全 文 ：核 农 学 报!"#$%!"&"#$$#+) ($#A#
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收稿日期!"#$)*#*"#!接受日期!"#$)*$"*"$
基金项目!内蒙古自然科学基金项目-氮离子注入甘草基因差异表达的研究. ""#$"ZI#%$#
作者简介!刘腾!男!主要从事环境生物物理研究% 0*1234$)+",+&A$;gg>:71
通讯作者!郭九峰!男!教授!主要从事生物物理与生物技术研究% 0*1234$9=75[$#$;@382>:71 文章编号!$###*A%%$""#$%##*$#+)*$+
基于 :/M.*.D`J的 Mh离子注入甘草
当代根部基因表达分析
刘!腾!郭九峰!那!日!薛!丹
"内蒙古大学物理科学与技术学院H内蒙古自治区离子束生物工程重点实验室!内蒙 古呼和浩特!#$##"$#
摘!要!为研究离子束注入对甘草基因表达的影响!本文用低能 Mh离子束注入甘草种子!以未经处理的
同批甘草种子作为对照!利用 :/M.*.D`J技术分析甘草幼根基因的表达差异$以甘草幼根总 LM.为模 板!通过反转录合成 :/M.双链!使用 J@TF和 Z@XF酶切双链 :/M.!后经接头连接!预扩增!选择性扩增! 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳得到 :/M.*.D`J图谱$& 对选择性扩增引物总共出现条带 $%+ 条!差异条带 "A 条!约占总条带的 "#Q!对其中$#% 个表达差异显著的片段进行测序!最终得到 &" 个差异片段的核
苷酸序列# 通过 -42@T分析!其中 %, 条测序序列检索到与之同源性高的 /M.序列或已知功能的蛋白
1LM.序列$成功构建离子注入甘草的当代根部基因表达 :/M.*.D`J体系!证实了离子束注入甘草种 子对当代甘草根部基因表达的影响!为建立甘草品质育种提供参考# 关键词!离子束诱变$甘草$:/M.*.D`J$基因表达差异
/EF $$#G$$ A&H5>3@@8>$##*A%%$G"#$%G#>$#+)
!!离子束在生物上的应用是中科院余增亮等人开创
的新的诱变育种研究领域 $( % 通过高电压加速的离 子所携带的电信号及其形成的电场!影响生命过程中 的基因表达和调控)细胞内外的能量交换)物质传输) 信息传递!刺激损伤 /M.的修复)生物体的生长发育% 离子束诱变技术发展至今!已经在植物)微生物多个领 域取得重大进展 " BA( !成为生物诱变育种的主要手段 之一% 甘草"I9*9$$5.T& #$&+%*.1D3@:6#是世界上最著
名的药用植株之一% 植株的根和根茎积累大量的甘
草酸"94<:实!甘草酸及其水解产物甘草次酸在抗病毒等方面
具有很高的药用价值 & B $$( % 幼年甘草根部生物活性 高!各种酶促反应种类丰富!适合基因差异表达方向 的研究% 基因差异表达的研究方法有 //LU*JKL!:/M.* L/.! :/M.*.D`J等 $" B$,( % 其 中! :/M.*.D`J是 -2:6X1等 $)( $&& 年发明的结合 LU*JKL与 .D`J" 种技术的一种用于 LM.指纹分析的新方法!具有 /M.模板用量少)重复性好)多态性丰富等优点!是目 前用于研究筛选差异表达基因最有效的方法之一!并 在基因功能的全面分析以及发展遗传标记上具有广阔 的发展前景 $% B$A( % 杨全等 $&(应用 :/M.*.D`J研究 了甘草不同变异类型特异表达的基因% 近年来!甘草的离子束注入诱变已有多例!潘燕 等 "#(研究了 Mh离子注入对干旱胁迫下甘草幼苗 IE/)K.U酶活性及丙二醛含量的影响&魏盛林 等 "$ B",(从种子萌发和发育情况)幼苗耐旱性及多糖分 泌等方面研究了 Mh注入对甘草的影响% 而针对离子 束注入甘草种子对甘草基因表达方面的研究尚未见 报道% 研究离子注入对甘草基因表达差异的影响!对于 充分揭示离子束生物效应机理!进一步利用其改造甘 草植株具有重要意义% 本文采用离子束注入技术处理 甘草种子!建立 :/M.*.D`J分析体系!研究离子注入 对甘草幼根基因表达的影响!以期为建立甘草品质育 种提供参考% )+#$ ! 期 基于 :/M.*.D`J的 Mh离子注入甘草当代根部基因表达分析 !"材料与方法 !#!"试验材料 供试材料为乌拉尔甘草种子!用内蒙古大学离子 束生物物理重点实验室离子束注入机进行 Mh离子注 入!注入计量为 "G C$#$ (&G$ C$#$ 378@*:1B"!以未 经离子束注入的普通甘草种子作为对照组!并设置真 空对照!对照组与试验组种子后经水培萌发!后移栽于 花盆中在人工气候室中培育!根据张志梅等 ")(和周成 名等 "%( !选取 % 月龄根作为试验材料!液氮速冻后!置 于 B+#O低温保存备用% !#$"主要试剂 LM.S?XS J=?XJ428Ti3T"/J))$#)SRZ*U 3`92T378 i3T" mU"#" # 购 自 北 京 UF.MR0M 公 司& Z*Z` m LU2@X:/M.I<8T6X@3@i3T"/$,## 购自大连 U2i2L2宝 生物工程有限公司&:1/F购自加拿大 DX?1X8T2@公司) J1+F)U) /M. 3`92@X购自美国 U6X?17公司&接头引 物)预扩增引物)选择性扩增引物均于上海生工合成& " CJKLZ2@TX?Z3^购自美国 U6X?17公司% 其他药品 试剂均为国产分析纯% !#%"试验方法 $G,G$!总 LM.的提取及双链 :/M.的合成!取 ,## ()##19根组织!液氮中研磨后参照 UF.MR0M公司的 LM.S?XS J=?XJ428Ti3T"/J))$#说明书提取 LM.% 每 个提取试验重复 , 次!提取的 LM.合并一起备用% LM.质量检验$紫外分光光度和 $Q琼脂糖甲醛 变性凝胶电泳检测% :/M.双链的合成参照 U2i2L2公司的 Z*Z` m LU2@X:/M.I<8T6X@3@i3T"/$,##说明书完成% 将反应后的双链 :/M.溶液精制得到纯化的 :/M.!"精制过程参照 Z*Z` mLU2@X:/M.I<8T6X@3@ i3T"/$,##说明书#置于 B"#O保存备用% $G,G"!:/M.双链的酶切体系!用 :1/F和 J1+F两 种 限 制 性 内 切 酶 对 :/M.进 行 双 酶 切!体 系 为 P@:/M."$## 89*"` B$ # $# "` !$# CD2@T/39X@T-=[X? ""` !:1/F" $#f*"` B$ # $"` ! J1+F" $#f*"` B$ # $"` !超纯水 "` % 反应条件为 ,+O反应 $%138! %O灭活 % 138% $G,G,!接头连接!向酶切产物中加入 :1/F接头 "%#"174*`B$ # $"` )J1+F接头 " %"174*`B$ # $"` ) $# CU) /M. 3`92@X-=[X?""` )U) /M. 3`92@X"f) 超纯水定容至 "#"` % 短暂离心后!""O反应 $6! %O灭活 $#138% 酶切连接产物置于 B"#O保存 备用% 表 !"I@B2(2/XS接头与引物的核苷酸序列 L6),4!"I@B2(2/XS286+.-5698+5*A45:4RG49I4: 接头与引物 .P2ST7?28P J?31X? 碱基序列"%rB,r# -2@XIXg=X8:X"%rB,r# J1+F2P2STX?F BR.KR.UR.RUKKUR.RB J1+F2P2STX?( BU.KUK.RR.KUK.UB :1/F2P2STX?F BKUKRU.R.KURKRU.K.URK.B :1/F2P2STX?( BURU.KRK.RUKU.KB Z## BR.UR.RUKKUR.RU..KB J## BR.KURKRU.K.URK.RB ZMM BR.UR.RUKKUR.RU..KMMB JMM BR.KURKRU.K.URK.RMMMB $G,G)!预扩增体系与选择性扩增体系!酶切连接产 物不经稀释和稀释 $# 倍作为模板!按下表配比样品! 预扩增条件为 &)O变性 %138&&)O变性 )%@!#O退火 )%@!+"O延伸 +#@!循环 ,# 次&+"O延伸 $#138&)O 保存% 将预扩增产物稀释 "## 倍作为模板!按照下表 " 中的选择性扩增体系进行选择性扩增!选择性扩增引 物见表 "% 反应条件有 " 种$ 条件$$ &)O预变性 , 分钟&&)O变性 ,#@!%O退
火 ,#@!+"O延伸 $138!循环 ,% 次&+"O延伸 +138&)O 保存% 条件 "$&)O预变性 ,138&&)O变性 )#@!%O退火
)#@!每个循环降低 #G+O!+"O延伸 $138!循环$" 次&
&)O变性 )#@! %O退火 )#@! +"O延伸 $138!循环 ,# 次&+"O延伸$#138&)O保存%
$G,G%!变性聚丙烯酰胺凝胶电泳!取选择性扩增产 物 %"` 进行$Q琼脂糖凝胶电泳!使用改良银染法对
胶板进行银染与显色 "( %
$G,G!差异片段的回收"测序及同源比对!根据变 性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果!割下差异条带转入$G%1` 离心管中!加入 $##"` PPY"E&&%O加热$# (
"#138!反复颠倒振荡离心管!直至胶块充分溶解%
取 $"` 作为模板!以对应的选择性扩增引物作为扩 增引物!反应体系配比见表 ,!使用选扩程序再扩增% JKL反应体系 "#"` !所有体系成分均在冰浴中 添加% %+#$
核!农!学!报 "& 卷
表 $"I@B2(2/XS预扩增与选择性扩增 SNT反应体系 L6),4$"I@B2(2/XS+54(6A+,*;*I6.*-9698:4,4I.*346A+,*;*I6.*-9:7:.4A
预扩增反应体系
U6XI<@TX17[J?X*21S43[3:2T378
选择性扩增反应体系
U6XI<@TX17[IX4X:T3aX.1S43[3:2T378
酶切连接稀释产物"# C)$# C# ""` 预扩增稀释产物""## C#$"`
Z## $"` ZMM$"`
J## $"` JMM$"`
" CJKLZ2@TX?Z3^ $#"` " CJKLZ2@TX?Z3^$#"`
PPY"E "` PPY"E +"`
表 %"多态性片段扩增体系与测序扩增体系
L6),4%"S-,7A-5+M*I;560A49.6A+,*;*I6.*-9698:4RG49I46A+,*;*I6.*-9:7:.4A
多态性片段扩增体系
U6XI<@TX17[J74<17?S63:D?291X8T.1S43[3:2T378
测序扩增体系
U6XI<@TX17[IXg=X8:X.1S43[3:2T378
多态性片段 $"` 连接载体$#G#"`
ZMM $"` U+ "G%"` JMM$"` IJ "G%"`
" CJKLZ2@TX?Z3^ $#"` " CJKLZ2@TX?Z3^ "%G#"` PPY"E +"` PPY"E$#G#"`
!!取 $"` 多态性片段扩增产物进行微量检测!测定 产物浓度!按照 UF.MR0M公司的 SRZ*U克隆试剂盒 mU"#" 的要求!进行载体的连接 选用 UF.MR0M的普通琼脂糖凝胶 /M.回收试剂 盒"UF.M9X4Z3P3J=?3[3:2T378 i3T#将 JKL产物进行割 胶纯化!将割胶纯化产物送测序!测序公司为英潍捷 基!将测序结果进行 T]42@T8 同源性比对分析%$"结果与分析
$#!"总 TB2的提取质量 从提取的 LM.样品中取少量进行超微量紫外分 光光度计检测!E/"# HE/"A#比值在$GA ($G& 之间!含 量为 %## (+##89*"` B$&$Q琼脂糖甲醛变性凝胶电泳 检测如图$ 所示!可清晰分辨 "AI 和 $AI!几乎无降解 和 /M.!比较符合 :/M.*.D`J的试验要求%$#$"I@B2双链合成 使 用 U2i2L2 公 司 的 Z*Z` m LU2@X :/M. I<8T6X@3@i3T"/$,##试剂盒进行双链 :/M.的合成!
完成后进行 :/M.的精制% 取少量样品进行超微量紫
外分光检测!计算含量为 $$# ($%#89*"` B$!含量充 注$2$对照组!]$试验组 Z$/" ###% M7TX$2$ U6X:78T?2@T! ]$U6XTX@TZ$/" ###> 图 !"总 TB2电泳图 /*01!",4I.5-+M-54:*:-;.-.6,TB2 足!符合酶切要求% $#%"预扩增体系$选择性扩增体系的建立与优化 预扩增体系电泳$连接产物稀释 $# 倍作为模板的 体系!弥散区域偏大&连接产物直接作为模板的体系在 %## (+%#]S 附近出现弥散!且有 " 个及以上集中区 域!符合选择性扩增要求% " 套选择性扩增体系经 $Q琼脂糖凝胶电泳分析! 体系 $ 几乎无亮带!在 +%#]S 以上出现大量弥散!不符 合选择性扩增要求&体系 " 绝大多数引物组合能在 "## (%##]S 范围内明显分辨 " 条或者 " 条以上集中 亮带!符合选择性扩增要求!进行聚丙烯酰胺凝胶电泳 +#$ ! 期 基于 :/M.*.D`J的 Mh离子注入甘草当代根部基因表达分析 进行指纹分析&部分样品的的琼脂糖凝胶电泳即能较 为显著的分辨出相同选择性扩增引物扩增产物中对照 组与诱变试验组的差异条带!:/M.*.D`J的差异表达 已初步证实其存在"图 "#% 注$.$对照组!-$试验组 Z$/" ###% M7TX$.$ U6X:78T?2@T! -$U6XTX@TZ$/" ###> 图 $"选择性扩增体系电泳图 /*01$",4I.5-+M-54:*:-;:4,4I.*346A+,*;*48:7:.4A:+5-8GI.: $#<"选择性扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶优化 经琼脂糖凝胶电泳分析选择性扩增产物条带亮度 及清晰度!选择选择性扩增产物$变性甲酰胺 -=[X?为 )l$的比例!经 &%O%138 变性后!在聚丙烯酰胺凝胶上 跑胶!经改良法银染显色!聚丙烯酰胺凝胶电泳银染后 的照片中"图 ,#!可清晰分辨大量差异表达条带% 经 统计!对照组与处理组 & 对选择性扩增引物共 A$ 个反 应组!总共出现条带数 $ %+ 条!其中差异条带数 "A 条!约占总条带数的 "#Q% 注$.$对照组! -$试验组% M7TX$ .$Ki! -$ U?X21X8T@> 图 %"试验组与对照组部分片段差异表达标示图 /*0%"&5-G+8*;;4549I4:)4.C449.M4 4W+45*A49.6,05-G+698.M4 I-9.5-,;560A49.4W+54::*-9+5-;*,4 $#="I@B2(2/XS差异条带测序及序列同源性分析 将 JKL产物胶回收纯化产物 $#% 个样品送往英 潍捷基公司进行测序!共获得 &" 个可靠的测序结果% 根据测序结果!利用 -` .IU" 6TS$HH\\\>8:]3> 841>836>97a#分析系统的 T]42@T8 对差异片段进行序列 同源性分析% 通过序列比较!检索到 %, 个与之同源性 高的 /M.序列或已知功能的蛋白 1LM.序列!约占 测序数的 %+Q!另 ,& 条序列未比对出同源序列% !!通过来源分类可得$在 %, 个同源性比对序列中! 与豆科植物同源性较高的序列共有 " 条!其他植物同 源性较高的序列共有 $% 条!与动物及微生物同源序列 共有 $" 条&通过利用RE"9X8X78T7479<#基因注释功能 分析 "+(所获得的 %, 个同源序列!得到如下结果$有 + 条序列片段的同源基因可能参与生物体内的生化过 程!有 & 条序列片段的同源基因可能具有分子功能!, 条序列片段的同源基因可能直接或间接参与生物体内 细胞的组成"表 )#&在 %, 个同源序列中!有 ,# 条序列 同源比对为未知功能的蛋白或 1LM.序列!这些同源 序列的功能有待进一步研究% 本次试验结果中出现大量未知序列以及虽能找到 同源性但功能未知的序列!说明甘草基因相关方面的 研究较少!这部分序列可能具有很高的研究价值% 分 析认为至少包括以下几个方面的功能及作用$$ #本研
究主要是利用低能离子束注入甘草种子的当代分析!
所以推测存在某些应激蛋白相关基因在离子注入甘草
种子后表达!而这部分基因在未经处理的对照组中并
未表达&"#本试验先期的萌发试验结果表明!不同剂
量 Mh离子注入在不同程度上提高甘草种子的萌发
++#$核!农!学!报 "& 卷 !!!! 表 <"I@B2(2/XS差异片段与已知基因序列同源性的部分比较结果 L6),4<"2A+,*;*I6.*-9-;I@B2(2/XS-;,*I-5*I4T68*I,4 编号 M7> 长度 4X89T6H ]S 同源序列 67174797=@ 序列覆盖率 W=X?< :7aX?HQ H值 Ha24=X 登录号 .::X@@378 功能 D=8:T378$ B$",% K3:X?2?3XT38=1 :<:438*PXSX8PX8TN382@X0 B$ B43NX" E`K$#$%#,#A+ # ! T?28@:?3ST
a2?328Tc"! 1LM.
A, #G#" cZq##)%#"&,+G$鹰嘴豆细胞周期蛋白依赖性激酶 " B$ ,A+ R4<:38X12^ @T?X@@?X@S78@XS?7TX38 MIU$B 43NX" E`K$##++)A# ! 1LM.
& #G#### cZq##%AA")G$大豆应激蛋白 MIU$ B43NX" E`K$##++)A# 1LM.
" B" ,#, R4<:38X 12^ 94<:38X PX6 PX:2?]7^<42T389( ! 13T7:678P?324*43NX
" E`K$##+++%"A# ! 1LM. &, )G#0B#& cZq##,%%#"""G" 大豆线粒体甘氨酸脱氢酶"去羧基# 1LM. " B" ,$A R4<:38X12^ [47\X?389T31X:78T?74S?7TX38
DK.*43NX " E`K$##+A+&" # ! T?28@:?3ST a2?328Tc$! 1LM.
+$"G#0B$, cZq##,%%#&"G" 大豆开花时间控制蛋白 1LM.
" BAA ,AA K3:X?2?3XT38=1 ]XT2*:2TX838*43NXS?7TX38 $B43NX" E`K$#$)&%$,)# ! 1LM.
&% G#0B$, cZq##)%##)""G$ 鹰嘴豆 $B连环蛋白 1LM. , B$# $%# K2S@X42 ?=]X42 6" K.Lf- q a$###++)%19# 1LM.! :71S4XTX:P@ &" ,G$ cZq##"A $$&G$ 拟南芥近属的未知蛋白 1LM.!功能 未知 , B$, ,"+ R4<:38X12^ -0` $ B43NX 671X7P71238 S?7TX38 $ B 43NX " E`K$##A$",# # ! T?28@:?3STa2?328Tc$! 1LM. &# "G#0B$ cZq##,%,&$#,G" 大豆 -0` $ B43NX同源结构域蛋白! 1LM. , B$ $&$ ZXP3:297T?=8:2T=42:478XZUbD/qD0qDDq DR$R*-B", =8N87\8 1LM. & ,G#0B+ -U#%",))G$ 苜蓿未知功能 1LM. , B"+ ,)+ K3:X?2?3XT38=1S74<"?K# B]38P389S?7TX38 $ B43NX" E`K$#$%#&%#"# ! 1LM. &) "G#0B$, cZq##))&%#&G$ 鹰嘴豆的 S74<"?K#结合蛋白!1LM. , B)# &% IX42938X42=439387@242?9X@=]=83T?3]7@7124 LM.9X8X! S2?T324@Xg=X8:X& :647?7S42@T &) AG+ /W"&"A"G$ 卷柏大亚基核糖体 LM.基因的部分 序列!叶绿体 , B%$ ,$# J?=8=@2?1X832:2X8742@X1LM.! S2?T324 :P@ &% )G#0B$# .b&"A"#G$ 山杏烯醇化酶 1LM. , B%& ""$ K3:X? 2?3XT38=1 S74<9242:T=?782@X .T$9)A$## B 43NX " E`K$#$%#A#%% # ! T?28@:?3STa2?328Tc$! 1LM. &" $G#0BA cZq##)%#)%&+G$ 鹰嘴豆多聚半乳糖醛酸酶 率!推测认为有 " 方面原因造成这种结果$其一离子注 入对甘草硬实性种皮有一定的破坏作用!从而促进甘 草种子的萌发!其二认为离子注入使甘草中某些控制 生长发育的关键基因的差异表达有关&,#参与某些代 谢产物合成的基因有差异表达!可能影响根部代谢产 物的含量% %"讨论 低能离子束注入技术作为一种新的生物诱变技 术!具有能量沉积)动量传递)质量沉积和电荷交换等 过程!引发生物体各种复杂的物理化学效应!影响植物 细胞基因表达!离子束这一诱变源!具有突变谱宽!突 变频率高!对生物生理损伤小等特点% 低能离子束技 术在诱变育种领域已取得丰硕的成果!对诱变的分子 机理研究一直是人们研究的热点% 本试验通过构建 :/M.*.D`J体系对离子束处理 的甘草种子与未经处理的种子进行当代幼根部基因表 达的差异性分析!在当代根部基因表达的差异性方面 揭示离子束注入甘草种子对其当代的影响% 本文通过 对条件的反复优化 "A( !构建了 :/M.*.D`J体系!并反 映在变性聚丙烯酰胺凝胶图谱上!可见选择性扩增片 段!符合 :/M.*.D`J分析要求% 通过聚丙烯酰胺凝胶 电泳分析!可以显著分辨处理前后甘草幼根基因表达 的差异片段"图 "#% 这种差异主要体现在 " 个方面$ $#有无片段的差异% 出现这种差异的原因有 " 种可 能$一为离子束注入可能使某些基因序列发生突变!影 响了基因的表达&二为离子束注入造成甘草基因组序 列出现缺失或插入突变!表达的基因序列出现长度差 异% "#表达量的差异% 分析出现这种差异的原因有 A+#$ ! 期 基于 :/M.*.D`J的 Mh离子注入甘草当代根部基因表达分析 可能是多方面的!如离子束注入使基因启动区上游远 端序列发生突变!增强或抑制了该基因的表达&某些代 谢产物或者基因的诱导因子的量由于突变而发生改 变!从而影响了依赖于这些诱导物表达的基因发生表 达量的差异等% 这些推测需要进一步的理论和实验 证实% 在 %, 条找到同源性的序列中!有一些很有意义的 同源性片段!例如编号 " B$$ 的序列与大豆的应激蛋
白 MIU$B43NX" E`K$##++)A # 1LM.高 度 同 源
"W=X?<:7aX?k&Q#!推测该差异片段完整序列在甘
草中有类似的功能!这验证了离子注入甘草种子造成
甘草当代具有应激反应&编号 " B$与蛋白激酶具有同 源性的序列对甘草细胞内蛋白质磷酸化和去磷酸化进 而控制蛋白质活性具有很大的影响!这也说明离子注 入甘草种子影响了甘草当代幼根细胞内部某些生命调 控&此外!还有不少具有其他功能的蛋白同源性序列与 差异片段具有相当高的同源性% 综上所述!:/M.* .D`J基因差异表达分析技术有助于我们研究 Mh离 子注入甘草种子对其基因水平的作用!利用 :/M.* .D`J技术分析 Mh离子注入甘草种子当代的基因差 异表达获得初步的成效% <"结论 成功建立了甘草 :/M.B.D`J技术体系!利用该 技术系统分析了 Mh注入甘草种子诱导的根部的基因 表达差异% & 对选择性扩增引物总共出现条带$%+
条!差异条带 "A 条!约占总条带的 "#Q!对其中 $#% 个表达差异显著的片段进行测序!最终得到 &" 个差异 片段的核苷酸序列% 通过 -42@T分析!其中 %, 条测序 序列检索到与之同源性高的 /M.序列或已知功能的 蛋白 1LM.序列!通过利用 RE"9X8X78T7479<#基因注 释功能分析所获得的 %, 个同源序列!+ 条序列片段的 同源基因可能参与生物体内的生化过程!有 & 条序列 片段的同源基因可能具有分子功能!, 条序列片段的 同源基因可能直接或间接参与生物体内细胞的组成& 有 ,# 条序列同源比对为未知功能的蛋白或 1LM.序 列!这一结果为离子束注入技术在甘草上应用提供了 依据% 参考文献!$ (!余增亮>离子束生物技术引论 Z(>合肥$安徽科技出版社!$&&A
" (!陈恒雷!吕杰!曾宪贤>离子束诱变育种研究及应用进展 V(>
种子! "##%!")"# $)% B)+ , (!吴丽芳!李红>离子束生物工程应用研究进展V(>物理!$&&&!
"A"$"#$ +#A B+$" ) (!杨天佑>甘油保护对离子注入 0>:743存活的影响及离子束介导 /M.转化 0>:743/(>郑州$郑州大学! "##)
% (!周慧娟!叶正文!张学英!苏明申! 杜纪红! 张旻倩电子束辐照对
蓝莓品质及生理代谢的影响V(>核农学报! "#$,!"+"&#$ $,#A B$,$(!颉红梅! 卫增泉! 李兴林! 王浩瀚! 赵莲芝! 谢忠奎! 重离子束 注入小麦胚乳诱发的突变效应V(>核农学报! "##)!$A ""# $&, B& + (!常卫华! 徐燕霞! 王珂! 胡俊杰! 张红! 曹会萍! 马呈瑞! 张晶! 张勇>重离子束辐照对绵羊卵母细胞及体外受精卵早期发育的 影响V(>核农学报!"#$)!"A ",# $)", B)"A A (!陈争超! 张祥胜! 向廷生! 王慧敏! 低能离子束二次注入诱变石 油微生物菌株的研究V(>辐射研究与辐射工艺学报! "#$,!,$")#$ %) B%A
& (!刘丽萍!任翠爱!赵宏艳>甘草酸的免疫调节作用研究进展V(>
中国实验方剂学杂志! "#$#!$"# $"+" B"+$#(!王小丽!陈思东>甘草酸作用的研究进展 V(>中国医药导报!
"#$"!$"")# $"# B"$
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",# $ $% B$&
$"(!王和勇!陈敏!廖志华!孙敏>LD`J)L.J/).D`J分子标记及其
在植物生物技术中的应用V(>生物学杂志>$&&&!$ ")# $ ")
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