全 文 ：核 农 学 报!"#$%!"&"$## $$&H# )$&HH
!"#$%&’"()#*’+&$,-$.*#’/#$&’0*.+%*+1
收稿日期!"#$(*$#*"$!接受日期!"#$%*#.*$"
基金项目!浙江省科技计划项目""#$"I""#"&#
作者简介!黄福如!女!主要从事生物化学研究% /0123$ ]715LfXAA4el789:78;5
通讯作者!杨海龙!男!教授!主要从事发酵工程研究% /0123$ MU34el789:78;5
文章编号!$###*&..$""#$%#$#*$&H#*#’
响应面法优化米曲霉蛋白酶的双水相萃取条件
黄福如!罗颖飞!张!敏!杨海龙
"温州大学生命与环境科学学院!浙江 温州!(".#(.#
摘!要!为获得一种快速纯化米曲霉 ",14+$-.’#1"$5:&+!,?"$5:&+# 蛋白酶的方法!采用聚乙二醇
"YJ3M9[UM3959L3M;J3!V/G#T盐双水相系统!从米曲霉固态发酵粗提液中萃取蛋白酶!考察 V/G分子质
量$盐$V/G浓度$"E]%# " ?S% 浓度$Y]值$粗酶液加入量对蛋白酶萃取的影响!并以 +J=*+9U5N95 试验
设计结合响应面分析法优化了萃取条件’ 结果表明!选用 V/GT"E]% # " ?S% 双水相系统的最佳提取条
件为(V/G@H## 浓度 ".R!"E]%# " ?S% 浓度 "%Q&"R!Y]值 HQA’!粗酶液加入量为 "%Q#R!在此条件下
蛋白酶的提取率 A%Q’%R’ 双水相法为纯化米曲霉 ,?"$5:&+蛋白酶提供了一种有效的方法’
关键词!双水相&萃取&米曲霉&蛋白酶&响应面
-SC$$#Q$$&HAT682PP58$##*&..$Q"#$%Q$#8$&H#
!!双水相萃取体系 "1o79J7P[eJ*YU1P99=[X1;[2J5
PMP[90! ,FV?#是由低浓度的两种互不相溶的高分子
溶液或者一种的高分子和一种无机盐溶液形成!双水
相萃取具有传质速度快!分相时间短(能耗较低(分离
步骤少(效率高(处理容量大(条件温和(易于工业化放
大等优点 &$ @"’ % 由于条件温和不会引起生物活性物质
的失活或变性!尤其适合生物酶类物质的分离提取!双
水相萃取已被成功地应用于木聚糖酶 &(’ (脂肪氧合
酶 &%’ (脂肪酶 &.’ (多酚氧化酶 &H’ (溶菌酶 &’’ (碱性蛋白
酶 &&’等酶制剂的分离制备!选用适当的双水相体系可
以去除核酸(杂蛋白等!大幅提高目标酶蛋白的含
量 &(’ %
蛋白酶"VXJ[91P9#是催化蛋白质水解的一类酶!广
泛应用于毛皮(丝绸(皮革(医药(食品(酿造等行
业 &A’ !占全球酶制剂市场的 H#R% 蛋白酶可来源于植
物(动物和微生物!但由于生化多样性及其基因操作的
可行性!工业用蛋白酶主要通过微生物发酵制备% 米
曲霉",14+$-.’#1"$5:&+#是一种被美国食品药品管理局
"D-,#确认为安全的丝状真菌!是发酵制备蛋白酶的
重要菌种之一!其生产的蛋白酶应用于食品加工等诸
多领域 &$#’ % 目前米曲霉蛋白酶普遍采用硫酸铵分级
沉淀!再进行凝胶层析的纯化方法 &$$ @$"’ !硫酸铵用量
大!酶蛋白纯化后需经脱盐处理% 为获得一种操作简
单(效率高且能工业应用的米曲霉蛋白酶纯化方法!本
文采用双水相体系萃取米曲霉固态发酵初提液中的蛋
白酶!利用蛋白酶在双水相中的不同分配!达到与其它
杂质分离的目的% 应用响应面分析法优化双水相提取
米曲霉蛋白酶的条件!从而确定最佳的米曲霉蛋白酶
提取工艺%
!"材料与方法
!#!"材料
$Q$Q$!菌株!米曲霉 ",14+$-.’#1"$5:&+dm@"$H#!
温州大学发酵工程研究室保藏%
$Q$Q"!试剂!聚乙二醇"V/G@%##(V/G@H##(V/G
@$###( V/G @ "###( V/G @ %### #( E1"]VS%(
"E]% # " ?S%( "E]% # "]VS%(E1"?S%(ZL?S%(k]"VS%(
k"]VS% 等均为分析纯(干酪素(牛血清蛋白(考马斯
亮蓝 G".#"国药集团化学试剂有限公司#%
$Q$Q(!仪器!Fa@$&$# 紫外可见分光光度计"北京
普析通用仪器有限责任公司#*?9\95/1PMY]计&梅特
勒-托利多仪器"上海#有限公司’*+F$"%? 电子天平
"北京赛多利斯仪器系统有限公司#*Bi>*CC离心沉淀
#H&$
!$# 期 响应面法优化米曲霉蛋白酶的双水相萃取条件
机"上海医分仪器制造有限公司#*OJX[9=G9527P( 涡
旋混合器"德国 Ck,公司#%
!#$"方法
$Q"Q$!粗酶液的制备!以米曲霉为生产菌!接种至固
态培养基中培养!温度 (#^% %&U 后!称取一定量的固
体培养物于三角烧瓶中!加入 $# 倍量 Y]值 ’Q" 的磷
酸缓冲液!振荡提取 $.025(过滤得粗酶液"酶活 (H$A$
a)0B@$#!于 %^冰箱保藏备用%
$Q"Q"!双水相体系制备!先将 V/G配成质量分数
.#R的储备液! 然后与各种盐溶液混合配制成不同比
率的双水相体系溶液%
$Q"Q(!蛋白酶酶活力测定!紫外分光光度法% 在 Y]
值 ’Q"(%"^条件下! 每分钟水解干酪素产生 $ "L酪
氨酸定为一个酶活力单位!以 a)L@$表示%
$Q"Q%!蛋白质含量测定!考马斯亮蓝 G".# 法!牛血
清蛋白为标准品%
$Q"Q.!计算
相比 W_O[TO<"O[为上相体积!O<为下相体积#*
分配系数 k为上(下相酶活力之比!k_I[TI< "I[为上
相酶活!I<为下相酶活#*萃取率 j_WkT"$ KWk#!即
上相的酶活占体系总酶活的比例*纯化倍数 VD_上相
比活T粗酶液比活%
$Q"QH!单因素试验!影响双水相法萃取蛋白酶的因
素很多!如不同分子质量的 V/G!与 V/G组成双水相
的不同盐!组成双水相的盐浓度!Y]!温度!粗酶液加
入量等% 在响应面分析前!先做单因素试验选取试验
因素与水平%
"$# V/G分子量
配制质量分数为 "#R的不同分子量的 V/G"H##(
$###("###( %### # 溶液!加入 "#R 酶液和 $.R 的
"E]%# " ?S%!总体积 $#0B!振荡混匀!离心分相%
""# V/GH## 浓度
配制质量分数为 "#R(".R((#R((.R(%#R的
V/GH##!加入 "#R酶液和 $.R的"E]% # " ?S%!总体积
$#0B!振荡混匀!离心分相%
"(# 盐种类
以 ".R V/GH## 和 "#R酶液!分别与 $.R的
"E]% # " ?S%(E1"?S%(k"]VS%( "E]% # "]VS%(ZL?S%(
E1"]VS% 混合!总体积 $#0B!振荡混匀!离心分相%
"%# 盐浓度
配制质量分数为 $#R($.R("#R(".R((#R的
"E]% # " ?S%!与 "#R酶液和 ".R V/GH##!总体积
$#0B!振荡混匀!离心分相%
!!".# Y]值
将 ".RV/GH##!".R "E]% # " ?S% 和 "#R酶液混
合分别调 Y]值为 %(.(H(’(&!总体积 $#0B!振荡混
匀!离心分相%
"H# 加酶量
分别取 $#R( $.R( "#R( ".R( (#R粗酶液和
".RV/GH##!".R"E]% # " ?S% 混合!总体积 $#0B!振
荡混匀!离心分相%
$Q"Q’!+J=*+9U5N95 试验设计与响应面分析!通过单
因子试验确定影响蛋白酶双水相萃取的 ( 个重要因
素!做三因素三水平的响应面分析试验% 运用 ?,? 的
响应面 回 归 进行 响应 曲面分 析 "X9PYJ5P9P7Xf1;9
09[UJ:J3JLM!W?Z#!建立二次响应面回归模型% 分析
拟合的回归方程!确定最优工艺参数及最优响应因子
水平% 响应面法分析的因素与水平见表 $%
表 !"响应面试验的因素水平表
%&’()!"4&82,+/&1;()Q)(/0,++)/.,1/)
/-+0&8):)29,;,(,5N
因素
D1;[JX
代码
IJ:9
编码水平
IJ:25L39\93
@$ # K$
"E]% # " ?S% 浓度
"E]% # " ?S% ;J5;95[X1[2J5TR
i$ "# ". (#
Y]值
Y]\1379
i" . H ’
加酶量
IX7:995lM09;J5;95[X1[2J5TR
i( "# ". (#
$"结果与分析
$#!">M*分子量对萃取的影响
在低分子量 V/G体系中!蛋白酶主要集中在上相!
酶的分配系数较高*由表 " 可知!蛋白酶的分配系数(萃
取率(纯化倍数以 V/G@H## 最好!之后随 V/G分子量
的增加分配系数(萃取率和纯化倍数呈降低趋势%
$#$">M*浓度对蛋白酶萃取效应的影响
由表 ( 可知!在双水相体系中添加 "#R )%#R的
V/G@H##!蛋白酶萃取率在 A#QA$R )A%Q&"R之间!
在试验浓度范围内!萃取率差异不显著*分配系数以添
加 "#R的 V/G@H## 最大!达 $%QA’%
$#F"不同无机盐对蛋白酶萃取的影响
中性盐在双水相中电离时!产生了不同的相间电
位!随之影响了蛋白质的分配% 由表 % 可知!双水相萃
$H&$
核!农!学!报 "& 卷
表 $">M*相对分子质量对蛋白酶萃取的影响
%&’()$"M00)82/,0>M*:,()8-(&+<)3592,129).+,2)&/).&+2323,1
V/G分子量
V/G0J39;731Xe92LU[
分配系数 k
V1X[2[2J5 ;J9f2;295[k
相比 W
VU1P9\J3709X1[2JW
萃取率 j
/=[X1;[2J5 M293: jTR
纯化倍数 VD
V7X2f2;1[2J5 f1;[JXVD
H## $.Q&% $Q"’ A.Q"’ $Q.#
$### $Q"& #Q&A .(Q$. #Q’&
"### #Q$% #Q&" $#Q#H #Q#.
%### #Q(. #Q’A "$Q.( #Q$H
表 F">M*浓度对蛋白酶萃取的影响
%&’()F"M00)82/,0>M*BGHH 8,18)12+&23,1,129).+,2)&/).&+2323,1
V/GH## 浓度
V/GH## ;J5;95[X1[2J5TR
分配系数 k
V1X[2[2J5 ;J9f2;295[k
相比 W
VU1P9\J3709X1[2JW
萃取率 j
/=[X1;[2J5 M293: jTR
纯化倍数 VD
V7X2f2;1[2J5 f1;[JXVD
"# $%QA’ $Q"" A%Q&" $Q"&
". &Q$& $Q"" A#QA# $Q("
(# ’QH. $Q’& A(Q$. $Q"#
(. ’Q#. $QH( A"Q## #QA.
%# &QA( $Q&H A%Q(" $Q$&
表 K"不同无机盐对蛋白酶萃取的影响
%&’()K"M00)82/,029)c31;,031,+5&138/&(2,129).+,2)&/).&+2323,1
无机盐种类
C5JXL152;P13[
分配系数 k
V1X[2[2J5 ;J9f2;295[k
相比 W
VU1P9\J3709X1[2JW
萃取率 j
/=[X1;[2J5 M293: jTR
纯化倍数 VD
V7X2f2;1[2J5 f1;[JXVD
"E]% # " ?S% $%Q"( $Q"" A%Q.H $Q..
E1" ?S% $AQ"& $Q$( A.QH# "Q($
k"]VS% #Q#. "Q.’ $$Q$A #Q(H
"E]% # "]VS% #QA$ $Q$’ .$Q’$ #QA$
表 P"#E=K $ $7\K 浓度对蛋白酶萃取的影响
%&’()P"M00)82/,0#E=K$ $7\K 8,18)12+&23,1,129).+,2)&/).&+2323,1
"E]% # " ?S% 浓度
"E]% # " ?S% ;J5;95[X1[2J5TR
分配系数 k
V1X[2[2J5 ;J9f2;295[k
相比 W
VU1P9\J3709X1[2JW
萃取率 j
/=[X1;[2J5 M293: jTR
纯化倍数 VD
V7X2f2;1[2J5 f1;[JXVD
$. .Q’A $Q(& &&Q&& #Q’H
"# $%QH$ #Q&" A"Q"& $Q&$
". %HQ"$ #Q.H AHQ(# "QH#
(# $$Q$" #Q.% &.QHA #QAH
取体系中添加"E]% # " ?S% 或 E1"?S% 时蛋白酶主要分
配于上相!而添加 k"]VS% 或"E]%# "]VS% 时!蛋白酶
主要分配于下相% V/G@"E]% # " ?S% 体系中!蛋白酶
的萃取率为 A%Q.HR!纯化倍数为 $Q..*V/G*E1"?S%
体系中!蛋白酶的萃取率为 A.QH#R!纯化倍数为
"Q($% 但是 E1"?S% 较难溶解!所以 V/G@"E]% # " ?S%
体系较好%
$#K"#E=K$ $7\K 浓度对蛋白酶萃取的影响
盐的浓度显著影响蛋白质的水溶性!进而影响酶
蛋白在双水相体系的分配情况% 由表 . 可知!在
"E]%# " ?S% 浓度为 ".R时!分配系数(萃取率和纯化
倍数均为最大%
"H&$
!$# 期 响应面法优化米曲霉蛋白酶的双水相萃取条件
表 G".=值对蛋白酶萃取的影响
%&’()G"M00)82/,0.= ,129).+,2)&/).&+2323,1
Y]值
Y]\1379
分配系数 k
V1X[2[2J5 ;J9f2;295[k
相比 W
VU1P9\J3709X1[2JW
萃取率 j
/=[X1;[2J5 M293: jTR
纯化倍数 VD
V7X2f2;1[2J5 f1;[JXVD
% (#Q## #Q.% A%Q$’ "Q.’
. %(Q$’ #QH$ AHQ(H "QHH
H H%Q&# #QH’ A’Q’% "Q.#
’ $#Q$A #QH’ &’Q$’ $QH#
& $AQ$A #QH% A"Q%H $Q’(
表 ]"粗酶量对蛋白酶萃取的影响
%&’()]"M00)82/,029)(,&;315 :&//,129).+,2)&/).&+2323,1
粗酶量
IX7:995lM09;J5;95[X1[2J5TR
分配系数 k
V1X[2[2J5 ;J9f2;295[k
相比 W
VU1P9\J3709X1[2JW
萃取率 j
/=[X1;[2J5 M293: jTR
纯化倍数 VD
V7X2f2;1[2J5 f1;[JXVD
$# "%QA# #Q.H A(Q(% $Q’#
$. "’Q.’ #Q.H A(QA% (Q$$
"# %.Q(H #Q.H AHQ"( (Q"(
". .’Q(A #Q.% AHQ&’ (QH(
(# $.Q"’ #QH’ A$Q#. (Q(’
$#P".=值对蛋白酶萃取的影响
蛋白质分子可解离基团的离解度会因体系 Y]值
不同而不同!由表 H 可以看出!Y]值对蛋白酶在 V/G
@"E]% # " ?S% 双水相体系的分配行为影响很大!以
Y]值 HQ# 最佳!分配系数达 H%Q&#%
$#G"粗酶量对蛋白酶萃取的影响
由表 ’ 可看出!在 V/G@"E]% # " ?S% 双水相体系
中!粗酶量的多少对蛋白酶在体系中的分配行为影响
很大!在 $#R )".R范围!随着粗酶量的增加!分配系
数(萃取率逐惭增大!其中分配系数增幅很大% 粗酶量
以 ".R为最佳!分配系数达 .’Q(A!纯化倍数为 (QH(%
$#]"响应面优化
综合分析分配系数(萃取率两个指标!单因素试验
表明 V/G@H## 的添加量在试验范围内对蛋白酶的萃
取率影响不大!因此以 "E]% # " ?S% 浓度(Y]值(粗酶
量为变量!萃取率为响应值进行萃取条件的优化!试验
设计及结果见表 &!用多项式回归技术对试验数据进
行拟合!模型的方差分析结果见表 A% 由表 A 可知!模
型的一次项(二次项及总模型差异显著!而失拟项差异
不显著!说明此模型拟合是充分的!模型总回归的@" _
#QA"%" 说明该模型适用于优化双水相法萃取米曲霉
蛋白酶的工艺条件%
对试验数据进行多项式拟合回归!以蛋白酶萃取
率 j为因变量!"E]%# " ?S% 浓度"i$#(Y]值"i" #(粗
酶量"i(#为自变量建立回归方程$
j_A(QH$ @#Q&"i$ K$QAAi" @$Q%Ai( @%Q.Ai$
"
K#Q""i"i$ @$Q##i
"
" @$Q(’i(i$ K#Q$’i(i" @
(Q$’i(
"
表 W"S,OIS)91c)1实验设计及结果
%&’()W"R)/351&1;+)/-(2/,0S,OIS)91c)1
试验号
F9P[E70<9X
因素 D1;[JX
i$ i" i(
萃取率"j#
/=[X1;[2J5 M293:TR
$ @$ @$ # &&Q%(
" @$ $ # A#Q&(
( $ @$ # &%Q’&
% $ $ # &&Q#H
. # @$ @$ &AQ(H
H # @$ $ &%Q%$
’ # $ @$ A%Q$(
& # $ $ &AQ&’
A @$ # @$ &.Q"$
$# $ # @$ &’Q&’
$$ @$ # $ &HQ.A
$" $ # $ &(Q’H
$( # # # A(Q""
$% # # # A(Q#A
$. # # # A%Q.(
(H&$
核!农!学!报 "& 卷
表 C"模型的方差分析
%&’()C"TE\ZT0,+29);)Q)(,.);X-&;+&238.,(N1,:3&(:,;)(
方差来源
?J7X;9
自由度
=(
平方和
?70JfPo71X9P
@"
@*Po71X9
9值
9\1379
2值
2\1379
回归 W9LX9PP2J5
一次项 B2591X ( .%Q&&AA’# #Q"A’( HQ.% #Q#(.
二次项 c71:X1[2; ( $#’Q&&H$’’ #Q.&%% $"Q&. #Q##&’
交叉项 IXJPPYXJ:7;[ ( ’Q&%’H.# #Q#%". #QA% #Q%&A$
总回归 FJ[13ZJ:93 A $’#QH"(&#" #QA"%" HQ’& #Q#"%(
残差 W9P2:713
失拟项 B1;N Jff2[ ( $"Q’$A%"# HQH& #Q$("A
误差项 V7X99XXJX " $Q"H&&H#
总误差 FJ[139XXJX . $(QA&&"A"
!!根据响应面分析数据可以绘出响应面及其等高线
图!以确认"E]% # " ?S% 浓度(Y]值(加酶量三因素分
别对蛋白酶萃取率 的影响! 图 $ )图 ( 绘出了
"E]%# " ?S% 浓度(Y]值(粗酶量与蛋白酶萃取率的响
应面图%
图 !"硫酸铵浓度和 .=值对蛋白酶
萃取率的响应面图
4356!"V7D .(,2,0#E=K $ $7\K 8,18)12+&23,1
&1;.= ,129).+,2)&/))O2+&82315 +&2)
根据图 $ )( 响应面分析可以得出 i$ _@#Q#(H!
i" _#QA’$! i( _ @#Q"#$! 即 "E]% # " ?S% 浓度 为
"%Q&"R!Y]值为 HQA’!粗酶量为 "%Q#R!蛋白酶萃取
率的理论值为 A%Q’%R% 为了进一步验证最优培养条
件!采用上述条件进行了验证试验!共 ( 个平行!经测
定其双水相萃取的蛋白酶产率范围为 A(Q($R )
A&QH(R!平均值为 A.Q&$R!与理论预测值相比!相对
图 $".=值和粗酶量对蛋白酶萃取率
的响应面图
4356$"V7D .(,2,0.= &1;8+-;))1_N:)
8,18)12+&23,1,129).+,2)&/))O2+&82315 +&2)
误差为 $Q#’R!说明利用蛋白酶双水相萃取条件的优
化结果是可靠的%
F"讨论
米曲霉固态发酵制备蛋白酶!在初提物中包含酶
蛋白(底物分解产物(细胞组成物质等一系列的成分%
从发酵物纯化酶蛋白需要多步处理!最终的目标蛋白
收率非常低 &$(’ % 一般纯化的起始步骤包括硫酸铵沉
淀(丙酮分级等费时费力的方法 &$%’ % 双水相系统可直
接从微生物发酵液或固态发酵初提液中萃取酶蛋白!
虽然也含有一定的杂质!但该方法用于酶蛋白纯化的
起 始 阶 段 是 非 常 有 效 &(! & ! $( !$.’ % 对 2&+*.’"65*+1
%H&$
!$# 期 响应面法优化米曲霉蛋白酶的双水相萃取条件
图 F"硫酸铵浓度和粗酶量对蛋白
酶萃取率的响应面图
4356F"V7D .(,2,0#E=K $ $7\K 8,18)12+&23,1&1;
8+-;))1_N:)8,18)12+&23,1,129).+,2)&/))O2+&82315 +&2)
/;+$6"4;.’& >$& 固态发酵粗提液进行双水相萃取!最佳
体系为 $"Q.R的 V/G@%###!".R的"E]%# " ?S%!.#R
的粗酶液!Y]值 ’Q"!木聚糖酶提取率达 A&Q’R &(’ %
,FV? 纯化蛋白受到一系列因素的影响!如系统的
Y]值(盐的种类和浓度(聚合物的分子量和浓度(蛋白
特性"如结构(亲水性(分子量#等 &$H’ !为了获得高的收
率!,FV? 系统必须针对目标蛋白进行优化以使纯化物
中杂质最少 &(!$(’ %
V/G分子量通常影响酶提取的效率!一般来说酶
的分配系数随 V/G分子量的增加而降低 &’’ !蛋白酶的
双水 相 萃 取 系 统 中 常 用 分 子 量 %## 或 H## 的
V/G&$’ @$&’ % 但也有例外!谢芳等 &$A’确定双水相萃取
生姜蛋白酶的最适 V/G分子量为 % ###% 在 ,FV? 中
体系 Y]值对酶蛋白的分配有很大影响!一是影响蛋
白质分子中可离解基团的离解度而改变蛋白质分子所
带电荷的性质和数量!一般来说!带正电荷的蛋白位于
下相!而带负电荷的蛋白位于上相 &(’ *最适合 Y]值因
酶的不同而异!而过大或过小均会引起酶变性!降低酶
活性!从而影响酶的萃取率和分配系数*二是影响双水
相体系中盐的离解度而改变相间电位差!如体系 Y]
值与蛋白质的等电点相差越大!蛋白质在两相中分配
越不均匀!Y]值的微小变化甚至可能使蛋白质分子的
分配系数改变 " )( 个数量级 &$.’ % Y]值 %Q" 最有利
于猪胰蛋白酶的双水相萃取 &$’’ *Y]值 ’Q# 最有利于
木瓜蛋白酶的双水相萃取 &$&’ *而生姜蛋白酶双水相萃
取体系的最佳 Y]值为 &Q# &$A’ %
"E]%# " ?S% 用量不同!上下相电位差不同!而电
位差的大小直接影响到分配系数和萃取率 &$’’ % 另一
方面!"E]% # " ?S% 的质量分数愈高!会破坏酶表面的
水化层!进而破坏蛋白质胶体的稳定性!则使酶发生盐
析!使酶的分配系数和萃取率下降*另外!盐浓度过高
不仅影响蛋白质的表面疏水性!而且扰乱双水相系统!
改变各相中成相物质的组成和相体积比 &$’’ % 当有多
个因素对试验结果有影响时!常用的试验方法包括单
因子试验(统计学试验设计优化等!响应面法可以研究
影响因子的交互作用并确定各因子的最佳组合 &"#’ %
本文经响应面优化确定米曲霉蛋白酶双水相萃取的最
佳条件为$V/GH## @"E]% # " ?S% 双水相体系!V/G浓
度 ".R!"E]% # " ?S% 浓度 "%Q&"R!Y]值 HQA’!加酶
量为 "%Q#R%
K"结论
利用双水相法从米曲霉固态发酵初提液中萃取蛋
白酶是可行的!与传统的硫酸铵沉淀(膜分离(色谱纯
化等方法相比!步骤少(分离快速(效率高!并且在实际
生产中节省成本!具有很好的工业应用前景% 选择
V/G@硫酸铵双水相系统的最佳提取条件$V/GH## @
"E]%# " ?S%双水相体系!V/G浓度 ".R!"E]% # " ?S%
浓度 "%Q&"R!Y]值 HQA’!加酶量为 "%Q#R!蛋白酶的
提取率可达 A%Q’%R%
参考文献!
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