全 文 ：核 农 学 报摇 圆园员猿袁圆苑渊缘冤院园缘愿源 耀 园缘怨园
允燥怎则灶葬造 燥枣 晕怎糟造藻葬则 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 杂糟蚤藻灶糟藻泽
收稿日期院圆园员圆鄄园缘鄄圆源摇 接受日期院圆园员圆鄄园愿鄄圆园
基金项目院国家科技支撑计划渊圆园员员月粤耘园远月园愿冤
作者简介院董德臻渊员怨苑圆鄄冤袁男袁浙江杭州人袁硕士袁农艺师袁研究方向为农药创制遥 耘鄄皂葬蚤造院凿燥灶早凿藻扎澡藻灶岳 员远猿援 糟燥皂
管利莎渊员怨怨园鄄冤袁女袁嘉兴海宁人袁本科袁研究方向为动物科学遥 栽藻造院 员缘愿远苑员缘圆缘缘怨曰耘鄄皂葬蚤造院早造泽猿苑员圆猿源远岳 员远猿援 糟燥皂
董德臻与管利莎并列为第一作者
通讯作者院卢泳全渊员怨苑源冤袁女袁浙江临安人袁博士袁副教授袁主要从事分子生物学研究遥 耘鄄皂葬蚤造院造怎赠燥灶早择怎葬灶岳 员圆远援 糟燥皂
文章编号院员园园园鄄愿缘缘员渊圆园员猿冤园缘鄄园缘愿源鄄园苑
吡虫啉对褐飞虱 阅晕粤多态性的影响
董德臻员袁圆 摇 管利莎员 摇 童巧琼员 摇 吕梦园员 摇 王云佳员 摇 卢泳全员
渊员浙江农林大学亚热带森林培育国家重点实验室培育基地袁浙江 临安 猿员员猿园园曰圆浙江省化工研究院有限公司袁浙江 杭州 猿员园园圆猿冤
摘摇 要院吡虫啉在对抗水稻褐飞虱虫害中大量使用遥 本研究结合 陨杂杂砸 和 粤云蕴孕 分子标记技术检测吡虫
啉对褐飞虱的遗传多样性影响遥 利用 圆园 个 陨杂杂砸引物对连续施用吡虫啉的褐飞虱 怨 个世代的 员怨 份材
料扩增袁共获得 源怨 个位点袁其中只有 员 个位点出现特异性条带遥 利用 圆缘 对 粤云蕴孕 引物对供试材料扩
增袁结果共有 员员员 个扩增位点袁呈现多态性条带的位点 员员 个遥 共获得 缘怨 个多态性条带遥 其中多态性条
带比例最高的是 郧愿渊员园郾 圆豫 冤袁比例最低的是 郧员渊员郾 远怨豫 冤遥 多态性条带比例变化趋势表明袁在筛选的
早期 郧员尧郧圆 和 郧猿 世代袁褐飞虱对吡虫啉的应答较快曰在筛选的中期 郧源尧郧缘 和 郧远 世代袁褐飞虱对吡虫
啉的应答呈现较大幅度的波动袁变化范围在 员郾 远怨豫 耀 愿郾 源苑豫之间曰在筛选的晚期 郧苑袁郧愿 和 郧怨 世代袁褐
飞虱对吡虫啉的应答波动幅度较小袁趋于一个相对稳定的水平袁变化范围在 远郾 苑愿豫 耀 员园郾 圆豫之间遥 本
研究结果表明袁吡虫啉的连续使用袁可能会造成褐飞虱 阅晕粤的突变袁从而使害虫产生抗药性遥 本研究结
果为揭示褐飞虱抗药性产生的分子机理提供了重要信息遥
关键词院吡虫啉曰褐飞虱曰陨杂杂砸曰粤云蕴孕曰阅晕粤多态性曰抗药性
摇 摇 农药的大量使用造成很多害虫对农药都产生了抗
药性咱员 原 圆暂 遥 吡虫啉是 圆园 世纪 怨园 年代初问世的烟碱类
杀虫剂袁由于其高效低毒尧与其他杀虫剂很少有交互抗
性袁故在对抗水稻褐飞虱虫害中大量使用遥 在吡虫啉
的使用过程中袁靶标生物的抗药性问题一直备受关注遥
王彦华等咱猿暂对褐飞虱抗性测定方法尧抗药性的发展尧
交互抗性尧抗性遗传尧抗性机理及抗性治理等相关研究
进行了综述遥 相关资料表明袁田间褐飞虱种群对吡虫
啉已产生高水平到极高水平抗性遥 当杀虫剂被频繁
地尧高剂量地用来防治害虫时袁由于杀虫剂的选择作
用袁导致害虫对杀虫剂产生不同程度的抗药性袁这种抗
药性多为基因控制袁显性遗传咱源暂 遥 刘泽文等咱缘暂通过对
比敏感品系和室内连续筛选获得的高抗吡虫啉品系袁
在褐飞虱 圆 个 灶粤悦澡砸泽亚基 晕造琢员 和 晕造琢猿 中均发现了
抗性相关点突变 再员缘员杂遥 对头虱渊孕藻凿蚤糟怎造怎泽 澡怎皂葬灶怎泽
糟葬责蚤贼蚤泽 阅藻 郧藻藻则冤的抗药性研究表明袁钠通道基因的点
突变会导致头虱对苄氯菊酯抗药性咱远 原 愿暂 遥 乙酰胆碱酯
酶是有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂作用的靶标位点袁
该基因的点突变是引起乙酰胆碱酯酶对杀虫剂不敏感
性上升的重要机制袁目前已有 远园 多种昆虫对有机磷和
氨基甲酸酯类杀虫剂产生抗性袁其抗性均是由于编码
粤悦澡耘基因突变引起的咱怨暂 遥
目前对昆虫抗药性的分子机制研究主要是基于单
个靶标渊钠通道基因或 粤悦澡耘 基因冤抗性的研究遥 由于
昆虫的抗性是人为施加选择压力条件下产生的袁根据
自然选择理论的中性选择学说袁自然存在的生物群体
内经常发生中性突变袁这些中性突变在定向选择压力
下使被选择对象朝一定方向进化遥 由于杀虫剂的选择
压力是作用于被筛选对象的全部遗传物质袁因此仅仅
对单个或几个基因的研究不能反映抗性个体全基因组
变化的特点遥
分子标记是以个体间遗传物质的核苷酸序列变异
为基础的标记体系袁是 阅晕粤水平上遗传多态性的直接
反映遥 目前分子标记已被广泛用于遗传图谱构
建咱员园 原 员员暂 尧基因定位咱员圆 原 员猿暂和克隆咱员源暂等研究袁成为遗传
学研究的有力工具袁可以在全基因组范围揭示遗传物
源愿缘
摇 缘 期 吡虫啉对褐飞虱 阅晕粤多态性的影响
质的变异遥 匀葬憎噪藻泽 等咱员缘暂利用 孕悦砸鄄砸云蕴孕 在橄榄果蝇
月葬糟贼则燥糟藻则葬 燥造藻葬藻 的 粤悦澡耘 基因上检测到 圆 个对乐果不
敏感的突变渊陨圆员源灾 和 郧源愿愿杂冤袁分析发现这 圆 个突变
位点可以分别被 粤糟糟 陨和 月泽泽 匀陨陨内切酶切割遥 尽管该
研究是基于 砸云蕴孕 分子标记的袁但其针对的仍然是单
个的抗药性相关基因 粤悦澡耘遥 砸粤孕阅 技术曾一度应用
于检测与害虫抗药性有关的变异及分析昆虫种群遗传
结构咱员远 原 员苑暂 遥 在利用 砸粤孕阅 技术检测抗药性的研究中
发现袁在抗药性与敏感性的群体基因组之间袁能够用
砸粤孕阅反映的多态性水平非常低遥 陈克平等咱员愿暂用 圆园园
个 砸粤孕阅随机引物进行扩增袁仅获得 圆 个与家蚕耐氟
性有关的分子标记遥 周星石咱员怨暂选取了 圆园 种 砸粤孕阅 引
物对二斑叶螨抗性品系和敏感品系进行 孕悦砸扩增袁结
果只有 员 个引物在抗性品系中扩增出一条特异性条
带遥 另一方面袁随着对 砸粤孕阅技术稳定性的质疑袁该技
术目前已较少使用遥
已有的关于分子标记应用于生物抗药性的相关报
道多集中在利用分子标记对比分析抗性品系和敏感品
系的基因组结构间的差异遥 迄今尚未见利用分子标记
技术监测褐飞虱在抗性发生尧发展过程中基因组的变
化动态遥 本研究利用稳定性相对较好的 陨杂杂砸 渊 陨灶贼藻则鄄
泽蚤皂责造藻 杂藻择怎藻灶糟藻 砸藻责藻葬贼袁陨杂杂砸冤 标记咱圆园暂检测在吡虫啉
使用过程中褐飞虱群体的遗传物质在不同筛选世代间
的变化遥 已有的对单个抗药性相关基因的研究表明袁
阅晕粤的点突变是抗药性的重要遗传基础遥 但基于
孕悦砸 扩增的分子标记袁如 砸粤孕阅袁陨杂杂砸袁杂杂砸 等袁所能反
映的是 阅晕粤长度多态遥 为反映抗性产生过程中 阅晕粤
的位点突变袁本研究同时利用基于酶切的扩增片段长
度多态性 渊 粤皂责造蚤枣蚤藻凿 云则葬早皂藻灶贼 蕴藻灶早贼澡 孕燥造赠皂燥则责澡蚤泽皂袁
粤云蕴孕冤标记技术咱圆员暂检测吡虫啉对褐飞虱 阅晕粤 多态性
的影响袁以期获得褐飞虱在抗药性发生尧发展过程中群
体内部基因组结构的变化特点袁为害虫抗药性产生的
分子机理研究提供相关信息遥
员摇 材料与方法
员郾 员摇 供试材料
员郾 员郾 员摇 供试褐飞虱及样本处理摇 在浙江富阳中国水
稻研究所试验田内取天然单一群体的褐飞虱袁在室内
经连续多代饲养后袁获得对吡虫啉敏感的单一群体褐
飞虱作为初始材料袁将其命名为 郧园袁在试虫 猿 龄初期
取 员园园 头提取 郧园 阅晕粤遥 取样后袁对该初始群体施以
园郾 缘皂早窑蕴 原员的吡虫啉作为初始筛选压袁采集存活个体
产卵尧孵化后的若虫作为 郧员 试虫袁用养虫笼饲养繁
殖袁虫笼长 伊宽 伊高为 猿缘 糟皂 伊 猿缘 糟皂 伊 猿缘 糟皂袁苗盘
长 伊 宽为 圆远糟皂 伊 圆远糟皂遥 供试褐飞虱 猿 龄初期取样
渊活体冤用于 蕴悦缘园测试袁同时取 员园园 头虫体放入 原愿园益
超低温冰箱速冻保存袁用于提取施药前的 阅晕粤渊表 员
中用 郧员 原 粤 表示冤遥 其余试虫按照所测得的 蕴悦缘园施
药袁施药 猿凿后再次取 员园园 头虫体置于 原愿园益超低温冰
箱速冻保存袁用于提取施药后的 阅晕粤渊表 员 中用 郧员 原
月表示冤袁第 圆 次取样后剩余的虫体正常饲养袁直至产
卵结束袁进入下一个筛选周期渊郧圆冤遥 重复此方法并进
行以后各世代的取样遥 供试褐飞虱及所测得的各世代
蕴悦缘园浓度见表 员遥员郾 员郾 圆摇 褐飞虱 阅晕粤 的提取摇 模板 阅晕粤 的提取采用
悦栽粤月法咱圆圆暂 遥 取 员园园 头褐飞虱虫体置于研钵袁加液氮
磨成粉末袁将粉末迅速转入预热好的加有 愿园园滋蕴
悦栽粤月和 圆园滋蕴 茁 原巯基乙酸的 员郾 缘皂蕴 离心管中 远缘益
水浴 圆园皂蚤灶袁然后 员圆园园园则窑皂蚤灶 原员离心 员园皂蚤灶袁取上清液
加入 圆源誜员 的氯仿 辕异戊醇袁员圆园园园则窑皂蚤灶 原员离心 员园皂蚤灶袁
取上清 远园园滋蕴加入等体积无水乙醇 和 晕葬悦造 圆园园滋蕴袁
放入 源益 冰箱冷藏 员澡 后袁再于 员圆园园园则窑皂蚤灶 原员离心
员园皂蚤灶袁保留沉淀袁加入 源园园滋蕴 苑缘豫的无水乙醇袁员圆园园园
则窑皂蚤灶 原员离心 圆皂蚤灶袁最后加入 缘园滋蕴 栽耘 充分溶解得
阅晕粤遥 经电泳检测 阅晕粤的质量尧分光光度计测定各样
本 阅晕粤浓度后袁放入 原 圆园益冰箱冷藏备用遥
员郾 圆摇 陨杂杂砸分子标记
员郾 圆郾 员摇 陨杂杂砸 引物的筛选摇 选择 郧园 褐飞虱 阅晕粤作为
模板袁对 陨杂杂砸引物进行筛选遥 圆园滋蕴 孕悦砸 反应体系包
括院员园 伊 孕悦砸 月怎枣枣藻则 圆滋蕴袁阅晕粤模板 圆滋蕴袁酝早圆 垣 员郾 圆滋蕴曰
凿晕栽孕 员郾 远滋蕴袁引物 员滋蕴袁栽葬择 酶 园郾 圆滋蕴渊缘哉窑滋蕴 原员 冤袁蒸
馏水 员圆滋蕴遥 孕悦砸扩增程序为院怨源益预变性 缘皂蚤灶袁然后
进行 猿缘 个循环包括院怨源益变性 猿园泽袁缘园益退火 猿园泽袁
苑圆益延伸 员皂蚤灶遥 循环结束后 苑圆益延伸 员园皂蚤灶遥 对于
没有获得清晰 孕悦砸产物的引物袁在其他条件不变的情
况下在 源圆 耀 缘圆益之间调节退火温度袁以获得清晰的产
物遥 孕悦砸产物在 员豫琼脂糖凝胶上电泳袁凝胶成像系
统观察拍照遥 对于筛选出条带较明显的引物在相同条
件下重复 圆 次袁以确保结果的稳定尧可靠遥
员郾 圆郾 圆摇 陨杂杂砸鄄孕悦砸 产物电泳摇 利用筛选出的 陨杂杂砸 引
物对所提取的 员怨 个褐飞虱 阅晕粤 样本进行 孕悦砸 扩增遥
孕悦砸产物在 员郾 圆豫琼脂糖凝胶上电泳遥 统计标记产生
的位点数尧条带数以及多态性位点数和多态性条带数遥
多态性位点数是指该位点在 员怨 个供试材料中所扩增
的结果不同袁即该位点中至少有 员 个以上的材料不能
扩增出特异性条带遥
缘愿缘
核摇 农摇 学摇 报 圆苑 卷
表 员摇 不同世代褐飞虱的 阅晕粤多态性
栽葬遭造藻 员摇 阅晕粤 责燥造赠皂燥则责澡蚤泽皂 蚤灶 凿蚤枣枣藻则藻灶贼 早藻灶藻则葬贼蚤燥灶泽 燥枣 贼澡藻 遭则燥憎灶 责造葬灶贼澡燥责责藻则
样品编号
杂葬皂责造藻 晕燥援
世代
郧藻灶藻则葬贼蚤燥灶
筛选压
杂藻造藻糟贼蚤燥灶 责则藻泽泽怎则藻
渊员皂早窑蕴 原员 冤
取样时间
杂葬皂责造蚤灶早 贼蚤皂藻
陨杂杂砸多态性条带
晕怎皂遭藻则 燥枣 陨杂杂砸
责燥造赠皂燥则责澡蚤糟 遭葬灶凿
粤云蕴孕多态性条带
晕怎皂遭藻则 燥枣 粤云蕴孕
责燥造赠皂燥则责澡蚤糟 遭葬灶凿泽
粤云蕴孕多态性比例渊豫 冤
砸葬贼藻 燥枣 粤云蕴孕
责燥造赠皂燥则责澡蚤糟
员 郧园 园郾 缘 原 园 园 园
圆 郧员 园郾 愿 粤鄢 园 员 员郾 远怨
猿 月鄢 园 圆 猿郾 猿怨
源 郧圆 园郾 愿 粤 园 源 远郾 苑愿
缘 月 园 源 远郾 苑愿
远 郧猿 员郾 缘 粤 园 圆 猿郾 猿怨
苑 月 园 猿 缘郾 园愿
愿 郧源 圆 粤 园 缘 愿郾 源苑
怨 月 园 员 员郾 远怨
员园 郧缘 缘 粤 园 员 员郾 远怨
员员 月 园 猿 缘郾 园愿
员圆 郧远 员园 粤 园 猿 缘郾 园愿
员猿 月 园 猿 缘郾 园愿
员源 郧苑 员缘 粤 员 源 远郾 苑愿
员缘 月 园 缘 愿郾 源苑
员远 郧愿 员缘 粤 园 源 远郾 苑愿
员苑 月 园 远 员园郾 圆
员愿 郧怨 圆园 粤 园 源 远郾 苑愿
员怨 月 园 源 远郾 苑愿
摇 摇 注院粤袁 月分别代表施药处理前和施药处理后取样
晕燥贼藻院 粤 葬灶凿 月 则藻责则藻泽藻灶贼 泽葬皂责造蚤灶早 贼蚤皂藻 遭藻枣燥则藻 葬灶凿 葬枣贼藻则 贼则藻葬贼蚤灶早袁 则藻泽责藻糟贼蚤增藻造赠
员郾 猿摇 粤云蕴孕分子标记
员郾 猿郾 员摇 模板 阅晕粤 的酶切与连接摇 圆园滋蕴 酶切连接体
系包括 圆哉 运责灶 陨袁圆哉 酝泽藻玉袁员 伊酶切 月怎枣枣藻则 和 员园园灶早
阅晕粤袁猿苑益酶切 缘澡 后袁苑园益 员园皂蚤灶 终止酶切反应遥 取
酶切产物进行连接袁圆园滋蕴 连接体系包括 员园哉 的 栽源
阅晕粤 蕴蚤早葬泽藻袁员 伊 月怎枣枣藻则袁运责灶 陨 接头 缘责皂燥造窑滋蕴 原员袁酝泽藻玉
接头 缘园 责皂燥造窑滋蕴 原员袁连接产物 员缘滋蕴袁员远益连接过夜遥
员郾 猿郾 圆摇 阅晕粤片段的预扩增摇 圆园滋蕴 预扩增体系包括院
员 伊 孕悦砸 月怎枣枣藻则袁员滋蕴 运责灶 陨 引物渊缘园灶早窑滋蕴 原员冤袁 员滋蕴 酝泽藻
玉引物渊缘园灶早窑滋蕴 原员 冤袁员郾 远滋蕴 凿晕栽孕渊圆郾 缘皂皂燥造窑滋蕴 原员 冤袁
员郾 圆滋蕴 酝早悦造圆 渊 圆缘皂皂燥造窑滋蕴 原员 冤袁 园郾 圆滋蕴 栽葬择 阅晕粤
责燥造赠皂藻则葬泽藻渊缘哉窑滋蕴 原员冤袁圆滋蕴酶切连接产物遥 预扩增程
序为 怨源益预变性 猿皂蚤灶袁然后进行 圆源 个循环包括院怨源益
变性 猿园泽袁缘远益退火 猿园泽袁苑圆益延伸 员皂蚤灶遥 循环结束后
苑圆益延伸 员园皂蚤灶遥 预扩增完成后袁取 缘滋蕴 预扩增产物
和 员滋蕴 蕴燥葬凿蚤灶早 月怎枣枣藻则 混合后在 园郾 愿豫琼脂糖胶中检
测预扩增结果遥 根据检测结果将预扩增产物稀释 缘园
倍袁作为选择性扩增的模板遥
员郾 猿郾 猿摇 选择性扩增反应 摇 圆园滋蕴 选择性扩增体系包
括院员 伊 孕悦砸 月怎枣枣藻则袁上尧下游引物渊缘园灶早窑滋蕴 原员冤各 员滋蕴袁
员郾 远滋蕴 凿晕栽孕渊圆郾 缘 皂皂燥造窑蕴 原员 冤袁员郾 圆滋蕴 酝早悦造圆 渊圆缘皂皂燥造窑
蕴 原员冤袁园郾 圆滋蕴 栽葬择 阅晕粤 责燥造赠皂藻则葬泽藻渊缘哉窑滋蕴 原员 冤袁圆滋蕴 模
板渊预扩增产物稀释 缘园 倍冤遥 利用 栽燥怎糟澡凿燥憎灶 孕悦砸咱圆猿暂
进行选择扩增袁程序为院怨源益预变性 圆皂蚤灶曰怨源益 猿园泽袁
远缘益 猿园泽渊以后每个循环降低 园郾 苑益冤袁苑圆益员皂蚤灶袁员猿 个
循环曰然后在 缘远益退火袁其余条件不变情况下袁再进行
圆园 个循环曰循环结束后 苑圆益延伸 缘皂蚤灶遥
本试验所用接头尧预扩增引物尧选择扩增引物的序
列见表 圆袁其中选扩引物是表 圆 中所列的 缘 条上尧下游
引物的组合袁共有 圆缘 种组合方式遥
员郾 猿郾 源摇 孕粤郧耘电泳及银染检测摇 反应结束后袁用 远豫
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳袁并进行快速银染咱圆源暂 袁选
择具有清晰稳定的条带进行数据分析遥 统计位点数袁
条带数袁多态性位点数及多态性条带数袁计算不同世代
中多态性条带数的比例遥
远愿缘
摇 缘 期 吡虫啉对褐飞虱 阅晕粤多态性的影响
表 猿摇 筛选到的 陨杂杂砸引物序列
栽葬遭造藻 猿摇 杂藻择怎藻灶糟藻 燥枣 贼憎藻灶贼赠 责则蚤皂藻则泽 遭藻藻灶 泽藻造藻糟贼藻凿
引物
孕则蚤皂藻则
序列 渊缘忆 原 猿忆冤
杂藻择怎藻灶糟藻 渊枣则燥皂 缘忆 贼燥 猿忆冤
引物
孕则蚤皂藻则
序列 渊缘忆 原 猿忆冤
杂藻择怎藻灶糟藻 渊枣则燥皂 缘忆 贼燥 猿忆冤
哉愿圆圆 栽悦栽 悦栽悦 栽悦栽 悦栽悦 栽悦栽 悦粤 哉愿源远 悦粤悦 粤悦粤 悦粤悦 粤悦粤 悦粤悦 粤砸栽
哉愿苑园 栽郧悦 栽郧悦 栽郧悦 栽郧悦 栽郧悦 栽郧悦 哉愿缘圆 栽悦栽 悦栽悦 栽悦栽 悦栽悦 栽悦栽 悦砸粤
哉愿远圆 粤郧悦 粤郧悦 粤郧悦 粤郧悦 粤郧悦 粤郧悦 哉愿圆园 郧栽郧 栽郧栽 郧栽郧 栽郧栽 郧栽郧 栽悦
哉愿员圆 郧粤郧 粤郧粤 郧粤郧 粤郧粤 郧粤郧 粤粤 哉愿圆源 栽悦栽 悦栽悦 栽悦栽 悦栽悦 栽悦栽 悦郧
哉愿远员 粤悦悦 粤悦悦 粤悦悦 粤悦悦 粤悦悦 粤悦悦 哉愿圆远 粤悦粤 悦粤悦 粤悦粤 悦粤悦 粤悦粤 悦悦
哉愿员苑 悦粤悦 粤悦粤 悦粤悦 粤悦粤 悦粤悦 粤粤 哉愿圆苑 粤悦粤 悦粤悦 粤悦粤 悦粤悦 粤悦粤 悦郧
哉愿圆缘 粤悦粤 悦粤悦 粤悦粤 悦粤悦 粤悦粤 悦栽 哉愿圆怨 栽郧栽 郧栽郧 栽郧栽 郧栽郧 栽郧栽 郧悦
哉愿缘缘 粤悦粤 悦粤悦 粤悦粤 悦粤悦 粤悦粤 悦再栽 哉愿缘源 栽悦栽 悦栽悦 栽悦栽 悦栽悦 栽悦栽 悦砸郧
哉愿源猿 悦栽悦 栽悦栽 悦栽悦 栽悦栽 悦栽悦 栽砸粤 哉愿源愿 悦粤悦 粤悦粤 悦粤悦 粤悦粤 悦粤悦 粤砸郧
哉愿缘怨 栽郧栽 郧栽郧 栽郧栽 郧栽郧 栽郧栽 郧砸悦 哉愿缘园 郧栽郧 栽郧栽 郧栽郧 栽郧栽 郧栽郧 栽再悦
表 圆摇 本研究所用引物及接头序列
栽葬遭造藻 圆摇 孕则蚤皂藻则泽 葬灶凿 葬凿葬责贼燥则泽 怎泽藻凿 蚤灶 贼澡蚤泽 泽贼怎凿赠
引物 辕接头 孕则蚤皂藻则 辕 粤凿葬责贼燥则 序列渊缘忆 原 猿忆冤 杂藻择怎藻灶糟藻渊缘忆 贼燥 猿忆冤
运责灶陨 接头 运责灶陨 葬凿葬责贼燥则 云院 悦栽悦郧栽粤郧悦粤栽郧悦郧栽粤悦粤郧栽粤悦
砸院 栽郧栽粤悦郧悦粤栽郧悦栽粤悦
酝泽藻陨 接头 酝泽藻陨 葬凿葬责贼燥则 云院 栽粤悦栽悦粤郧郧粤悦栽悦粤栽悦
砸院 郧粤悦郧粤栽郧粤郧栽悦悦栽郧粤郧
预扩增引物 粤运孕则燥 云院 悦粤栽郧悦郧栽粤悦粤郧栽粤悦悦粤
砸院 郧粤栽郧粤郧栽悦悦栽郧粤郧栽粤粤悦
粤运杂员 云员院 悦粤栽郧悦郧栽粤悦粤郧栽粤悦悦粤栽郧悦
粤运杂圆 云圆院 悦粤栽郧悦郧栽粤悦粤郧栽粤悦悦粤郧郧悦
粤运杂猿 云猿院 悦粤栽郧悦郧栽粤悦粤郧栽粤悦悦粤郧郧
粤运杂源 云源院 悦粤栽郧悦郧栽粤悦粤郧栽粤悦悦粤郧粤
粤运杂缘 云缘院 悦粤栽郧悦郧栽粤悦粤郧栽粤悦悦粤郧悦
酝杂员 砸员院 郧粤栽郧粤郧栽悦悦栽郧粤郧栽粤粤悦郧郧
酝杂圆 砸圆院 郧粤栽郧粤郧栽悦悦栽郧粤郧栽粤粤悦粤粤
酝杂猿 砸猿院 郧粤栽郧粤郧栽悦悦栽郧粤郧栽粤粤悦粤郧
酝杂源 砸源院 郧粤栽郧粤郧栽悦悦栽郧粤郧栽粤粤悦悦悦
酝杂缘 砸缘院 郧粤栽郧粤郧栽悦悦栽郧粤郧栽粤粤悦悦粤
圆摇 结果与分析
圆郾 员摇 陨杂杂砸分子标记技术检测
摇 摇 本试验共筛选 苑远 个 陨杂杂砸 引物袁其中 圆园 个引物
可以产生稳定尧清晰的条带渊引物序列见表 猿冤遥 利用
上述 圆园 个引物对 员怨 个褐飞虱材料扩增袁获得 源怨 个
位点袁共 怨员猿 条谱带袁其中只有 员 个引物 哉愿远员 在第 员源
号材料中得到特异性 阅晕粤条带遥 该材料为褐飞虱 郧苑
施药前所取样本袁表明对其上一世代渊郧远冤褐飞虱施用
吡虫啉袁造成其后代在该 陨杂杂砸 引物扩增区内产生遗
传突变遥 其余 源愿 个位点在供试的 员怨 个样本中均呈现
一致的谱带袁表明经过吡虫啉筛选的不同世代的褐飞
虱 阅晕粤 在所筛选的 陨杂杂砸 引物扩增区域中没有发生
阅晕粤片段长度变异遥
图 员摇 陨杂杂砸分子标记结果
云蚤早援 员摇 砸藻泽怎造贼泽 燥枣 陨杂杂砸 皂葬则噪藻则泽
员 耀 员怨 泳道对应表 员 中的 员 耀 员怨 号材料曰箭头
指示多态性位点袁由 陨杂杂砸引物 哉愿远员 产生
栽澡藻 灶怎皂遭藻则 员 贼燥 员怨 糟燥则则藻泽责燥灶凿 贼燥 贼澡藻 葬糟糟藻泽泽蚤燥灶 灶怎皂遭藻则
蚤灶 贼葬遭造藻 员曰孕燥造赠皂燥则责澡蚤泽皂 泽蚤贼藻 早葬蚤灶藻凿 遭赠 哉愿远员 蚤泽 葬则则燥憎藻凿
摇
圆郾 圆摇 粤云蕴孕结果
利用 圆缘 对 粤云蕴孕引物对供试的 员怨 个样本进行选
择扩增遥 结果共获得 员员员 个扩增位点袁其中出现多态
性位点 员员 个袁供试的 员怨 个材料在这 员员 个多态性位点
共扩增出 缘怨 个特异性条带渊图 圆冤遥 研究结果表明吡
虫啉的施用使褐飞虱的基因组产生较高的单碱基突
变袁造成褐飞虱基因组 阅晕粤 的酶切位点发生改变袁因
此相同酶切割同一群体不同筛选世代的褐飞虱 阅晕粤
时所产生的谱带不同袁呈现不同世代样本间的多态性遥
苑愿缘
核摇 农摇 学摇 报 圆苑 卷
图 圆摇 粤云蕴孕分子标记结果
云蚤早援 圆摇 砸藻泽怎造贼泽 燥枣 粤云蕴孕 皂葬则噪藻则泽
员 原 员怨 泳道对应表 员 中的 员 耀 员怨 号材料曰
箭头指示多态性位点
栽澡藻 灶怎皂遭藻则 员 贼燥 员怨 糟燥则则藻泽责燥灶凿 贼燥 贼澡藻 葬糟糟藻泽泽蚤燥灶
灶怎皂遭藻则 蚤灶 贼葬遭造藻 员曰孕燥造赠皂燥则责澡蚤泽皂 泽蚤贼藻 蚤泽 葬则则燥憎藻凿
缘怨 个特异性条带在 员怨 个样本中所占比例如表 员
所示遥 其中比例最高的是 员苑 号材料所代表的 郧愿
渊员园郾 圆豫 冤袁比例最低的是 圆 号材料所对应的 郧员
摇 摇 摇 摇 摇
渊员郾 远怨豫 冤遥 敏感型褐飞虱 郧园 经过 员 次吡虫啉筛选袁
其 阅晕粤 的多态性比率为 员郾 远怨豫 袁虽然这一比例在所
有世代间为最低袁但仍表明敏感型群体在初次施用农
药便产生了低水平的碱基突变应答遥 特异性条带在不
同世代间的分布差异表明袁各世代的 阅晕粤突变比例存
在一定的变化趋势渊图 猿冤遥 根据多态性比例变化趋势
图袁可将 怨 个世代划分为 猿 个部分院筛选早期袁包括
郧员尧郧圆 和 郧猿 世代曰筛选中期袁包括 郧源尧郧缘 和 郧远 世
代曰筛选晚期包括 郧苑尧郧愿 和 郧怨 世代遥 在筛选早期褐
飞虱对吡虫啉的应答较快袁多态性比例变化范围在
员郾 远怨豫 耀远郾 苑愿豫之间曰在筛选中期褐飞虱对吡虫啉的
应答出现较大幅度的波动袁变化范围在 员郾 远怨豫 耀
愿郾 源苑豫之间曰在筛选晚期褐飞虱对吡虫啉的应答波动
幅度相对较小袁变化范围在 远郾 苑愿豫 耀 员园郾 圆豫之间遥 整
体变化趋势表明随着吡虫啉对褐飞虱筛选代数的增
加袁阅晕粤条带多态性比率整体上呈上升趋势遥
图 猿摇 多态性位点比例变化趋势图
云蚤早援 猿摇 砸葬贼藻 燥枣 责燥造赠皂燥则责澡蚤泽皂 悦澡葬灶早藻 贼则藻灶凿 蚤灶 凿蚤枣枣藻则藻灶贼 葬糟糟藻泽泽蚤燥灶泽
摇 摇 对应 蕴悦缘园的筛选压袁发现在筛选早期袁尽管筛选
压力较小袁郧员尧郧圆 和 郧猿 世代的 蕴悦缘园分别为 园郾 愿 皂早窑
蕴 原员尧园郾 愿皂早窑蕴 原员和 员郾 缘 皂早窑蕴 原员袁然而褐飞虱基因组多
态性条带比例变化范围较大袁可能是处于中性突变的
褐飞虱在吡虫啉筛选下袁其群体向有利于选择的方向
进化遥 在筛选中期 蕴悦缘园值变化较大袁郧源尧郧缘 和 郧远 世
代的 蕴悦缘园分别为 圆皂早窑蕴 原员尧缘皂早窑蕴 原员和 员园皂早窑蕴 原员袁相
应地袁褐飞虱基因组多态性条带比例变异也较大遥 可
能是褐飞虱为应答迅速增大的筛选压而在其基因组内
寻找对其有利的组合袁使其群体不断向抗药性方向进
化遥 而在筛选晚期袁蕴悦缘园值已达到 圆园皂早窑蕴 原员袁但褐飞
虱基因组多态性条带比例变异相对较小袁可能暗示经
过筛选中期的大幅度调整袁褐飞虱已经寻找到应答吡
虫啉的较佳基因组状态袁此时的褐飞虱群体已经由初
始的吡虫啉敏感型群体发展成对吡虫啉具有较高水平
抗性的不敏感群体遥
猿摇 讨论
随着分子生物学的快速发展袁分子标记的种类越
来越多袁使用也越来越广泛袁常被用于物种的遗传多样
性评价咱圆缘 原 圆远暂 遥 陨杂杂砸和 粤云蕴孕 是 圆 种比较常用的分子
标记方法遥 本研究利用 陨杂杂砸 标记分析了褐飞虱群体
在经历吡虫啉筛选后 阅晕粤的变异情况遥 由于 陨杂杂砸所
揭示的多态是短的重复序列渊即 杂杂砸冤之间 阅晕粤 的变
异袁在琼脂糖凝胶上不同高度位置的谱带所反应的是
愿愿缘
摇 缘 期 吡虫啉对褐飞虱 阅晕粤多态性的影响
孕悦砸产物长度的差异遥 这表明 陨杂杂砸 技术所揭示的是
基因组 杂杂砸位点之间由于碱基的插入 辕缺失产生的突
变遥 这种类型的突变对基因组的影响较大袁如果出现
移码突变袁会对基因的表达产生巨大影响袁往往不能在
群体内生存尧繁衍下去遥 这可能是前人用 砸粤孕阅 检测
害虫抗药性效率较低的主要原因咱员愿 原 员怨暂 遥 另一方面袁即
使偶尔在群体内发生对表达影响较小的插入 辕缺失突
变袁如果该突变在选择压力下不具备强有利的优势袁也
难以在后代群体中遗传下去遥 这可能就是本试验中用
陨杂杂砸技术在 郧苑 检测出的突变却在以后世代中消失的
原因遥 这一研究结果一方面表明抗药性产生过程中袁
由于碱基的插入 辕缺失产生的突变率很低袁同时也对前
人利用某一个或几个 砸粤孕阅 标记区分害虫的抗性 辕敏
感性提出了质疑遥 因为如果这一标记所扩增的 阅晕粤
区间变异不能在以后的筛选世代间稳定遗传袁那么利
用这种方法辨别生物的抗性 辕敏感性的可靠性可能会
很低遥
本研究同时采用的 粤云蕴孕是基于酶切的分子标记
技术袁它所反应的是基因组碱基突变所产生的多态性遥
本研究的结果表明袁在吡虫啉对褐飞虱的筛选过程中袁
基因组 杂杂砸位点之间由于碱基的插入 辕缺失产生的突
变很低袁而相对来说基因组单碱基突变频率较高遥
本研究利用 粤云蕴孕在不同筛选世代的材料间检测
出 缘怨 个多态性条带遥 这 缘怨 个突变位点是同一个功能
基因产生的可能性很小遥 这表明在抗药性产生过程
中袁靶标生物的全基因组范围内都发生一定数量的核
苷酸位点突变遥 另外袁本研究所揭示的多态性条带都
是基于 运责灶 陨 酶切产生的袁也就是说所揭示的多态位
点是由于 运责灶 陨酶切位点的碱基突变引起的遥 如果在
研究中结合使用其他不同作用位点的内切酶袁所能检
出的突变的比例将会更大遥
本研究发现袁在吡虫啉筛选的 郧苑袁褐飞虱已经发
展出 陨杂杂砸标记能够检出的多态性位点袁但这个位点在
以后的世代中却消失了遥 而 粤云蕴孕所揭示的多态性在
已经发展出抗性的筛选晚期的不同世代间也是不断变
化的遥 以上研究结果表明袁害虫的抗药性产生是一个
动态的发展过程袁这为农药的合理使用及应对害虫的
抗药性提供了理论依据遥
参考文献院
咱 员 暂 摇 林玉锁袁 龚瑞忠援 农药环境管理与污染控制咱 允暂 援 环境导报袁
圆园园园袁 猿院 源 原 远
咱 圆 暂 摇 肖 军袁 赵景波援 农药污染对生态环境的影响及防治对策咱 允暂 援
安徽农业科学袁 圆园园缘袁 猿猿 渊员圆冤院 圆猿苑远 原 圆猿苑苑
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究中的应用咱允暂 援 应用昆虫学报袁 圆园员员袁渊源愿冤院 员远苑 原 员苑猿
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远愿愿
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虫学报袁 圆园园员袁 源源 渊员冤院 员缘 原 圆园
咱员愿暂摇 陈克平袁 鲁 成袁 向仲怀援 悦造燥灶蚤灶早 葬灶凿 泽藻择怎藻灶糟蚤灶早 贼澡藻 砸粤孕阅
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生物技术学报袁 圆园园员袁 怨 渊圆冤院 员猿远 原 员猿愿
咱员怨暂摇 周星石援 抗药性二斑叶螨的分子标记初探咱 允暂 援 黑龙江农业科
学援 圆园园愿袁 远院 圆员 原 圆圆
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咱圆源暂摇 许绍斌袁 陶玉芬袁 杨昭庆袁 褚 嘉援 简单快速的 阅晕粤银染和胶保
存方法咱允暂 援 遗传袁 圆园园圆袁 圆源渊猿冤院 猿猿缘 原 猿猿远
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泽葬皂责造藻泽援 宰蚤贼澡 圆缘 责葬蚤则泽 燥枣 粤云蕴孕 责则蚤皂藻则泽袁 员员员 造燥糟蚤 憎藻则藻 燥遭贼葬蚤灶藻凿袁 燥枣 憎澡蚤糟澡 员员 泽蚤贼藻 凿蚤泽责造葬赠藻凿 责燥造赠皂燥则责澡蚤泽皂泽 憎蚤贼澡蚤灶
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