤遥 本试验克隆的 远 个小
金海棠 枣藻则则蚤贼蚤灶基因属于双子叶亚族遥 其中 酝曾云藻则员 先
和梨 孕责云藻则员 聚类袁然后再和梨 孕责云藻则猿 聚类合并袁而
酝曾云藻则猿 耀 远 与梨 孕责云藻则源 聚类袁酝曾云藻则圆 与梨 孕责云藻则圆 聚
类袁之后这 圆 个小亚族再聚类合并遥 上述结果与图 源
所示的同源性分析一致袁说明小金海棠 枣藻则则蚤贼蚤灶 基因家
族的系统进化分析符合按照形态特征进行判定的单子
员远员
核摇 农摇 学摇 报 圆苑 卷
图 猿摇 小金海棠同其他物种的 枣藻则则蚤贼蚤灶
基因的同源性分析
云蚤早援 猿摇 栽澡藻 枣藻则则蚤贼蚤灶 早藻灶藻 澡燥皂燥造燥早赠 贼则藻藻 燥枣
酝援 曾蚤葬燥躁蚤灶藻灶泽蚤泽 葬灶凿 贼澡藻 燥贼澡藻则 泽责藻糟蚤藻泽
用于同源性分析的基因序列的 郧陨 号如下院拟南芥 枣藻则员 耀 源袁
郧陨院 员源缘猿缘苑缘员愿尧 郧陨院 员源缘猿猿愿猿远源尧 郧陨院 员源缘猿猿怨缘缘怨 和 郧陨院
员愿远缘园远愿猿苑曰梨 枣藻则员 耀 源袁 郧陨院 愿怨圆苑远苑怨圆尧 郧陨院 愿怨圆苑远苑怨源尧 郧陨院
愿怨圆苑远苑怨远 和 郧陨院 愿怨圆苑远苑怨愿曰大豆 枣藻则员 耀 源袁郧陨院 猿缘员苑圆员苑怨圆尧郧陨院
猿缘员苑圆猿苑缘愿尧郧陨院 猿缘员苑圆猿远怨源 和 郧陨院 猿缘员苑圆源员愿愿
叶和双子叶植物的系统进化关系遥 与其他物种相比袁
小金海棠与梨尧嘎啦的 枣藻则则蚤贼蚤灶 基因序列在同一进化分
支上袁说明在 枣藻则则蚤贼蚤灶基因进化上小金海棠与双子叶植
物中同属于蔷薇科的梨尧嘎啦更为接近袁然后是双子叶
中其他植物如大豆尧拟南芥袁而与单子叶植物如玉米尧
水稻较远袁与藻类中的莱茵衣藻和团藻最远遥
图 源摇 小金海棠 枣藻则则蚤贼蚤灶基因家族
韵砸云编码蛋白的序列比较
云蚤早援 源摇 粤造蚤早灶皂藻灶贼 燥枣 责怎贼葬贼蚤增藻 葬皂蚤灶燥 葬糟蚤凿泽
藻灶糟燥凿藻凿 遭赠 韵砸云 泽藻择怎藻灶糟藻泽 燥枣 酝援 曾蚤葬燥躁蚤灶藻灶泽蚤泽
枣藻则则蚤贼蚤灶 早藻灶藻 枣葬皂蚤造赠
圆郾 猿摇 缺铁胁迫下小金海棠 枣藻则则蚤贼蚤灶 基因家族成员的表
达分析
采用 择孕悦砸 和 砸栽鄄孕悦砸 两种技术分析小金海棠
枣藻则则蚤贼蚤灶家族基因的表达趋势袁试验结果表明院虽然存在
个别差异袁但两种技术下这 远 个基因的表达趋势基本
一致遥 如图 远 和图 苑 所示袁酝曾云藻则圆 耀 远 在根和叶中均
有表达袁而 酝曾云藻则员 只在叶中表达袁使用 择孕悦砸 技术在
根中能检测到非常微少的表达量袁说明 酝曾云藻则员 基因的
圆远员
摇 圆 期 小金海棠 枣藻则则蚤贼蚤灶基因的克隆和表达分析
图 缘摇 小金海棠和其他不同物种间的 枣藻则则蚤贼蚤灶基因进化树分析
云蚤早援 缘摇 孕澡赠造燥早藻灶藻贼蚤糟 贼则藻藻 早藻灶藻则葬贼藻凿 遭赠 皂怎造贼蚤责造藻 枣藻则则蚤贼蚤灶 早藻灶藻 泽藻择怎藻灶糟藻泽 燥枣 酝援 曾蚤葬燥躁蚤灶藻灶泽蚤泽 葬灶凿
贼澡藻 燥贼澡藻则 泽责藻糟蚤藻泽 贼澡则燥怎早澡 酝藻早葬源援 园
用于同源性分析的基因序列的 郧陨号如下院拟南芥 枣藻则员 耀 源袁郧陨院 员源缘猿缘苑缘员愿尧郧陨院 员源缘猿猿愿猿远源尧郧陨院 员源缘猿猿怨缘缘怨 和 郧陨院 员愿远缘园远愿猿苑曰
梨 枣藻则员 耀 源袁郧陨院 愿怨圆苑远苑怨圆尧郧陨院 愿怨圆苑远苑怨源尧郧陨院 愿怨圆苑远苑怨远 和 郧陨院 愿怨圆苑远苑怨愿曰大豆 枣藻则员 耀 源袁郧陨院 猿缘员苑圆员苑怨圆尧郧陨院 猿缘员苑圆猿苑缘愿尧郧陨院
猿缘员苑圆猿远怨源 和 郧陨院 猿缘员苑圆源员愿愿曰苜蓿 枣藻则员 耀 猿袁郧陨院 猿缘苑缘园远员源园尧郧陨院 猿缘苑源怨圆苑怨圆 和 郧陨院 猿缘苑源远愿缘缘远曰黄花羽扇豆 枣藻则员 耀 猿袁郧陨院
圆愿怨缘源远缘园远尧郧陨院 圆愿怨缘源远缘员园 和 郧陨院 圆愿怨缘源远缘园远曰豇豆 枣藻则袁郧陨院 圆怨苑园远缘员曰赤豆 枣藻则袁郧陨院 缘员缘怨怨员员圆曰马占相思 枣藻则袁郧陨院 猿圆缘员怨苑猿曰蓖麻
枣藻则袁郧陨院 员缘园愿园怨员猿曰嘎啦 枣藻则袁郧陨院 苑圆圆缘远怨猿员曰玉米 枣藻则员 耀 圆袁郧陨院 员远圆源远员苑圆怨 和 郧陨院 员远圆源缘愿员怨缘曰水稻 枣藻则员 耀 圆袁郧陨院 圆员远愿远缘圆缘 和 郧陨院
圆员远愿远缘圆苑曰莱茵衣藻 枣藻则员 耀 圆袁郧陨院 员缘怨源苑圆愿园园 和 郧陨院 员缘怨园圆猿远愿猿曰团藻 枣藻则员 耀 圆袁郧陨院 猿园圆愿猿愿怨源远 和 郧陨院 猿园圆愿猿源猿怨源
表达具有组织特异性遥 此外袁酝曾云藻则 基因家族成员具
有时间表达特性遥
叶中袁酝曾云藻则员尧酝曾云藻则圆尧酝曾云藻则源尧酝曾云藻则缘 基因在处
理前期表达量逐渐减弱袁至第 猿 天时有一个回升袁之后
表达量减弱袁而 酝曾云藻则圆尧酝曾云藻则源尧酝曾云藻则缘 在缺铁胁迫后
期基因表达量再次增加遥 酝曾云藻则猿 在各个时间点均表
达且在处理第 员 天尧第 猿 天和处理后期渊第 远 天尧第 怨
天冤表达量较高遥 酝曾云藻则远 在缺铁胁迫各个时间点的表
达量都很高且处理间没有明显的差异曰根中袁酝曾云藻则员
基因在缺铁胁迫下通过 择孕悦砸 体系检测到微弱的表
达曰酝曾云藻则圆 基因在中前期的表达量较弱袁缺铁胁迫后
期显著增加曰酝曾云藻则猿尧酝曾云藻则缘 呈现波动表达趋势袁并在
缺铁处理后期表达量增加曰酝曾云藻则源 受缺铁胁迫后表达
量迅速上升袁并持续至第 远 天升到最高袁酝曾云藻则远 表达
量变化不明显袁推测其不受缺铁胁迫诱导遥
猿摇 讨论
铁在植物体内起着非常重要的作用袁如参与重要
的生化反应袁如光合作用和呼吸作用咱圆猿 原 圆缘暂 袁参与基本
反应如 阅晕粤合成尧植物固氮作用及植物激素合成咱圆缘暂 遥
缺铁会造成严重的营养紊乱从而影响到植物的代谢生
理咱圆苑袁 圆愿暂 袁同时铁过量时铁与氧反应产生的氧自由基会
对植物产生巨大的毒害从而损害生物有机体咱圆怨袁猿园暂 袁因
此调控植物体内铁的动态平衡非常重要遥 高等植物进
化出一套铁信号调控体系袁严谨地控制着铁的吸收尧运
转尧分配和储存等一系列过程遥 小金海棠是从苹果 源园
多个种属中筛选出来的具有抗缺铁黄叶病的优良砧木
猿远员
核摇 农摇 学摇 报 圆苑 卷
图 远摇 酝曾云藻则基因家族成员的半定量 砸栽鄄孕悦砸分析
云蚤早援 远摇 杂藻皂蚤鄄择怎葬灶贼蚤贼葬贼蚤增藻 砸栽鄄孕悦砸 凿藻贼藻糟贼蚤燥灶 燥枣
酝曾云藻则 早藻灶藻 枣葬皂蚤造赠
粤院叶片曰月院根
粤院 造藻葬枣曰 月院 则燥燥贼
资源咱猿员袁 猿圆暂 遥 目前在小金海棠上袁关于铁离子吸收尧运
输相关的基因已进行了大量研究咱猿猿 原 猿怨暂 袁但对于铁蛋白
基因的研究还很少遥 小金海棠 枣藻则则蚤贼蚤灶基因家族的成员
数目袁这些成员的同源性和进化关系袁以及在缺铁胁迫
下的表达调控规律尚未知遥 本研究一定程度上解决了
上述问题遥
本试验克隆得到 远 个小金海棠 枣藻则则蚤贼蚤灶 基因袁它们
之间的序列相似度及与其他物种 枣藻则则蚤贼蚤灶 基因的序列
相似度在 缘苑郾 缘豫 耀 苑猿郾 缘豫之间袁相似度较高袁这进一
步说明了植物 枣藻则则蚤贼蚤灶 家族基因的高度保守性遥 进化
树构建中的同一亚族或小的分枝往往具有相似的功
能遥 酝曾云藻则圆 和 孕责云藻则圆 渊梨 云藻则圆冤基因在同一分枝上
渊图 猿冤袁说明二者可能具有相同的分子功能遥 同理袁
酝曾云藻则猿 耀 远 可能与 孕责云藻则源 具有相似的功能袁酝曾云藻则员 可
能与 孕责云藻则员 和 孕责云藻则猿 具有相似功能遥 但这些基因的
功能有待进一步试验验证遥
对 云藻则基因调控铁贮藏的研究多围绕在铁过量情
况下进行袁如 孕则燥怎凿澡燥灶藻等人报道袁在铁供应过量植物
体内铁蛋白含量是正常条件下的 源园 耀 缘园 倍咱源园暂 曰而在
缺铁条件下的研究却鲜见遥 本试验以铁高效基因型植
物小金海棠为材料研究其在缺铁处理下 枣藻则则蚤贼蚤灶 基因
家族的时空表达特性遥 根究 择孕悦砸 和 砸栽鄄孕悦砸 分析结
果袁结合水稻淀粉合成酶基因的表达模式分类咱源员暂 袁小
金海棠 枣藻则则蚤贼蚤灶 基因家族不同成员的时间表达模式可
划分为早期表达型尧晚期表达型尧组成表达型和波动表
达型遥 其中 酝曾云藻则员 属于早期表达型袁酝曾云藻则圆 属于晚
期表达型袁酝曾云藻则远 属于组成表达型袁而 酝曾云藻则猿 耀 缘 属
于波动表达型遥 就组织部位而言袁酝曾云藻则员 只在叶中特
异表达袁在根中表达量非常微弱袁考虑系统误差等原因
该表达量可以忽略不计袁说明该基因表达具有空间表
达特性曰而 酝曾云藻则圆 耀 远 在根叶中均表达遥 枣藻则则蚤贼蚤灶 基因
在时空上的差异表达现象也存在于拟南芥尧羽扇豆等
其他物种中咱源圆袁源猿暂 遥 本研究的 砸栽鄄孕悦砸试验表明大多数
小金海棠 枣藻则则蚤贼蚤灶基因在处理中后期表达量较高袁这可
能是因为 枣藻则则蚤贼蚤灶 基因参与了小金海棠的缺铁适应性
反应遥 小金海棠在缺铁条件下袁感受到缺铁信号后袁会
加强从外界吸收铁离子的能力袁并运转到缺铁部位以
适应缺铁胁迫遥 枣藻则则蚤贼蚤灶基因在缺铁处理中后期大量表
达可能是因为小金海棠感受到缺铁信号后袁大量调运
铁离子积累至一定浓度袁诱导 枣藻则则蚤贼蚤灶 基因表达袁翻译
出更多的铁蛋白袁进一步加强了植物体内的缺铁信号遥
枣藻则则蚤贼蚤灶感应到系统的缺铁信号后释放贮存的铁离子从
而使小金海棠适应缺铁胁迫遥 此外袁枣藻则则蚤贼蚤灶 是一种胁
迫反应蛋白袁很可能会在缺铁处理至一定时间后大量
表达以应激胁迫反应袁因此在缺铁胁迫后期会有
枣藻则则蚤贼蚤灶基因的大量表达遥 目前的工作尚不能完全解释
缺铁胁迫下小金海棠 枣藻则则蚤贼蚤灶 基因的表达规律袁对
枣藻则则蚤贼蚤灶基因在小金海棠铁高效机理中是否发挥作用尚
不清晰袁而本试验中对小金海棠铁蛋白基因家族的克
隆和表达分析可为铁蛋白的深入研究奠定基础遥
参考文献院
咱 员 暂摇 粤灶凿则藻憎泽 杂 悦袁 粤则燥泽蚤燥 孕袁 月燥贼贼噪藻 宰袁 月则蚤葬贼 允 云袁 增燥灶 阅葬则造 酝袁 匀葬则则蚤泽燥灶
孕 酝袁 蕴葬怎造澡藻则藻 允 孕袁 蕴藻增蚤 杂袁 蕴燥遭则藻葬怎曾 杂袁 再藻憎凿葬造造 杂 允援 杂贼则怎糟贼怎则藻袁
枣怎灶糟贼蚤燥灶袁 葬灶凿 藻增燥造怎贼蚤燥灶 燥枣 枣藻则则蚤贼蚤灶泽 咱 允 暂 援 允燥怎则灶葬造 燥枣 陨灶燥则早葬灶蚤糟
月蚤燥糟澡藻皂蚤泽贼则赠袁 员怨怨圆袁 源苑渊猿 原 源冤院 员远员 原 员苑源
咱 圆 暂摇 蕴葬怎造澡藻则藻 允 孕袁 月则蚤葬贼 允 云援 陨则燥灶 则藻造藻葬泽藻 葬灶凿 怎责贼葬噪藻 遭赠 责造葬灶贼 枣藻则则蚤贼蚤灶院
藻枣枣藻糟贼泽 燥枣 责匀袁 则藻凿怎糟贼蚤燥灶 葬灶凿 糟澡藻造葬贼蚤燥灶 咱 允暂 援 月蚤燥糟澡藻皂蚤糟葬造 允燥怎则灶葬造袁
员怨怨猿袁 圆怨园 渊猿冤院 远怨猿 原 远怨怨
咱 猿 暂摇 杂噪则蚤增藻则 运袁 酝怎灶凿赠 允援 郧藻灶藻 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 蚤灶 则藻泽责燥灶泽藻 贼燥 葬遭泽糟蚤泽蚤糟 葬糟蚤凿
葬灶凿 燥泽皂燥贼蚤糟 泽贼则藻泽泽 咱允暂 援 孕造葬灶贼 悦藻造造袁 员怨怨园袁 圆渊远冤院 缘园猿 原 缘员圆
咱 源 暂摇 孕藻灶早 载 载袁 再葬皂葬怎糟澡蚤 酝援 耘贼澡赠造藻灶藻 责则燥凿怎糟贼蚤燥灶 蚤灶 则蚤糟藻 遭则燥灶扎蚤灶早 造藻葬增藻泽
蚤灶凿怎糟藻凿 遭赠 枣藻则则燥怎泽 蚤则燥灶 咱允暂 援 孕造葬灶贼 葬灶凿 杂燥蚤造袁 员怨怨猿袁 员源怨渊圆冤院 圆圆苑 原
圆猿源
咱 缘 暂摇 阅藻葬噪 酝袁 匀燥则增葬贼澡 郧 灾袁 阅葬增造藻贼燥增葬 杂袁 栽燥则燥噪 运袁 杂葬泽泽 蕴袁 灾葬泽泽 陨袁
月葬则灶葬 月袁 运蚤则葬造赠 在袁 阅怎凿蚤贼泽 阅援 孕造葬灶贼泽 藻糟贼燥责蚤糟葬造造赠 藻曾责则藻泽泽蚤灶早 贼澡藻 蚤则燥灶鄄
源远员
摇 圆 期 小金海棠 枣藻则则蚤贼蚤灶基因的克隆和表达分析
图 苑摇 酝曾云藻则基因家族成员的 择孕悦砸分析
云蚤早援 苑摇 择孕悦砸 凿藻贼藻糟贼蚤燥灶 燥枣 酝曾云藻则 早藻灶藻 枣葬皂蚤造赠
粤院叶片曰月院根
粤院 造藻葬枣曰 月院 则燥燥贼
遭蚤灶凿蚤灶早 责则燥贼藻蚤灶袁 枣藻则则蚤贼蚤灶袁 葬则藻 贼燥造藻则葬灶贼 贼燥 燥曾蚤凿葬贼蚤增藻 凿葬皂葬早藻 葬灶凿
责葬贼澡燥早藻灶泽 咱允暂 援 晕葬贼怎则藻 月蚤燥贼藻糟澡灶燥造燥早赠袁 员怨怨怨袁 员苑渊圆冤院 员怨圆 原 员怨远
咱 远 暂 摇 孕藻赠则藻贼 孕袁 孕藻则藻扎 孕袁 粤造则蚤糟 酝援 杂贼则怎糟贼怎则藻袁 早藻灶燥皂蚤糟 燥则早葬灶蚤扎葬贼蚤燥灶袁 葬灶凿
藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 燥枣 贼澡藻 粤则葬遭蚤凿燥责泽蚤泽 贼澡葬造蚤葬灶葬 葬糟燥灶蚤贼葬泽藻 早藻灶藻援 孕造葬灶贼
葬糟燥灶蚤贼葬泽藻 泽澡燥憎 泽蚤早灶蚤枣蚤糟葬灶贼 澡燥皂燥造燥早赠 憎蚤贼澡 皂葬皂皂葬造蚤葬灶 蚤则燥灶鄄则藻泽责燥灶泽蚤增藻
藻造藻皂藻灶贼鄄遭蚤灶凿蚤灶早 责则燥贼藻蚤灶 咱 允 暂 援 允燥怎则灶葬造 燥枣 月蚤燥造燥早蚤糟葬造 悦澡藻皂蚤泽贼则赠袁
员怨怨缘袁 圆苑园渊员源冤院 愿员猿员 原 愿员猿苑
咱 苑 暂 摇 匀赠凿藻 月 月袁 匀燥凿早藻 粤 允袁 运葬澡灶 粤袁 月蚤则灶泽贼蚤藻造 酝 蕴援 杂贼怎凿蚤藻泽 燥灶
责澡赠贼燥枣藻则则蚤贼蚤灶院 陨援 陨凿藻灶贼蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 葬灶凿 造燥糟葬造蚤扎葬贼蚤燥灶 咱 允 暂 援 允燥怎则灶葬造 燥枣
哉造贼则葬泽贼则怎糟贼怎则藻 砸藻泽藻葬则糟澡袁 员怨远猿袁 缘怨院 圆源愿 原 圆缘愿
咱 愿 暂 摇 叶 霞援 苹果尧梨铁蛋白基因的克隆及菜豆铁蛋白基因在转基因
苹果和番茄植株中的表达特性研究咱阅暂援 南京农业大学袁 圆园园远
咱 怨 暂 摇 杂贼藻蚤灶 砸 允袁 砸蚤糟葬糟澡藻灶藻增泽噪赠 云 运袁 云藻贼贼 允 孕援 阅蚤枣枣藻则藻灶贼蚤葬造 则藻早怎造葬贼蚤燥灶 燥枣
贼澡藻 贼憎燥 则蚤糟藻 枣藻则则蚤贼蚤灶 早藻灶藻泽 渊 韵泽云耘砸员 葬灶凿 韵泽云耘砸圆 冤 咱 允暂 援 孕造葬灶贼
杂糟蚤藻灶糟藻袁 圆园园怨袁 员苑苑渊远冤院 缘远猿 原 缘远怨
咱员园暂摇 云燥遭蚤泽造燥蚤泽赠 陨袁 蕴燥则蚤凿燥灶 运袁 蕴燥遭则藻葬怎曾 杂袁 蕴藻遭则怎灶 酝袁 月则蚤葬贼 允 云援
杂贼则怎糟贼怎则藻 葬灶凿 凿蚤枣枣藻则藻灶贼蚤葬造 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 燥枣 圆 皂葬蚤扎藻 枣藻则则蚤贼蚤灶 早藻灶藻泽 蚤灶
则藻泽责燥灶泽藻 贼燥 蚤则燥灶 葬灶凿 葬遭泽糟蚤泽蚤糟鄄葬糟蚤凿 咱 允 暂 援 耘怎则燥责藻葬灶 允燥怎则灶葬造 燥枣
月蚤燥糟澡藻皂蚤泽贼则赠袁 员怨怨缘袁 圆猿员渊猿冤院 远园怨 原 远员怨
咱员员暂摇 允蚤葬灶早 栽 韵援 陨泽燥造葬贼蚤燥灶 葬灶凿 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 责葬贼贼藻则灶 葬灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 贼憎燥 枣藻则则蚤贼蚤灶
早藻灶藻泽 蚤灶 贼燥遭葬糟糟燥 咱允暂 援 允燥怎则灶葬造 燥枣 陨灶贼藻早则葬贼蚤增藻 孕造葬灶贼 月蚤燥造燥早赠袁 圆园园缘袁 源苑
渊源冤院 源苑苑 原 源苑怨
咱员圆暂摇 孕藻贼蚤贼 允 酝袁 增葬灶 宰怎赠贼泽憎蚤灶噪藻造 韵袁 月则蚤葬贼 允 云袁 蕴燥遭则藻葬怎曾 杂援
悦澡葬则葬糟贼藻则蚤扎葬贼蚤燥灶 燥枣 葬灶 蚤则燥灶鄄凿藻责藻灶凿藻灶贼 则藻早怎造葬贼燥则赠 泽藻择怎藻灶糟藻 蚤灶增燥造增藻凿 蚤灶
贼澡藻 贼则葬灶泽糟则蚤责贼蚤燥灶葬造 糟燥灶贼则燥造 燥枣 粤贼云藻则员 葬灶凿 在皂云藻则员 责造葬灶贼 枣藻则则蚤贼蚤灶 早藻灶藻泽
遭赠 蚤则燥灶 咱允暂 援 允燥怎则灶葬造 燥枣 月蚤燥造燥早蚤糟葬造 悦澡藻皂蚤泽贼则赠袁 圆园园员袁 圆苑远渊愿冤院 缘缘愿源
原 缘缘怨园
咱员猿暂摇 杂糟扎藻噪葬灶 杂砸袁 允燥泽澡蚤 允郧援 陨泽燥造葬贼蚤燥灶 葬灶凿 糟澡葬则葬糟贼藻则蚤扎葬贼蚤燥灶 燥枣 枣藻则则蚤贼蚤灶 枣则燥皂
泽燥赠葬遭藻葬灶泽 渊郧造赠糟蚤灶藻 皂葬曾冤 咱允暂 援 允燥怎则灶葬造 燥枣 陨灶贼藻早则葬贼蚤增藻 孕造葬灶贼 月蚤燥造燥早赠袁
员怨愿苑袁 圆远圆渊圆愿冤院 员猿苑愿园 原 员猿苑愿愿
咱员源暂摇 孕则燥糟澡灶蚤噪 杂 耘袁 哉皂藻灶 允袁 晕藻凿藻造糟怎 粤 酝袁 匀葬造造皂葬灶灶 粤袁 酝蚤造造藻则 杂 酝袁
晕蚤泽澡蚤蚤 陨袁 云藻则则蚤泽 孕袁 运怎燥 粤袁 酝蚤贼则燥泽 栽袁 云则蚤贼扎鄄蕴葬赠造蚤灶 蕴 运袁 匀藻造造泽贼藻灶 哉袁
缘远员
核摇 农摇 学摇 报 圆苑 卷
悦澡葬责皂葬灶 允袁 杂蚤皂葬噪燥增 韵袁 砸藻灶泽蚤灶早 杂 粤袁 栽藻则则赠 粤袁 孕葬灶早蚤造蚤灶葬灶 允袁
运葬责蚤贼燥灶燥增 灾袁 允怎则噪葬 允袁 杂葬造葬皂燥增 粤袁 杂澡葬责蚤则燥 匀袁 杂糟澡皂怎贼扎 允袁
郧则蚤皂憎燥燥凿 允袁 蕴蚤灶凿择怎蚤泽贼 耘袁 蕴怎糟葬泽 杂袁 郧则蚤早燥则蚤藻增 陨 灾袁 杂糟澡皂蚤贼贼 砸袁 运蚤则噪
阅袁 砸燥噪澡泽葬则 阅 杂援 郧藻灶燥皂蚤糟 葬灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 燥则早葬灶蚤泽皂葬造 糟燥皂责造藻曾蚤贼赠 蚤灶 贼澡藻
皂怎造贼蚤糟藻造造怎造葬则 早则藻藻灶 葬造早葬 灾燥造增燥曾 糟葬则贼藻则蚤 咱 允暂 援 杂糟蚤藻灶糟藻袁 圆园员园袁 猿圆怨
渊缘怨愿愿冤院 圆圆猿 原 圆圆远
咱员缘暂摇 酝藻则糟澡葬灶贼 杂 杂袁 孕则燥糟澡灶蚤噪 杂 耘袁 灾葬造造燥灶 韵袁 匀葬则则蚤泽 耘 匀袁 运葬则责燥憎蚤糟扎 杂 允袁
宰蚤贼皂葬灶 郧 月袁 栽藻则则赠 粤袁 杂葬造葬皂燥增 粤袁 云则蚤贼扎鄄蕴葬赠造蚤灶 蕴 运袁 酝葬则藻糟澡葬造鄄
阅则燥怎葬则凿 蕴袁 酝葬则泽澡葬造造 宰 云袁 匝怎 蕴 匀袁 晕藻造泽燥灶 阅 砸袁 杂葬灶凿藻则枣燥燥贼 粤 粤袁
杂责葬造凿蚤灶早 酝 匀袁 运葬责蚤贼燥灶燥增 灾 灾袁 砸藻灶 匝袁 云藻则则蚤泽 孕袁 蕴蚤灶凿择怎蚤泽贼 耘袁
杂澡葬责蚤则燥 匀袁 蕴怎糟葬泽 杂 酝袁 郧则蚤皂憎燥燥凿 允袁 杂糟澡皂怎贼扎 允袁 悦葬则凿燥造 孕袁 悦藻则怎贼贼蚤
匀袁 悦澡葬灶枣则藻葬怎 郧袁 悦澡藻灶 悦 蕴袁 悦燥早灶葬贼 灾袁 悦则燥枣贼 酝 栽袁 阅藻灶贼 砸袁
阅怎贼糟澡藻则 杂袁 云藻则灶葬灶凿藻扎 耘袁 云怎噪怎扎葬憎葬 匀袁 郧燥灶扎葬造藻扎鄄月葬造造藻泽贼藻则 阅袁
郧燥灶扎葬造藻扎鄄匀葬造责澡藻灶 阅袁 匀葬造造皂葬灶灶 粤袁 匀葬灶蚤噪藻灶灶藻 酝袁 匀蚤责责造藻则 酝袁
陨灶憎燥燥凿 宰袁 允葬遭遭葬则蚤 运袁 运葬造葬灶燥灶 酝袁 运怎则葬泽 砸袁 蕴藻枣藻遭增则藻 孕 粤袁
蕴藻皂葬蚤则藻 杂 阅袁 蕴燥遭葬灶燥增 粤 灾袁 蕴燥澡则 酝袁 酝葬灶怎藻造造 粤袁 酝藻蚤藻则 陨袁 酝藻贼泽 蕴袁
酝蚤贼贼葬早 酝袁 酝蚤贼贼藻造皂藻蚤藻则 栽袁 酝燥则燥灶藻赠 允 灾袁 酝燥泽藻造藻赠 允袁 晕葬责燥造蚤 悦袁
晕藻凿藻造糟怎 粤 酝袁 晕蚤赠燥早蚤 运袁 晕燥增燥泽藻造燥增 杂 灾袁 孕葬怎造泽藻灶 陨 栽袁 孕葬扎燥怎则 郧袁
孕怎则贼燥灶 杂袁 砸葬造 允 孕袁 砸蚤葬灶燥鄄孕葬糟澡燥灶 阅 酝袁 砸蚤藻噪澡燥枣 宰袁 砸赠皂葬则择怎蚤泽 蕴袁
杂糟澡则燥凿葬 酝袁 杂贼藻则灶 阅袁 哉皂藻灶 允袁 宰蚤造造燥憎泽 砸袁 宰蚤造泽燥灶 晕袁 在蚤皂皂藻则 杂 蕴袁
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