全 文 ：　 核 农 学 报　 ２０１４，２８（６）：０９８５ ～ ０９８９
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｒ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
收稿日期：２０１３⁃０８⁃２０　 接受日期：２０１４⁃０１⁃０８
基金项目：福建省自然科学基金项目 （２０１２Ｊ０１０９８），国家茶叶产业技术体系项目 （ ｎｙｃｙｔｘ － ２３），福建省农科院创新团队重点资助项目
（ＣＸＴＤ２０１１ － １８），福建农科院优质茶创新团队（ＣＸＴＤ － １ － １３０２）
作者简介：林郑和，男，副研究员，主要从事茶树生理与分子生物学研究。 Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｌｉｎｚｈｅｎｇｈｅ＠ １２６． ｃｏｍ
通讯作者：陈常颂，男，副研究员，主要从事茶树遗传育种研究。 Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｃｃｓ６５３６５９７＠ １６３． ｃｏｍ
文章编号：１０００⁃８５５１（２０１４）０６⁃０９８５⁃０５
不同氮浓度下茶树氮合成关键酶基因的表达分析
林郑和　 钟秋生　 陈常颂　 陈志辉　 游小妹
（福建省农业科学院茶叶研究所，福建 福安　 ３５５０００）
摘　 要：本研究以 １０ 月龄扦插九龙袍茶苗［Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ （Ｌ． ） Ｏ． Ｋｕｎｔｚｅ ｃｖ． Ｊｉｕｌｏｎｇｐａｏ］为试验材料，
通过沙培试验，设 ４ 个 Ｎ浓度（０、６０、６００、６０００ ｍｍｏｌ·Ｌ － １），每周 ３ 次，处理后 ２１ 周，克隆得到茶叶中氮
合成转化关键酶基因：谷氨酸脱氢酶（ＧＤＨ）、谷氨酰胺合成酶（ＧＳ）、谷氨酰胺 α －酮戊二酸氨基转移酶
（ＧＯＧＡＴ）的保守区，在 ＧｅｎＢａｎｋ 登录号分别：ＪＮ６０２３７１、ＪＮ６０２３７２、ＪＮ６０２３７３；进行荧光定量 ＰＣＲ 检测，
发现缺氮下 ＧＳ、ＧＯＧＡＴ基因的表达增强；ＧＤＨ基因表达显著下降。 通过回归分析，ＧＳ基因表达与叶片
氮含量呈负相关，而 ＧＤＨ与叶片氮含量呈正相关。
关键词：缺氮；基因；克隆；荧光定量 ＰＣＲ
ＤＯＩ：１０􀆰 １１８６９ ／ ｊ． ｉｓｓｎ． １００⁃８５５１􀆰 ２０１４􀆰 ０６． ０９８５
　 　 氮是植物生长发育需求量最大的营养元素之一，
既是构成植物有机体的结构物质，也是植物生理代谢
过程中起催化作用的物质［１］。 在自然条件下，氮的吸
收主要来源于土壤，而土壤中的氮通常是有限的，因此
土壤缺氮成为世界范围内限制植物生长和发育的重要
因子之一［２］。
近年来植物氮代谢机理及其调控一直备受关
注［３］。 氮素对作物的生长发育起着关键作用，无机氮
只有转化成有机氮的形式才可以被植物体所利用［４］，
在高等植物中，谷氨酰胺合成酶（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ，
ＧＳ； Ｅ． Ｃ． ６􀆰 ３􀆰 １􀆰 ２）和谷氨酸合酶（Ｆｄ⁃ ＧＯＧＡＴ， Ｅ．
Ｃ． １􀆰 ４􀆰 １􀆰 ７；ＮＡＤＨ⁃ ＧＯＧＡＴ； Ｅ． Ｃ． １􀆰 ４􀆰 １􀆰 １４）循环是
无机氮转化成有机氮形式的主要途径［５ － ６］。 谷氨酰胺
合成酶（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ，ＧＳ；Ｅ． Ｃ． ６􀆰 ３􀆰 １􀆰 ２）是将
无机氮转化为有机氮的第一个酶，亦是关键酶，催化不
同来源的氨与谷氨酸结合形成谷氨酰胺；而后谷氨酰
胺又在谷氨酸合成酶（ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ，ＧＯＧＡＴ；Ｅ．
Ｃ． １􀆰 ４􀆰 １􀆰 １４）的催化下，将谷氨酰胺转移到 α － 酮戊
二酸上生成谷氨酸， 此连续反应过程被称为 “ ＧＳ⁃
ＧＯＧＡＴ循环” ［７］。
有研究表明，转 ＧＳ 基因小麦并没有提高 ＧＳ 的总
量，但某些株系中根量增大，籽粒增多，含氮量提
高［８］；而特异表达烟草 ＧＳ２ 基因促进了转基因烟草幼
苗的生长［４］；Ｍａｎ 等［９］人认为，转 ＧＳ 基因的杨树，提
高了氮同化效率和生长。 随着氮代谢相关基因研究的
进一步深入，将为更加准确、及时地进行肥料运作提供
科学依据。
目前关于 ＧＳ、ＧＤＨ 等相关报道大多数集中在小
麦［８］、水稻［１０］、烟草［４］、甜菜［１１］、橡胶树［１２］、甜瓜［１３］
等，而关于茶树 ＧＳ、ＧＤＨ、ＧＯＧＡＴ 等酶基因表达的研
究甚少。 本研究以福建省农科院茶叶所选育的九龙袍
（福建省审定品种，编号：闽审茶 ２０００００２，无性系、灌
木型、中叶类、晚生种，二倍体）茶树品种为试验材料，
克隆茶树叶片 ＧＳ、ＧＤＨ、ＧＯＧＡＴ 酶基因的保守区，利
用实时荧光定量 ＰＣＲ技术，分析其在不同氮处理浓度
下的表达差异，从分子水平上探讨氮素含量与 ＧＳ、
ＧＤＨ、ＧＯＧＡＴ酶基因表达的关系，为氮素吸收、转化、
利用提供依据。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 试验材料
试验于 ２０１１ － ２０１２ 年在福建省农业科学院茶叶
研究所试验地完成。 试验所采用的品种为九龙袍
５８９
核　 农　 学　 报 ２８ 卷
［Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ （Ｌ． ） Ｏ． Ｋｕｎｔｚｅ］，选取 １６０ 株生长
一致的 １０ 月龄扦插苗，盆栽于 ６ Ｌ 的装满沙的花盆
中，每盆 ２ 株，每处理 ２０ 盆，于自然温、光条件下培养。
营养液参照文献［１４ － １６］配制，完全营养液包含 ３
ｍｍｏｌ·Ｌ － １ ＮＨ４ＮＯ３，０􀆰 ５ｍｍｏｌ·Ｌ － １ Ｃａ（Ｈ２ＰＯ４） ２，１􀆰 ０
ｍｍｏｌ·Ｌ － １Ｋ２ＳＯ４，０􀆰 ５ ｍｍｏｌ·Ｌ － １ ＣａＣｌ２，０􀆰 ６ ｍｍｏｌ·
Ｌ － １ ＭｇＳＯ４， ４６ μｍｏｌ · Ｌ － １ Ｈ３ＢＯ３， ９ μｍｏｌ · Ｌ － １
ＭｎＳＯ４， ９ μｍｏｌ · Ｌ － １ ＺｎＳＯ４， ２μｍｏｌ · Ｌ － １ ＣｕＳＯ４，
２􀆰 ６μｍｏｌ·Ｌ － １ Ｎａ２ＭｏＯ４ 和 ３０μｍｏｌ· Ｌ － １ Ｆｅ⁃ＥＤＴＡ。
移栽后培养 ６ 周，然后进行试验处理，每次每盆各处理
分别施含 ０、６０、６００、６０００ｍｍｏｌ·Ｌ － １ Ｎ 的 ＮＨ４ＮＯ３ 营
养液约 ５００ ｍＬ，每周 ３ 次，处理后 ２１ 周后取样。
１􀆰 ２　 试验方法
茶树叶片氮含量的测定：采用浓 Ｈ２ＳＯ４—Ｈ２Ｏ２ 消
煮，用凯氏定氮仪（ＦＯＳＳ）进行测定。
ＧＤＨ、ＧＳ、ＧＯＧＡＴ 酶基因保守区的克隆引物设
计：根据 ＧｅｎＢａｎｋ中已报道其他物种中的相关基因的
核苷酸序列，分别设计茶树叶片 ＧＤＨ、ＧＳ、ＧＯＧＡＴ 酶
基因保守区的上、下游引物，详见文献［１７］。
１􀆰 ３　 不同浓度氮处理下 ＧＤＨ、ＧＳ、ＧＯＧＡＴ 酶基因
表达的荧光定量 ＰＣＲ
１，３􀆰 １　 引物设计　 目的片段扩增引物，内参扩增引物
设计见表 １。
表 １　 荧光定量引物设计（内参以 β－ ｔｕｂｌｉｎ）
Ｔａｂｌｅ １　 Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
基因
Ｇｅｎｅ
引物序列
Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ （５′ － ３′）
引物序列
Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ （５′ － ３′）
ＧＯＧＡＴ ＴＧＣＴＴＣＡＧＧＡＣＧＴＴＴＴＧＧＴＧＴ ＣＡＴＧＡＴＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＧＧＡＴＡＴ
ＧＤＨ ＡＡＧＣＧＧＣＡＡＡＴＣＡＴＣＣＴＡＣＴＧＡ ＴＣＧＴＣＣＣＡＣＡＴＧＡＡＡＣＣＴＴＧＡ
ＧＳ ＣＣＴＣＡＧＡＡＧＣＡＡＡＧＣＡＡＧＧＡＣＴ ＡＡＣＡＴＣＡＧＧＧＴＧＧＣＴＧＡＡＡＡＴＣ
β － ｔｕｂｌｉｎ （Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅ） ＣＣＣＴＴＴＡＣＧＡＣＡＴＣＴＧＴＴＴＣＣＧ ＴＧＧＣＡＴＣＣＣＡＣＡＴＴＴＧＣＴＧ
１􀆰 ３􀆰 ２　 荧光定量 ＰＣＲ扩增分析　 实时荧光定量 ＰＣＲ
主要根据大连宝生物工程有限公司的 ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ
Ｔａｑ （ｐｅｒｆｅｃｔ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ）说明书进行，荧光定量 ＰＣＲ 扩
增标准程序：第一步：预变性 １０ｓ， ９５℃ ３０ｓ，Ｒｅｐｓ：１
次；第二步：９５℃ ５ｓ，６０℃ ３０ｓ，Ｒｅｐｓ：４０ 次。 反应结束，
在 ６０℃进行荧光信号采集，绘制融解曲线。 样本和内
参分别设 ３ 个重复，β － ｔｕｂｌｉｎ 为内参， 以 ０ｍｍｏｌ·Ｌ － １
Ｎ为对照（１）。
１􀆰 ４　 数据处理
试验数据用 ＤＰＳ 数据处理系统进行差异显著性
分析（ＬＳＤ法）。
２　 结果与分析
２􀆰 １　 不同浓度的氮处理下叶片氮含量的变化
图 １ 可见，当供氮为 ０ 增加到 ６０ｍｍｏｌ·Ｌ － １ Ｎ时，
叶片氮含量未发生显著变化，之后随着供氮的增加，叶
片氮含量依次显著增加。
注：每一点为 ４ 次重复的平均值 ±标准误；
Ｎ１：０ ｍｍｏｌ·Ｌ － １；Ｎ２：６０ ｍｍｏｌ·Ｌ － １；
Ｎ３：６００ ｍｍｏｌ·Ｌ － １；Ｎ４：６０００ ｍｍｏｌ·Ｌ － １。 下同。
Ｎｏｔｅｓ： Ｅａｃｈ ｐｏｉｎｔ ｉｓ ｍｅａｎ ± ｓｔａｎｄａｒｄ ｅｒｒｏｒ ｏｆ ４
ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ； Ｎｉｔｒｏｇｅｎ（Ｎ） ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ （ｍｍｏｌ·Ｌ － １）：
０、６０、６００、６０００ｍ ｍｏｌ·Ｌ － １ ． Ｔｈｅ ｓａｍｅ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ．
图 １　 供氮对茶树叶片氮含量的影响
Ｆｉｇ． １　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｎ ｓｕｐｐｌｙ ｏｎ Ｎ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｏｆ ｔｅａ ｌｅａｖｅｓ
２􀆰 ２　 ＧＤＨ、ＧＳ、ＧＯＧＡＴ酶基因保守区的克隆
以茶树叶片（一芽二叶）总 ＲＮＡ 进行逆转录合成
ｃＤＮＡ第一链，再以 ｃＤＮＡ 第一链为模板，以 ＧＤＨ、
ＧＯＧＡＴ、ＧＳ的上、下游引物，进行 ＰＣＲ扩增，分别得到
一条 ５００、６００、４５０ｂｐ 左右特异条带。 通过 Ｂｌａｓｔ 工具
搜索 ＧｅｎＢａｎｋ中与其同源的基因，发现搜索到的基因
分别为 ＧＤＨ、ＧＯＧＡＴ、ＧＳ 基因。 基因登入号分别为：
６８９
　 ６ 期 不同氮浓度下茶树氮合成关键酶基因的表达分析
Ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ （ ＧＯＧＡＴ ）： ＪＮ６０２３７１； Ｇｌｕｔａｍａｔｅ
ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ （ＧＤＨ）：ＪＮ６０２３７２；Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ
（ＧＳ）：ＪＮ６０２３７３。 详见参考文献［１７］。
图 ２　 供氮对茶树叶片 ＧＤＨ、ＧＳ、ＧＯＧＡＴ酶基因相对表达量的影响
Ｆｉｇ ２　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｎ ｓｕｐｐｌｙ ｏｎ ＧＳ、ＧＤＨ、ＧＯＧＡＴ ｇｅｎｅ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｏｎｔｅｎｔ
２􀆰 ３　 不同浓度的氮处理下 ＧＤＨ、ＧＳ、ＧＯＧＡＴ 酶基
因的表达
以表 １ 中的 ＧＤＨ、ＧＳ、ＧＯＧＡＴ引物对 ４ 个茶树种
质的一芽二叶进行实时荧光 ＰＣＲ扩增，ＰＣＲ扩增结束
后绘制融解曲线，产物融解曲线为单峰，无杂峰，表明
试验无污染，无非特异性产物。 同时 ＰＣＲ扩增曲线也
显示出，每组样本的重复性较好（图 ２）。 从图 ２ 可以
看出，ＧＤＨ酶基因的表达随着供氮浓度的增加而增强
（图 ２ － Ａ），当供氮浓度为 ６０００ ｍｍｏｌ·Ｌ － １时，最大为
３􀆰 ２０；而 ＧＯＧＡＴ酶基因在供氮为 ０ 时最大（为 １），之
后依次下降，变化幅度不大（图 ２ － Ｂ）；ＧＳ基因相对表
达量也在供氮为 ０ 时最大（为 １），之后下降，变化幅度
亦不大（图 ２ － Ｃ）。 当供氮 ６０００ｍｍｏｌ·Ｌ － １时 ＧＳ基因
的表达下降到 ０􀆰 ４６，下降了一半之多。
２􀆰 ４　 茶树叶片氮含量与 ＧＳ、ＧＤＨ酶基因表达关系
从图 ３ 可见，随着叶片氮含量的增加，ＧＳ 基因的
相对表达直线下降 （ ｙ ＝ １􀆰 ８７３２ － ０􀆰 ０７３５ｘ， ｒ２ ＝
０􀆰 ９５８４），而 ＧＤＨ 基因的相对表达却直线增加（ ｙ ＝
０􀆰 ３０８６ｘ － ２􀆰 ９５２７，ｒ２ ＝ ０􀆰 ８７７５）。
３　 讨论
氮在农业生产中占有非常重要的地位，植物氮代
谢机理及其调控一直备受关注，同时，氮肥利用率低及
过量施用氮肥造成水环境污染的问题也是世界性难
题。 植物中所有的氮，无论是直接来源于硝酸盐、氨离
子、氮固定或植物代谢过程中释放的氨，都必须经过
ＧＳ催化的反应途径，１ 个氮原子自土壤中吸收、同化、
再活化到最后积累为种子贮藏蛋白，需要经过多次 ＧＳ
催化的反应［１８］。 本研究表明，随着供氮浓度的增加，
叶片氮含量依次增加（图 １），这与前人在苹果［１９］、葡
萄［２０］、云杉［２１］、冬麦［２２］、水稻［２３］上观察到的结果相
似。
本研究表明缺氮下 ＧＳ（图 ２ － Ｃ）、ＧＯＧＡＴ（图 ２ －
Ｂ）基因的表达增强；ＧＤＨ 基因表达显著下降（图 ２ －
Ａ）。 有研究表明，水稻地上部分在短期缺氮胁迫下
ＧＳ、ＧＯＧＡＴ基因的表达都大幅度增加，这与本研究结
果相似，但是随着缺氮胁迫时间延长， ＧＤＨ、 ＧＳ、
ＧＯＧＡＴ等基因的表达量均大幅下降［２７］。 转 ＧＳ１ 与
７８９
核　 农　 学　 报 ２８ 卷
图 ３　 茶树叶片氮含量与 ＧＳ、ＧＤＨ酶基因表达关系
Ｆｉｇ ３　 Ｎ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｔｅａ ｔｒｅｅ ｌｅａｖｅｓ ｉｎ ｒｅｌａｔｉｏｎ ｔｏ ＧＳ、ＧＤＨ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ＧＳ２ 基因水稻植株，通过杂交实验结果证实，ＧＳ１ 和
ＧＳ２ 基因在转基因水稻的转录水平上得到了有效表
达。 高效表达 ＧＳ增强了转基因水稻对土壤氮素缺乏
的耐性，这一结果也与本文相似。 Ｓｕｎ 等［１０］也认为转
ＧＳ基因水稻，土壤氮素缺乏下，ＧＳ 基因高效表达，这
在甜菜叶片上也得出相类似的结果。 然而，在甜瓜［１３］
中却认为在硝态氮处理下，随着氮浓度的增加，ＧＳ２ 基
因的表达量增高，但是随着处理时间的延长而降低。
在铵态氮处理下，处理初期 ＧＳ２ 基因的表达水平随着
氮浓度的增大而降低，而后随着氮浓度的增加而升高。
然而还有人这样认为，ＧＳ１ 在耐低氮大麦基因型 ＢＩ －
０４ 中表达上调，而在低氮敏感大麦基因型 ＢＩ － ４５ 中
表现为下调表达［２８］。 这可能是试验氮肥处理方式及
物种不同的原因。
４　 结论
本研究表明，茶树叶片供氮含量与 ＧＳ 基因的表
达呈负线性相关（图 ３ － Ａ），与 ＧＤＨ 基因的表达呈正
线性相关（图 ３ － Ｂ）。 但是 ＧＳ 基因在不同组织、器官
及不同发育时期的表达调控非常复杂，而且受多重因
素的影响。 氮充足时，叶片氮含量与 ＧＳ、ＧＤＨ 基因的
表达应该没有关联。
参考文献：
［ １ ］　 张子义，伊霞，胡博，胡云才，刘景辉，樊明寿． 缺氮条件下燕麦
根轴细胞的程序性死亡［ Ｊ］ ． 中国农学通报， ２０１０， ２６（８）：１７５
－ １７８
［ ２ ］　 易泽夫．氮肥用量与有机无机复混肥对莴苣的产量和品质的影
响研究［Ｄ］．长沙：湖南农业大学，２００６：１２
［ ３ ］ 　 黄冰艳，高伟，苗利娟，严玫，张新友，董保红．谷氨酰胺合成酶基
因研究进展及其在植物氮代谢调控中的应用［ Ｊ］ ． 中国农学通
报，２０１０，２６（２３）：５３ － ５７
［ ４ ］　 Ｍｉｇｇｅ Ａ， Ｃａｒｒａｙｏｌ Ｅ， Ｈｉｒｅｌ Ｂ， Ｔｈｏｍａｓ Ｗ， Ｂｅｃｋｅｒ． Ｌｅａｆ⁃ ｓｐｅｃｉｆｉｃ
ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｓｔｉｄｉｃ ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ
ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｔｏｂａｃｃｏ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ ［Ｊ］ ． Ｐｌａｎｔａ， ２０００， ２１０（２）： ２５２ －
２６０
［ ５ ］　 Ｌａｍ Ｈ Ｍ， Ｃｏｓｃｈｉｑａｎｏ Ｋ Ｔ， Ｏｌｉｖｅｉｒａ Ｉ Ｃ， Ｏｌｉｖｅｉｒａ Ｒ Ｍ， ａｎｄ
Ｃｏｒｕｚｚｉ Ｇ Ｍ． Ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ａｓｓｉｍｉｌａｔｉｏｎ ｉｎｔｏ
ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｉｎ ｈｉｇｈｅｒ ｐｌａｎｔｓ［ Ｊ］ ． Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ
ａｎｄ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １９９６， ４７：５６９ － ５９３
［ ６ ］　 Ｓｔｉｔｔ Ｍ， Ｍｕｌｌｅｒ Ｃ， Ｍａｔｔ Ｐ， Ｇｉｂｏｎ Ｙ， Ｃａｒｉｌｌｏ Ｐ， Ｍｏｒｃｕｅｎｄｅ Ｒ，
Ｓｃｈｅｉｂｌｅ Ｗ Ｒ， Ｋｒａｐｐ Ａ． Ｓｔｅｐｓ ｔｏｗａｒｄｓ ａｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｖｉｅｗ ｏｆ
ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ［ Ｊ］ ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｏｔａｎｙ． ， ２００２，
５３（３７０）： ９５９ － ９７０
［ ７ ］　 Ｆｏｒｄｅ Ｂ Ｇ，Ｌｅａ Ｐ Ｊ． Ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ：ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，ａｎｄ
ｓｉｇｎａｌｉｎｇ［Ｊ］ ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ２００７， ５８（９）：２３３９
－ ２３５８
［ ８ ］　 Ｈａｂａｓｈ Ｄ Ｚ，Ｍ ａｓｓｉａｈ Ａ Ｊ，Ｒｏｎｇ Ｈ Ｌ，Ｗａｌｌｓｇｒｏｖｅ Ｒ Ｍ，Ｌｅｉｇｈ Ｒ Ａ．
Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ｉｎ ｗｈｅａｔ ［ Ｊ］ ． Ａｎｎａｌｓ ｏｆ
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００１，１３８（１）：８３ － ８９
［ ９ ］　 Ｍａｎ Ｈ Ｍ，Ｂｏｒｉｅｌ Ｒ， Ｅｌ⁃Ｋｈａｔｉｂ Ｒ， Ｋｉｒｂｙ Ｅ Ｇ． Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ
ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｏｐｌａｒ ｗｉｔｈ ｅｃｔｏｐｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐｉｎｅ ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ｇｌｕｔａｍｉｎｅ
ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ｕｎｄｅｒ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｖａｒｙｉｎｇ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ［ Ｊ］ ． Ｔｈｅ
Ｎｅｗ Ｐｈｙｔｏｌｏｇｉｓｔ，２００５，１６７（１）：３１ － ３９
［１０］　 Ｓｕｎ Ｈｕｉ， Ｈｕａｎｇ Ｑｉ⁃Ｍａｎ， ＳＵ Ｊｉｎ． Ｈｉｇｈｌｙ Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ
Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ Ｇｅｎｅｓ ＧＳ１ ａｎｄ ＧＳ２ ｉｎ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｉｃｅ Ｐｌａｎｔｓ
Ｉｎｃｒｅａｓｅｓ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ⁃ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ［ Ｊ ］ ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ
Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００５， ３１ （５）： ４９２ － ４９８
［１１］　 陈胜勇，李彩凤，马凤． 甜菜谷氨酰胺合成酶基因在不同氮素条
件下的表达分析［Ｊ］ ．作物杂志，２００８，（４）：６４ － ６７
８８９
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｒ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
２０１４，２８（６）：０９８５ ～ ０９８９
［１２］　 冯仁军，卢利方，程萍，袁克华，张银东． 巴西橡胶树谷氨酸脱氢
酶基因 ｃＤＮＡ片段克隆及表达分析［Ｊ］ ．西南大学学报，２００８，３０
（８）：１１５ － １１９
［１３］　 管闪青，张屹东，杨冬冬，黄丹枫．甜瓜谷氨酰胺合成酶基因在不
同氮素条件下的表达分析［ Ｊ］ ． 上海交通大学学报： 农业科学
版，２００７，２５（１）：２４ － ２７
［１４］　 林郑和， 钟秋生， 陈常颂，陈志辉，游小妹． 缺钾对茶树幼苗叶
片叶绿素荧光特性的影响［Ｊ］ ． 植物营养与肥料学报， ２０１２， １８
（４）： ９７４ － ９８０
［１５］　 林郑和， 陈常颂， 邬龄盛． 低磷胁迫下茶树根系 ＣＳ基因的克隆
及表达分析［Ｊ］ ． 茶叶科学， ２０１０， ３０（５）： ３６２ － ３６６
［１６］　 Ｌｉｎ Ｚ Ｈ， Ｑｉ Ｙ Ｐ， Ｃｈｅｎ Ｌ Ｓ， Ｚｈａｎｇ Ｆ Ｚ，Ｃｈｅｎ Ｒ Ｂ． Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ
ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ ｓｕｐｐｌｙ ｏｎ ｔｈｅ ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ ｇｒｅｅｎ ｔｅａ［ Ｊ］ ． Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，
２０１２， １３０： ９０８ － ９１４
［１７］　 林郑和，钟秋生，陈常颂． 茶树叶片 ＧＤＨ、ＧＳ、ＧＯＧＡＴ 基因的克
隆及荧光定量 ＰＣＲ分析［Ｊ］ ．茶叶科学，２０１２，３２（６）：５２３ － ５２９
［１８］　 Ｍａｒｔｉｎ Ａ， Ｌｅｅ Ｊ， Ｋｉｃｈｅｙ Ｌ． Ｔｗｏ ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ
ｉｓｏｆｏｒｍｓ ｏｆ ｍａｉｚｅ ａｒｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｇｒａｉｎ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ［Ｊ］ ． Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，２００６，１８：３２５２ － ３２７４
［１９］　 Ｃｈｅｎ Ｌ Ｓ， Ｃｈｅｎｇ Ｌ Ｌ． Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅｓ ａｎｄ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ
ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｏｆ ａｐｐｌｅ ｌｅａｖｅｓ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ ［ Ｊ］ ．
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００４， ７９ （６）：９２３
－ ９２９
［２０］　 Ｃｈｅｎ Ｌ Ｓ， Ｃｈｅｎｇ Ｌ Ｌ． Ｃａｒｂｏｎ ａｓｓｉｍｉｌａｔｉｎ ａｎｄ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ
ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｏｆ ｃｏｎｃｏｒｄ ｇｒａｐｅ（ｖｉｔｉｓ ｌａｂｒｕｓｃａ Ｌ． ） ｌｅａｖｅｓ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ
ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｓｕｐｐｌｙ［Ｊ］ ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｌ
Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２００３，１２８（５）：７５４ － ７６０
［２１］　 Ｇｌｏｓｅｒ Ｖ， Ｓｅｄｌáｅｋ Ｐ， Ｇｌｏｓｅｒ Ｊ． Ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ
ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｌｏｗ ｅｘｔｅｒｎａｌ Ｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｂｙ ｐａｔｃｈｙ Ｎ ｓｕｐｐｌｙ ｉｎ
Ｐｉｃｅａ ａｂｉｅｓ ａｎｄ Ｔｈｕｊａ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ［Ｊ］ ． Ｔｒｅｅｓ，２００９， ２３：１ － ９
［２２］　 Ｔａｒｔａｃｈｎｙｋ Ｉ Ｉ， Ｒａｄｅｍａｃｈｅｒ Ｉ， Ｋüｈｂａｕｃｈ Ｗ． Ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｉｎｇ
ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ａｎｄ ｆｕｎｇａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｗｉｎｔｅｒ ｗｈｅａｔ ｂｙ ｌａｓｅｒ⁃
ｉｎｄｕｃｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ［Ｊ］ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，２００６， ７：２８１ － ２９３
［２３］　 孙美莲，王云生，杨冬青，韦朝领，高丽萍，夏涛，单育，骆洋． 茶
树实时荧光定量 ＰＣＲ 分析中内参基因的选择［ Ｊ］ ． 植物学报，
２０１０，４５（５）：５７９ － ５８７
［２４］　 乔小燕，马春雷，陈亮． 茶树黄酮合成酶 ＩＩ基因全长 ｃＤＮＡ序列
的克隆和实时荧光定量 ＰＣＲ检测［Ｊ］ ． 茶叶科学，２００９，２９（５）：
３４７ － ３５４
［２５］　 Ｒａｎｓｂｏｔｙｎ Ｖ， Ｒｅｕｓｃｈ Ｔ Ｂ Ｈ． Ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ ｇｅｎｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ
ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌ⁃ｔｉｍｅ ＰＣＲ ａｓｓａｙｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｅａｇｒａｓｓ Ｚｏｓｔｅｒａ ｍａｎｎａ
ｓｕｂｊｅｃｔｅｄ ｔｏ ｈｅａｔ ｓｔｒｅｓｓ［Ｊ］ ． Ｌｉｍｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｏｃｅａｎｏｇｒａｐｈｙ： Ｍｅｔｈｏｄｓ，
２００６，４：３６７ － ３７３
［２６］　 Ｙｏｏ Ｗ Ｇ，Ｋｉｍ Ｔ Ｉ，Ｌｉ Ｓ，Ｋｗｏｎ Ｏ Ｓ，Ｃｈｏ Ｐ Ｙ，Ｋｉｍ Ｔ Ｓ，Ｋｉｍ Ｋ，Ｈｏｎｇ
Ｓ Ｊ． Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｎ Ｃｌｏｎｏｒｃｈｉｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ
ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｒｅａｌ⁃ｔｉｍｅ ＰＣＲ［ Ｊ］ ． Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００９，
１０４：３２１ － ３２８
［２７］　 罗凤，卢永恩，杨猛，练兴明． 氮胁迫对水稻营养生长期氮代谢
及相关基因表达量的影响［ Ｊ］ ． 华中农业大学学报，２０１２，３１
（１）：１６ － ２２
［２８］　 陈志伟，陆瑞菊，王亦菲，何婷，杜志钊，高润红，邹磊，单丽丽，黄
剑华．低氮胁迫下大麦谷氨酰胺酶基因的表达分析［ Ｊ］ ． 核农学
报，２０１０，２４（６） ：１１８２ － １１８４
Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｋｅｙ Ｅｎｚｙｍｅ Ｇｅｎｅｓ ｏｆ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ
Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｆｒｏｍ Ｔｅａ Ｔｒｅｅ Ｌｅａｖｅ ｕｎｄｅｒ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｅｖｅｌ
ＬＩＮ Ｚｈｅｎｇ⁃ｈｅ　 ＺＨＯＮＧ Ｑｉｕ⁃ｓｈｅｎｇ　 ＣＨＥＮ Ｃｈａｎｇ⁃ｓｏｎｇ　 ＣＨＥＮ Ｚｈｉ⁃ｈｕｉ　 ＹＯＵ Ｘｉａｏ⁃ｍｅｉ
（Ｔｅａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｆｕｊｉａｎ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｆｕ’ａｎ， Ｆｕｊｉａｎ　 ３５５０００）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ ｐｒｏｐａｇａｔｅｄ １０ － ｍｏｎｔｈ⁃ｏｌｄ ｔｅａ ［Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ （ Ｌ． ） Ｏ． Ｋｕｎｔｚｅ ｃｖ． Ｊｉｕｌｏｎｇｐａｏ］ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ
ｇｒｏｗｎ ｉｎ ｐｏｔｓ ｗｅｒｅ ｆｅｒｔｉｌｉｚｅｄ ｔｈｒｅｅ ｔｉｍｅｓ ｗｅｅｋｌｙ ｆｏｒ ２１ ｗｅｅｋｓ ｗｉｔｈ ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ０、６０、６００、６０００ ｍｍｏｌ·
Ｌ － １ ｎｉｔｒｏｇｅｎ． ＧＤＨ， ＧＳ， ＧＯＧＡＴ ｇｅｎｅ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｗｅｒｅ ｃｌｏｎｅｄ ｆｒｏｍ ｔｅａ ｌｅａｖｅ． Ｔｈｅ ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ｗａｓ
ＪＮ６０２３７１， ＪＮ６０２３７２ ａｎｄ ＪＮ６０２３７３ ｉｎ ｔｈｅ ＮＣＢＩ． Ｕｓｉｎｇ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ Ｒｅａｌ⁃ｔｉｍｅ ＰＣＲ， ＧＤＨ ｇｅｎｅ ｒｅｍａｒｋａｂｌｙ
ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｕｎｄｅｒ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ． Ｂｕｔ ＧＳ、ＧＯＧＡＴ ｇｅｎｅ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｕｎｄｅｒ ｎｉｔｒｏｇｅｎ
ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ． Ｔｈｅｎ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ， ｉｔ ｆｉｇｕｒｅｄ ｏｕｔ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｏｆ ＧＳ ｇｅｎｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｔｏ
ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｔｅａ ｔｒｅｅ ｌｅａｖｅ． ｂｕｔ ＧＤＨ ｇｅｎｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｔｏ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｔｅａ ｔｒｅｅ ｌｅａｖｅ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ； Ｇｅｎｅ； Ｃｌｏｎｅ； Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ
９８９