全 文 ：摇 核 农 学 报摇 圆园员圆袁圆远渊员冤院园员员愿 耀 园员圆圆允燥怎则灶葬造 燥枣 晕怎糟造藻葬则 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 杂糟蚤藻灶糟藻泽
收稿日期院圆园员员鄄园猿鄄园圆摇 接受日期院圆园员员鄄园愿鄄员远
基金项目院国家高技术研究发展计划课题渊圆园园远粤粤员园在源源怨冤
作者简介院张付凯渊员怨愿缘鄄冤袁男袁山东德州人袁硕士袁研究方向为食品安全检测技术遥 耘鄄皂葬蚤造院憎澡赠扎澡葬灶早枣怎噪葬蚤岳 员远猿郾 糟燥皂
通讯作者院潘家荣渊员怨远源鄄冤袁男袁广东高州人袁研究员袁研究方向为食品安全检测技术遥 栽藻造院园员园鄄远圆愿员缘愿苑缘曰耘鄄皂葬蚤造院 责葬灶躁则岳 圆远猿郾 糟燥皂
文章编号院员园园园鄄愿缘缘员渊圆园员圆冤园员鄄园员员愿鄄园缘
抗对硫磷基因工程四价抗体
在大肠杆菌中高效表达与鉴定
张付凯员 摇 乔亚奇员 摇 王摇 磊员 摇 兰丽平员 摇 潘家荣员袁圆
渊员郾 中国农业科学院农产品加工研究所 辕农业部农产品加工与质量控制重点开放实验室袁北京摇 员园园员怨猿曰
圆郾 中国计量学院生命科学学院袁浙江 杭州摇 猿员园园员愿冤
摘摇 要院为提高抗对硫磷基因工程四价抗体在大肠杆菌中可溶性表达量袁本研究利用克隆技术得到四价
抗体基因 泽糟鄄泽葬袁将该融合基因连接至表达载体 责栽韵鄄栽苑 的 赘序列和 栽苑 启动子下游袁构建成功的表达质
粒导入大肠杆菌 韵则蚤早葬皂蚤月渊阅耘猿冤袁经 陨孕栽郧诱导表达袁杂阅杂鄄孕粤郧耘 和 宰藻泽贼藻则灶 月造燥贼 鉴定表达产物袁晕蚤 亲和
层析纯化蛋白袁间接非竞争 耘蕴陨杂粤法测定该四价抗体的亲和力遥 结果表明在大肠杆菌 韵则蚤早葬皂蚤月渊阅耘猿冤
中表达分子量约为 源远噪阅葬的四价抗体袁园郾 员皂皂燥造 辕 蕴的 陨孕栽郧在 猿园益条件下诱导原核表达袁外源蛋白占菌
体总蛋白含量近 缘园豫 袁纯化后可溶性蛋白纯度在 怨园豫以上袁耘蕴陨杂粤 结果显示该抗体与对硫磷结合呈阳
性袁抗体效价在 员颐 员 伊 员园远 以上袁亲和常数为 远郾 愿源 伊 员园愿蕴 辕 皂燥造遥 与母源抗体和相应单链抗体相比袁利用
责栽韵鄄栽苑 载体四价抗体在大肠杆菌 韵则蚤早葬皂蚤月渊阅耘猿冤 中可实现高效表达袁且抗体效价和亲和力均得到进一
步提高遥
关键词院赘序列曰 四价抗体曰 原核表达
匀陨郧匀 蕴耘灾耘蕴 耘载孕砸耘杂杂陨韵晕 韵云 郧耘晕耘栽陨悦粤蕴蕴再 耘晕郧陨晕耘耘砸耘阅 栽耘栽砸粤灾粤蕴耘晕栽
粤晕栽陨月韵阅陨耘杂 粤郧粤陨晕杂栽 孕粤砸粤栽匀陨韵晕 陨晕 耘援 糟燥造蚤 粤晕阅 陨栽杂 陨阅耘晕栽陨云陨悦粤栽陨韵晕
在匀粤晕郧 云怎鄄噪葬蚤员 摇 匝陨粤韵 再葬鄄择蚤员 摇 宰粤晕郧 蕴藻蚤员 摇 蕴粤晕 蕴蚤鄄责蚤灶早员 摇 孕粤晕 允蚤葬鄄则燥灶早 员袁圆
渊员郾 陨灶泽贼蚤贼怎贼藻 燥枣 粤早则燥鄄枣燥燥凿 杂糟蚤藻灶糟藻 葬灶凿 栽藻糟澡灶燥造燥早赠袁 悦澡蚤灶藻泽藻 粤糟葬凿藻皂赠 燥枣 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 杂糟蚤藻灶糟藻泽袁
月藻蚤躁蚤灶早摇 员园园员怨猿曰 圆郾 悦燥造造藻早藻 燥枣 蕴蚤枣藻 杂糟蚤藻灶糟藻泽袁 悦澡蚤灶葬 允蚤造蚤葬灶早 哉灶蚤增藻则泽蚤贼赠袁 匀葬灶早扎澡燥怎袁 在澡藻躁蚤葬灶早摇 猿员园园员愿冤
粤遭泽贼则葬糟贼院栽燥 蚤皂责则燥增藻 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 燥枣 早藻灶藻贼蚤糟葬造造赠 藻灶早蚤灶藻藻则藻凿 贼藻贼则葬增葬造藻灶贼 葬灶贼蚤遭燥凿蚤藻泽 葬早葬蚤灶泽贼 责葬则葬贼澡蚤燥灶 蚤灶 耘援 糟燥造蚤 怎泽蚤灶早 燥责贼蚤皂葬造
糟燥皂遭蚤灶葬贼蚤燥灶 燥枣 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 责造葬泽皂蚤凿 葬灶凿 澡燥泽贼袁 葬枣贼藻则 遭藻蚤灶早 糟造燥灶藻凿袁 早藻灶藻 燥枣 贼藻贼则葬增葬造藻灶贼 葬灶贼蚤遭燥凿赠袁 灶葬皂藻凿 泽糟鄄泽葬袁 憎葬泽
泽怎遭糟造燥灶藻凿 蚤灶贼燥 凿燥憎灶泽贼则藻葬皂 责则燥皂燥贼藻则 燥枣 贼澡藻 增藻糟贼燥则 责栽韵鄄栽苑 糟燥灶贼葬蚤灶蚤灶早 葬灶 藻灶澡葬灶糟藻则 枣则燥皂 贼葬遭葬糟燥燥 皂燥泽葬怎糟 增蚤则怎泽 渊栽酝灾冤袁 赘
泽藻择怎藻灶糟藻援 栽澡藻灶 贼澡藻 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 增藻糟贼燥则 憎葬泽 怎泽藻凿 贼燥 贼则葬灶泽枣燥则皂藻凿 耘援 糟燥造蚤 韵则蚤早葬皂蚤月渊阅耘猿冤 枣燥则 责则燥噪葬则赠燥贼蚤糟 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶援 栽澡藻
责则燥凿怎糟贼 憎葬泽 蚤凿藻灶贼蚤枣蚤藻凿 遭赠 杂阅杂鄄孕粤郧耘 葬灶凿 宰藻泽贼藻则灶 月造燥贼援 粤糟贼蚤增蚤贼赠 燥枣 贼葬则早藻贼 责则燥贼藻蚤灶 憎葬泽 皂藻葬泽怎则藻凿 憎蚤贼澡 耘蕴陨杂粤 葬枣贼藻则
责怎则蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 怎泽蚤灶早 晕蚤鄄晕栽粤 糟澡藻造葬贼蚤灶早 葬枣枣蚤灶蚤贼赠 糟澡则燥皂葬贼燥早则葬责澡赠援 栽澡藻 则藻泽怎造贼泽 泽澡燥憎藻凿 贼澡葬贼 杂阅杂鄄孕粤郧耘 葬灶凿 宰藻泽贼藻则灶 月造燥贼
葬灶葬造赠泽蚤泽 凿藻皂燥灶泽贼则葬贼藻凿 贼澡葬贼 贼澡藻 贼藻贼则葬增葬造藻灶贼 葬灶贼蚤遭燥凿赠 憎葬泽 澡蚤早澡造赠 蚤灶 贼澡藻 枣燥则皂 燥枣 遭燥贼澡 蚤灶糟造怎泽蚤燥灶 遭燥凿赠 葬灶凿 泽燥造怎遭造藻 责则燥贼藻蚤灶 憎蚤贼澡
葬 责怎则蚤贼赠 怎责 贼燥 怨园豫 援 栽澡藻 则藻泽怎造贼泽 燥枣 耘蕴陨杂粤 泽澡燥憎藻凿 贼澡葬贼 葬灶贼蚤遭燥凿赠 造蚤贼藻则 憎葬泽 葬遭燥怎贼 员颐 员园远 葬灶凿 葬枣枣蚤灶蚤贼赠 糟燥灶泽贼葬灶贼 憎葬泽 远郾 愿源 伊
员园愿蕴 辕 皂燥造援 悦燥皂责葬则藻凿 贼燥 皂葬贼藻则灶葬造 葬灶贼蚤遭燥凿赠 葬灶凿 杂糟云增 渊泽蚤灶早造藻 糟澡葬蚤灶 云增 葬灶贼蚤遭燥凿赠冤袁 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 造藻增藻造 葬灶凿 遭蚤燥葬糟贼蚤增蚤贼赠 燥枣
贼藻贼则葬增葬造藻灶贼 葬灶贼蚤遭燥凿赠 澡葬凿 蚤皂责则燥增藻凿 泽蚤早灶蚤枣蚤糟葬灶贼造造赠 憎蚤贼澡 贼澡藻 葬责责造蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 增藻曾贼燥则 责栽韵鄄栽苑 蚤灶 耘援 糟燥造蚤 韵则蚤早葬皂蚤月
渊阅耘猿冤援
运藻赠 憎燥则凿泽院赘 泽藻择怎藻灶糟藻曰 贼藻贼则葬增葬造藻灶贼 葬灶贼蚤遭燥凿蚤藻泽曰 责则燥噪葬则赠燥贼蚤糟 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶
愿员员
摇 员 期 抗对硫磷基因工程四价抗体在大肠杆菌中高效表达
摇 摇 大肠杆菌表达系统具有生长快尧成本低尧遗传背景
清楚等诸多优点袁是目前发展最为完善的表达系统之
一袁但由于该系统普遍存在包涵体表达量过高的缺陷袁
限制了其在基因工程抗体中的广泛应用遥 近年来袁对
于包涵体形成的原因主要包括表达量过高尧胞质内环境
的还原性尧缺乏必要的酶和辅助因子咱员暂 遥 与此同时袁研
究者提出了可溶性表达策略袁包括选择合适的表达载体
和宿主菌尧低温诱导外源蛋白表达尧抑制副产物生成尧采
用融合标签技术咱圆暂 袁另外还有对外源蛋白基因的修饰与
改造等袁但目前尚没有通用的方法来解决包涵体问题遥
已有多篇文章报道以链霉亲和素介导构建基因工程四
价抗体咱猿 耀 缘暂 袁但均存在表达量不高尧可溶性目的蛋白较
少以及抗体结合位点与理论值不一致等问题遥
增强子的引入可作为外源基因表达载体的一种改
造方法袁赘序列是烟草花叶病毒渊栽酝灾冤前导序列袁长
度是 远愿遭责袁位于 缘忆端非翻译区袁可作为增强子调控基
因表达遥 研究表明袁栽酝灾 赘序列能提高外源基因转译
效率咱远暂 袁并改善过量表达情况下融合蛋白的可溶性袁
利用 栽酝灾 赘序列已构建多个植物高效表达载体袁显著
提高外源基因特异性表达袁但原核表达载体中引入
栽酝灾 赘序列的研究较少遥
利用基因工程的方法改造抗体可提高抗体效价与
亲和力袁完成对传统抗体在基因水平上的改造袁在此基
础上还能构建新型抗体袁极大丰富了抗体工程内涵遥 抗
对硫磷基因工程四价抗体基因是核心链霉亲和素与单
链抗体基因通过连接肽基因拼接获得咱苑暂 袁结果显示抗体
亲和力得到提高袁在原核表达过程中普遍遇到大量包涵
体存在及可溶性蛋白含量不高的问题咱愿暂 袁本研究在前人
工作的基础上袁拟将四价抗体基因克隆至含有 栽酝灾 赘
序列的表达载体袁经合适的表达宿主菌株实现四价抗体
高效表达袁优化表达条件建立重组蛋白的纯化方法袁为
下游蛋白结构分析和检测方法建立奠定基础遥
员摇 材料与方法
员郾 员摇 材料
抗对硫磷基因工程四价抗体基因 泽糟鄄泽葬 由本实验
室构建袁以质粒渊责耘栽鄄泽糟鄄泽葬冤形式保存袁表达载体 责栽韵鄄
栽苑 由厦门大学生命科学学院罗文新教授惠赠袁大肠杆
菌 韵则蚤早葬皂蚤月渊阅耘猿冤由本实验室保存袁大肠杆菌 栽则葬灶泽 员园
购自北京全式金生物技术公司遥
栽源 阅晕粤连接酶尧蛋白分子量标准尧阅晕粤 柱式胶回
收试剂盒购于北京全式金生物科技公司袁限制性内切
酶购自日本 栽葬运葬砸葬 公司袁鼠抗 粤灶贼蚤鄄匀蚤泽 抗体尧羊抗鼠
陨早郧鄄匀砸孕及沉淀型单组分 栽酝月 显色试剂盒均购于北
京康为世纪生物科技公司遥 质粒提取试剂盒购自
韵皂藻早葬公司袁引物由北京擎科生物有限公司合成遥 对
硫磷鄄韵灾粤连接物由本实验室制备遥
员郾 圆摇 引物设计
根据抗对硫磷四价抗体基因序列设计引物遥 引物
序列如下院
泽糟鄄泽葬缘云院 缘忆鄄郧郧郧栽粤栽栽悦郧粤粤栽栽悦悦粤郧郧栽郧悦粤粤悦栽郧
悦粤郧郧粤郧栽悦鄄猿忆袁
泽糟鄄泽葬猿砸院 缘忆鄄悦悦郧粤粤郧悦栽栽郧郧粤郧郧悦郧郧悦郧郧粤悦郧郧
悦栽栽鄄猿忆遥 缘忆端引物加入 耘糟燥砸玉 酶切位点袁猿忆端引物加
入 匀蚤灶凿 芋 酶切位点遥
员郾 猿摇 抗对硫磷四价抗体基因克隆与鉴定
以含有抗对硫磷四价抗体基因的质粒为模板袁泽糟鄄
泽葬缘云和 泽糟鄄泽葬猿砸为引物扩增抗对硫磷四价抗体基因袁
孕悦砸反应条件为院怨源益预变性 缘皂蚤灶曰怨源益变性 猿园泽袁
远猿益退火 猿园泽袁苑圆益延伸 怨园泽袁循环扩增 猿园 次曰苑圆益延
伸 员园皂蚤灶遥 利用胶回收试剂盒对目的片段进行胶回
收遥 将目的片段与 责耘粤杂再鄄月造怎灶贼 载体连接袁连接产物
转化 栽则葬灶泽 员园 大肠杆菌感受态细胞袁涂布于含有
缘园滋早 辕 皂造卡那霉素的 蕴月 培养基上袁菌落 孕悦砸 法筛选
阳性菌落袁挑取单菌落过夜摇菌袁参考质粒提取试剂盒
操作说明提取质粒袁质粒命名为 责耘粤杂再鄄泽糟鄄泽葬袁以 孕悦砸
和双酶切完成初步鉴定袁阳性克隆送北京三博远志生
物技术有限公司测序遥 用 阅晕粤酝粤晕 软件分析测序结
果遥
员郾 源摇 抗对硫磷四价抗体表达载体的构建
将质粒 责耘粤杂再鄄泽糟鄄泽葬 与 责栽韵鄄栽苑 分别用 耘糟燥砸陨 和
匀蚤灶凿 芋双酶切袁回收酶切后的片段进行连接袁转化至
大肠杆菌 栽则葬灶泽 员园袁筛选出阳性重组质粒袁表达质粒命
名为 责栽鄄泽糟鄄泽葬袁经 孕悦砸和酶切鉴定正确后袁将质粒转入
韵则蚤早葬皂蚤月渊阅耘猿冤大肠杆菌中遥
员郾 缘摇 抗对硫磷四价抗体基因的表达和 杂阅杂鄄孕粤郧耘 检
测
挑取单菌落于 猿皂造 蕴月新鲜液体培养基中 猿苑益培
养过夜袁按 员颐 员园园 稀释至 蕴月 液体培养基中袁猿苑益振荡
培养至 韵阅远园园 达 园郾 缘 耀 园郾 愿袁加 陨孕栽郧 至终浓度为园郾 圆皂皂燥造 辕 蕴袁继续于 员苑益培养过夜袁初步诱导目的基因
表达袁离心收集菌体后进行 杂阅杂鄄孕粤郧耘 分析遥 以 陨孕栽郧
浓度尧诱导时间尧诱导温度为 猿 个因素袁分别设置 猿 个
水平筛选最优表达条件遥
员郾 远摇 四价抗体的亲和纯化及宰藻泽贼藻则灶 月造燥贼检测
参考 晕蚤介质纯化 匀蚤泽鄄贼葬早融合蛋白说明书袁将收集
到的菌体重悬袁加入溶菌酶袁超声波破碎后分别纯化上
怨员员
核摇 农摇 学摇 报 圆远 卷
清和沉淀袁优化蛋白纯化条件袁电泳检测纯度袁对纯化结
果进行宰藻泽贼藻则灶 月造燥贼检测袁将纯化得到的四价抗体按常
规进行 杂阅杂鄄孕粤郧耘 凝胶电泳袁电转移至硝酸纤维素膜
上袁用 缘豫脱脂奶粉封闭袁以鼠抗 匀蚤泽标签单克隆抗体为
一抗袁匀砸孕标记的羊抗鼠 陨早郧为二抗进行显色遥
图 员摇 抗对硫磷四价抗体基因序列及推导的氨基酸序列
云蚤早援 员摇 晕怎糟造藻燥贼蚤凿藻 葬灶凿 葬皂蚤灶燥 葬糟蚤凿 泽藻择怎藻灶糟藻泽 燥枣 贼澡藻 贼藻贼则葬增葬造藻灶贼 葬灶贼蚤遭燥凿赠 葬早葬蚤灶泽贼 责葬则葬贼澡蚤燥灶
员郾 苑摇 四价抗体的 耘蕴陨杂粤反应活性检测咱员远暂
将对硫磷鄄韵灾粤连接物用包被液稀释至 员园滋早 辕 皂造袁
每孔 员园园滋造包被酶标板袁源益孵育过夜袁孕月杂栽洗板 猿 次
后用 缘豫的脱脂奶粉封闭 圆澡袁把待测蛋白倍比稀释袁稀
释度从 员颐 员园猿 耀 员颐 员园怨袁洗板后每孔加入 员园园滋造袁每个浓
度设置 猿 个重复袁阴性对照为空质粒菌株细胞粗提液袁
阳性对照为抗对硫磷母源单克隆抗体遥 猿苑益孵育 圆澡袁
将羊抗鼠 陨早郧鄄匀砸孕 酶标抗体 员 颐 缘园园 稀释袁每孔加入
员园园滋造袁猿苑益孵育 圆澡袁洗板后加显色液避光显色 员缘皂蚤灶袁
圆皂燥造 辕 蕴的硫酸作为终止液袁源缘园灶皂 波长下测定吸光
值遥
间接非竞争 耘蕴陨杂粤测定四价抗体的亲和常数袁将
所测结果分别与母源单克隆抗体渊酝葬遭冤和单链抗体
渊杂糟云增冤对比遥 参照 遭藻葬贼贼赠等建立的间接非竞争 耘蕴陨杂粤
方法咱怨暂 袁分别以 缘尧圆郾 缘尧员郾 圆缘 和 园郾 远圆缘皂早 辕 蕴 浓度的对
硫磷鄄韵灾粤 联接物包被酶标板袁抗体浓度分别为 员 伊
员园源尧圆郾 缘 伊 员园猿尧远圆缘尧员缘远郾 猿尧猿怨郾 员尧怨郾 愿尧圆郾 源缘灶早 辕 皂造遥 其余
操作步骤与上段一致袁测定 源缘园灶皂 波长下的吸光值遥
根据吸光值建立抗体与对硫磷结合曲线袁根据公式 运
越 渊灶 原 员冤 辕 圆 渊灶粤遭忆 原 粤遭冤计算抗对硫磷四价抗体的亲
和常数遥
圆摇 结果与分析
圆郾 员摇 抗对硫磷四价抗体基因克隆与鉴定
以 泽糟鄄泽葬缘云尧泽糟鄄泽葬猿砸 为引物袁质粒 责耘栽鄄泽糟鄄泽葬 为模
板袁孕悦砸扩增四价抗体基因袁琼脂糖凝胶电泳可见清
晰的扩增片段袁基因片段长度大约为 员员园园遭责袁将基因
克隆至 责耘粤杂再鄄月造怎灶贼 载体袁转化感受态细胞袁提取阳性
克隆测序袁测序结果显示基因长度为 员员圆圆遭责袁编码 猿苑源
个氨基酸渊图 员冤遥
园圆员
摇 员 期 抗对硫磷基因工程四价抗体在大肠杆菌中高效表达
圆郾 圆摇 抗对硫磷四价抗体表达载体的构建
将目的片段用 耘糟燥砸玉和 匀蚤灶凿 芋 双酶切袁回收片
段袁与同样双酶切 责栽韵鄄栽苑 原核表达载体进行连接袁得
到表达质粒 责栽韵鄄泽糟鄄泽葬渊图 圆冤袁经 孕悦砸和酶切鉴定正确
后将质粒转入 韵则蚤早葬皂蚤月渊阅耘猿冤大肠杆菌中袁该质粒可
表达遥
图 猿摇 抗对硫磷四价抗体 杂阅杂鄄孕粤郧耘检测结果
云蚤早援 猿摇 杂阅杂鄄孕粤郧耘 葬灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 燥枣 贼藻贼则葬增葬造藻灶贼 葬灶贼蚤遭燥凿赠 蚤灶 耘援 糟燥造蚤 韵则蚤早葬皂蚤月渊阅耘猿冤
粤院菌液上清中蛋白分布图曰月院菌液沉淀中蛋白分布曰 酝院蛋白 酝葬则噪藻则曰
员 耀 员园院转化 责栽韵鄄泽糟鄄泽葬的菌液沉淀曰员员 耀 员愿院转化 责栽韵鄄泽糟鄄泽葬的菌液上清
粤院 杂阅杂鄄孕粤郧耘 葬灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 责则燥贼藻蚤灶 蚤灶 造蚤择怎蚤凿 泽怎责藻则灶葬贼葬灶贼曰 月院 杂阅杂鄄孕粤郧耘 葬灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 责则燥贼藻蚤灶 蚤灶 泽藻凿蚤皂藻灶贼曰酝院酝葬则噪藻则曰
员 耀 员园院 泽藻凿蚤皂藻灶贼泽 燥枣 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 责则燥凿怎糟贼 枣则燥皂 责栽韵鄄泽糟鄄泽葬曰 员员 耀 员愿院 造蚤择怎蚤凿 燥枣 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 责则燥凿怎糟贼 枣则燥皂 责栽韵鄄泽糟鄄泽葬
图 圆摇 责栽韵鄄泽糟鄄泽葬重组质粒示意图
云蚤早援 圆摇 杂糟澡藻皂葬贼蚤糟 凿蚤葬早则葬皂 燥枣 责栽韵鄄泽糟鄄泽葬
圆郾 猿摇 四价抗体基因的表达和 杂阅杂鄄孕粤郧耘检测
经 杂阅杂鄄孕粤郧耘分析袁含有四价抗体基因 泽糟鄄泽葬 的大
肠菌株经 陨孕栽郧 诱导后袁在 源远噪阅葬 附近出现特异条带袁
与理论计算值相符遥 设计正交试验优化重组菌株表达
条件袁分别用 员尧园郾 缘缘 和 园郾 员皂皂燥造 辕 蕴的 陨孕栽郧于 猿苑益尧
猿园益和 员缘益诱导 猿尧远尧怨澡遥 发现在 园郾 员皂皂燥造 辕 蕴 陨孕栽郧 垣
猿园益 垣 怨 澡 条件下袁四价抗体表达量最高遥 图像分析
结果表明袁融合蛋白占菌体总蛋白含量近 缘园豫 袁上清
中可溶性蛋白也有明显条带渊图 猿冤袁与乔亚奇咱苑暂等制
备的四价抗体相比袁可溶性蛋白含量有显著提高遥
圆郾 源摇 四价抗体的亲和纯化及宰藻泽贼藻则灶 月造燥贼检测
用 晕蚤亲和层析纯化得四价抗体袁杂阅杂鄄孕粤郧耘 检测
其纯度较高袁经 月粤晕阅杂悦粤晕 分析袁目的蛋白的纯度达
怨园豫以上渊图 源鄄粤冤遥 宰藻泽贼藻则灶 遭造燥贼 检测显示袁鼠抗 匀蚤泽
单克隆抗体与 源远噪阅左右目的条带有很强的抗原结合
特性袁与其他蛋白没有明显结合渊图 源鄄月冤袁另有几条杂
带出现袁可能是因为在纯化过程中抗体片段造成断裂
或在大肠杆菌表达过程中部分出现提前终止遥
圆郾 缘摇 四价抗体的 耘蕴陨杂粤反应活性检测
耘蕴陨杂粤检测结果显示纯化产物与对硫磷反应呈阳
性袁抗体效价大于 员 颐 员 伊 员园远袁抗原包被浓度为 缘尧圆郾 缘尧
员郾 圆缘 和 园郾 远圆缘皂早 辕 蕴 时袁其吸光度值在 园郾 员缘 耀 园郾 圆缘 之
间袁做这 源 个浓度的抗原抗体结合曲线渊图 缘 冤袁取各
曲线最大吸光度值一半时抗体浓度袁代入计算公式袁分
析计算得到的亲和常数值袁取平均值即是抗对硫磷四
价工程抗体的亲和常数遥
参照抗原抗体结合曲线袁对应每条曲线 韵阅缘园豫处
的浓度值分别为 怨苑郾 怨尧远苑员郾 怨尧缘远猿缘郾 苑尧缘怨缘苑郾 圆灶早 辕 皂造袁结合
计算公式 运 越 渊灶 原 员冤 辕 圆 渊灶粤遭忆 原 粤遭冤袁可求出 远 个亲和
常数袁取平均值袁最终计算抗体亲和常数值为 远郾 愿源 伊员园愿
蕴 辕 皂燥造袁与母源单克隆抗体亲和常数无显著差异遥
员圆员
允燥怎则灶葬造 燥枣 晕怎糟造藻葬则 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 杂糟蚤藻灶糟藻泽
圆园员圆袁圆远渊员冤院园员员愿 耀 园员圆圆
图 源摇 抗对硫磷四价抗体纯化产物 杂阅杂鄄孕粤郧耘检测
渊粤冤和 宰藻泽贼藻则灶 月造燥贼 渊月冤结果
云蚤早援 源摇 孕怎则蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶渊粤冤葬灶凿 宰藻泽贼藻则灶 月造燥贼渊月冤葬灶葬造赠泽蚤泽
燥枣 贼澡藻 责则燥凿怎糟贼 燥枣 贼藻贼则葬增葬造藻灶贼 葬灶贼蚤遭燥凿赠
酝院蛋白 酝葬则噪藻则曰员院转化 责栽韵鄄泽糟鄄泽葬的菌液上清曰
圆院菌液上清过柱流出液曰猿院亲和层析洗脱液曰
源尧缘院纯化产物 宰藻泽贼藻则灶 月造燥贼 渊月冤检测
酝院 责则燥贼藻蚤灶 酝葬则噪藻则曰 员院 泽怎责藻则灶葬贼葬灶贼 枣造怎蚤凿 燥枣 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 责则燥凿怎糟贼曰
圆院 藻枣枣造怎藻灶贼 造蚤择怎蚤凿 燥枣 泽怎责藻则灶葬贼藻曰 猿院 云蚤灶葬造 责怎则蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶曰
源 葬灶凿 缘院 宰藻泽贼藻则灶 月造燥贼 葬灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 贼藻贼则葬增葬造藻灶贼 葬灶贼蚤遭燥凿赠
图 缘摇 融合抗体与对硫磷结合的反应曲线
云蚤早援 缘摇 月蚤燥葬糟贼蚤增蚤贼赠 燥枣 则藻糟燥皂遭蚤灶葬灶贼 葬早葬蚤灶泽贼 责葬则葬贼澡蚤燥灶
猿摇 讨论
核心链霉素基因和抗对硫磷单链抗体基因拼接得
到四价抗体基因袁该基因含有稀有密码子袁影响蛋白质
的合成速率袁甚至造成蛋白质合成中途停止咱员园暂 遥 四价
抗体基因编码的蛋白质内含有 圆 个结构域袁且内部含
有二硫键袁由于大肠杆菌胞质内是还原性的环境袁二硫
键在其内部不稳定袁所以得到的目的蛋白生物活性较
低遥 试验中选用 责栽韵鄄栽苑 表达载体袁该载体调控序列
部分含有 栽酝灾 赘序列袁显著提高抗体表达含量袁特别
是可溶性蛋白的表达量遥 栽酝灾 赘 序列的调控作用机
制尚不完全清楚袁仅从不同侧面部分解释 赘 序列调控
过程袁其中张红霞提出由于 栽酝灾 赘序列长度减缓了蛋
白质合成速度袁外源蛋白得以充分折叠咱员员暂 袁罗文新认
为是通过提高转录效率袁间接提高翻译水平咱员圆暂 遥
核心链霉亲和素的稳定性受温度影响袁高于 远园益
解聚为单个结构域袁故 杂阅杂鄄孕粤郧耘 和 宰藻泽贼藻则灶 检测观
察到抗体分子单体遥 在四价抗体纯化过程中袁细菌破
碎方法的选择袁亲和层析选用的洗脱液以及抗体保存
过程都会影响到四价抗体稳定性袁一般选用较温和的
细胞破碎方法袁纯化过程尽量在低温下操作袁洗脱液
责匀值尽量远离蛋白质等电点袁与传统单克隆抗体相
比袁四价抗体每个分子具有 源 个结合位点袁可与 源 个抗
原表位结合袁具有更高的效价袁功能性亲和力也得到增
强袁适合建立灵敏度更好及检测限更低的分析方法遥
本研究中成功构建抗对硫磷四价抗体高效表达载
体 责栽鄄泽糟鄄泽葬袁并在 韵则蚤早葬皂蚤月渊阅耘猿冤大肠杆菌中得到表
达袁其中外源蛋白含量占菌体粗蛋白总量的近 缘园豫 袁
由于表达硫氧还原蛋白酶渊 贼澡蚤则燥藻凿燥曾蚤灶 则藻凿怎糟贼葬泽藻冤和谷
胱甘肽还原酶袁细胞环境有利于二硫键的形成袁可溶性
蛋白含量也有明显提高袁经 晕蚤亲和层析纯化得到的四
价抗体有高亲和力袁亲和常数高于单链抗体袁与母源单
克隆抗体差异不明显袁为四价抗体在免疫检测分析中
的实际应用打下基础遥
源摇 结论
利用含有 赘 序列的 责栽韵鄄栽苑 载体袁在大肠杆菌
韵则蚤早葬皂蚤月渊阅耘猿冤内实现可溶性表达袁纯化产物的亲和
常数与天然单克隆抗体无差异袁抗体亲和力与灵敏度
均较好遥
致谢院本试验所用表达载体由厦门大学罗文新副
教授无偿馈赠袁衷心感谢罗教授给予的帮助和指导遥
参考文献院
咱 员 暂摇 井明艳袁 孙建义援 蛋白质的折叠调控与包涵体的形成咱允暂 援浙江
大学学报袁 圆园园源袁 猿园渊远冤院 远怨园 原 远怨远
咱 圆 暂摇 卢晟晔袁 王丽颖援 大肠杆菌中外源蛋白高效表达的影响因素及
策略研究的新进展咱允暂 援中国实验诊断学袁 圆园园远袁 员园渊怨冤院 员员园园 原
员员园猿
咱 猿 暂摇 宰藻造泽燥灶 宰藻灶鄄杂澡葬灶早袁 阅蚤责葬灶噪葬则 阅葬泽袁 杂贼藻责澡藻灶 粤 酝糟匝怎葬则则蚤藻袁 酝葬增葬灶怎则
砸 杂怎则藻泽澡援 阅藻泽蚤早灶 燥枣 葬 遭蚤枣怎灶糟贼蚤燥灶葬造 枣怎泽蚤燥灶 责则燥贼藻蚤灶 枣燥则 燥增葬则蚤葬灶 糟葬灶糟藻则
凿则怎早 凿藻造蚤增藻则赠院 杂蚤灶早造藻鄄糟澡葬蚤灶 葬灶贼蚤鄄悦粤员圆缘 糟燥则藻鄄泽贼则藻责贼葬增蚤凿蚤灶 枣怎泽蚤燥灶
责则燥贼藻蚤灶 咱 允 暂 援 耘怎则燥责藻葬灶 允燥怎则灶葬造 燥枣 孕澡葬则皂葬糟藻怎贼蚤糟泽 葬灶凿
月蚤燥责澡葬则皂葬糟藻怎贼蚤糟泽袁 圆园园苑袁 员园院 猿怨愿 原 源园缘
咱 源 暂摇 再怎噪葬灶早 蕴蚤灶袁 允燥澡灶 酝 孕葬早藻造袁 阅燥灶葬造凿 粤曾憎燥则贼澡赠袁 粤灶葬泽贼葬泽蚤葬 孕葬灶贼藻造蚤葬泽袁
晕葬贼澡葬灶 匀藻凿蚤灶袁 韵造蚤增藻则 宰 孕则藻泽泽援 粤 早藻灶藻贼蚤糟葬造造赠 藻灶早蚤灶藻藻则藻凿 葬灶贼蚤鄄悦阅源缘
泽蚤灶早造藻鄄糟澡葬蚤灶 葬灶贼蚤遭燥凿赠鄄泽贼则藻责贼葬增蚤凿蚤灶 枣怎泽蚤燥灶 责则燥贼藻蚤灶 枣燥则 责则藻贼葬则早藻贼藻凿
则葬凿蚤燥蚤皂皂怎灶燥贼澡藻则葬责赠 燥枣 澡藻皂葬贼燥造燥早蚤糟 皂葬造蚤早灶葬灶糟蚤藻泽 咱 允 暂 援 悦葬灶糟藻则
砸藻泽藻葬则糟澡袁 圆园园远袁 远远渊苑冤院 猿愿愿源 原 猿愿怨圆
渊下转第 员苑缘 页冤
圆圆员
允燥怎则灶葬造 燥枣 晕怎糟造藻葬则 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 杂糟蚤藻灶糟藻泽
圆园员圆袁圆远渊员冤院园员苑园 耀 园员苑缘
而影响植物的生长发育遥 根系是直接与土壤接触吸收
水分和养分的重要器官袁研究根系蛋白质组的变化是
最为有效和直接的方法遥 由于盐胁迫和 粤酝真菌不仅
对根部袁甚至对植物叶片都会造成一定影响袁对植物的
光合作用和呼吸作用与对照相比也会产生一定的变
化袁同时不可避免地产生蛋白含量变化或新的蛋白质
等活性物质袁因此是本试验也是抗盐机制的综合体现袁
这些蛋白在植物抗逆过程中的作用有待于进一步研究
确证袁同时也可以进一步分离相关基因并对其进行功
能鉴定遥
参考文献院
咱 员 暂摇 汤日圣袁黄益洪袁唐现洪袁钟 雨袁余永柱袁童红玉援 生物源脱落酸
对盐胁迫下辣椒苗生长和某些生理指标的影响咱 允暂 援 江苏农业
学报袁圆园园怨袁圆缘渊源冤院愿缘远 原 愿远园
咱 圆 暂摇 李寒暝袁白灯莎窑买买提艾力袁张少民袁阿依夏木窑沙吾尔袁蒋平
安援 新疆棉花品种的耐盐性综合评价咱 允暂 援 核农学报袁圆园员园袁圆源
渊员冤院员远园 原 员远缘
咱 猿 暂摇 刘冰江袁 李 敏袁 刘润进援 粤酝 真菌对棉花根内防御性酶活性的影
响咱允暂 援 西北农林科技大学学报袁圆园园缘袁 猿猿渊增刊冤院苑猿 原 苑愿
咱 源 暂 摇 酝糟皂蚤造造藻灶 月 郧袁允怎灶蚤责藻则 杂袁 粤遭遭燥贼贼 蕴 运援 灶澡蚤遭蚤贼蚤燥灶 燥枣 澡赠责澡晕 早则燥憎贼澡 燥枣
葬 增藻泽蚤糟怎造葬则鄄葬则遭怎泽糟怎造葬则 枣怎灶早蚤造 枣怎灶早怎泽 蚤灶 泽燥蚤造糟燥灶贼葬蚤灶蚤灶早 泽燥凿蚤怎皂 糟澡造燥则蚤凿藻
造蚤皂蚤贼藻泽 贼澡藻 泽责则藻葬凿 燥枣 蚤灶枣藻糟贼蚤燥灶 枣则燥皂 泽责燥则藻泽咱 允暂 援 杂燥蚤造 月蚤燥造 月蚤燥藻澡藻皂袁
员怨愿愿袁陨 猿园院员远猿怨 原 员远源远
咱 缘 暂 摇 悦澡葬皂遭藻则泽 悦 粤袁 杂皂蚤贼澡 杂 耘袁 杂皂蚤贼澡 云 粤援 耘枣枣藻糟贼泽 燥枣 葬皂皂燥灶蚤怎皂 葬灶凿
灶蚤贼则葬贼藻 蚤燥灶泽 燥灶 皂赠藻燥则则澡蚤扎葬造 蚤灶枣藻糟贼蚤燥灶袁 灶燥凿怎造葬贼蚤燥灶 葬灶凿 早则燥憎贼澡 燥枣
栽则蚤枣燥造蚤怎皂 泽怎遭贼藻则则葬灶藻怎皂咱允暂 援 晕藻憎 孕澡赠贼燥造袁 员怨愿园袁愿缘院源苑 原 远圆
咱 远 暂 摇 孕枣藻蚤枣枣藻则 悦 酝袁 月造燥泽泽 匀 耘援 郧则燥憎贼澡 葬灶凿 灶怎贼则蚤贼蚤燥灶 燥枣 早怎葬赠怎造藻渊孕葬则贼澡藻灶蚤怎
皂葬则早藻灶贼葬贼怎皂冤 蚤灶 葬 泽葬造蚤灶藻 泽燥蚤造 葬泽 蚤灶枣造怎藻灶糟藻凿遭赠 增藻泽蚤藻怎造葬则鄄葬则遭怎泽藻怎造葬则
皂赠藻燥则则澡蚤扎葬 葬灶凿 责澡燥泽责澡燥则怎泽 枣藻则贼蚤造蚤扎葬贼蚤燥灶咱允暂 援 晕藻憎 孕澡赠贼燥造袁 员怨愿愿袁员园愿院
员缘 原 猿圆员
咱 苑 暂摇 郭广芳袁 董 坤袁 高利艳袁 王顺利袁 王 轲袁 晏月明援 小麦根蛋白
提取与双向电泳方法的优化与应用咱 允暂 援 植物遗传资源学报袁
圆园员园袁 员员渊圆冤院圆源源 原 圆源愿
咱 愿 暂摇 陈蕊红袁张改生袁刘 卫袁叶景秀袁牛 娜援小麦花药蛋白质组双向电
泳技术体系的优化咱允暂 援核农学报袁圆园园愿袁圆圆渊源冤院源园源 原 源园怨
咱 怨 暂 摇 悦葬泽责葬则 栽袁 匀怎遭藻则 杂 悦袁 杂燥皂藻则增蚤造造藻 悦援 粤造贼藻则葬贼蚤燥灶泽 蚤灶 早则燥憎贼澡袁
责澡燥贼燥泽赠灶贼澡藻泽蚤泽袁葬灶凿 则藻泽责蚤则葬贼蚤燥灶 蚤灶 葬 泽贼葬则糟澡 造藻泽泽 皂怎贼葬灶贼 燥枣 粤则葬遭蚤凿燥责泽蚤泽
贼澡葬造蚤葬灶葬 渊 蕴援 冤 凿藻枣蚤糟蚤藻灶贼 蚤灶 糟澡造燥则燥责造葬泽贼 责澡燥泽责澡燥早造怎糟燥皂怎贼葬泽藻 葬糟贼蚤增蚤贼增
咱允暂 援 孕造葬灶贼 孕澡赠泽蚤燥造袁员怨愿缘袁 苑怨院员员 原 员苑
咱员园暂摇 杂葬造藻噪凿藻澡 郧 匀袁 杂蚤燥责燥灶早糟燥 允袁 宰葬凿藻 蕴 允袁 郧澡葬则藻赠葬扎蚤藻 月援 月藻灶灶藻贼贼 允援
孕则燥贼藻燥皂蚤糟 葬灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 则蚤糟藻 造藻葬增藻泽 凿怎则蚤灶早 凿则燥怎早澡贼 泽贼则藻泽泽 葬灶凿 则藻糟燥增藻则赠
咱允暂 援 孕则燥贼藻燥皂蚤糟泽袁圆园园圆袁圆院员员猿员 原 员员源缘
咱员员暂摇 月葬遭蚤赠糟澡怎噪 耘袁 运怎泽澡灶蚤则 杂袁 月藻造造藻泽鄄月燥蚤曾 耘袁 灾葬灶 酝燥灶贼葬早怎 酝袁 陨灶扎远 阅
粤则葬遭蚤凿燥责泽蚤泽 贼澡葬造蚤葬灶葬 晕粤阅孕匀 燥曾蚤凿燥则藻凿怎糟贼葬泽藻 澡燥皂燥造燥早泽
糟燥灶枣藻则贼燥造藻则葬灶糟藻 燥枣 赠藻葬泽贼泽 贼燥憎葬则凿 贼澡藻 贼澡蚤燥造鄄燥曾蚤凿蚤扎蚤灶早 凿则怎早 凿蚤葬皂蚤凿藻咱允暂 援
允 月蚤燥造 悦澡藻皂袁 员怨怨缘袁 圆苑园院 圆远圆圆源 原 圆远圆猿员
咱员圆暂摇 再怎葬灶 允袁 悦造蚤灶藻 运援 孕造葬泽贼燥糟赠葬灶 蚤灶 葬灶凿 贼澡藻 猿猿 噪阅 泽怎遭怎灶蚤贼 燥枣 贼澡藻 燥曾赠早藻灶鄄
藻增燥造增蚤灶早 糟燥皂责造藻曾 葬则藻 贼则葬灶泽责燥泽藻凿 蚤灶贼燥 贼澡赠造葬噪燥蚤凿泽 憎蚤贼澡 泽蚤皂蚤造葬则
则藻择怎蚤则藻皂藻灶贼泽 葬泽 责则藻凿蚤糟贼藻凿 枣则燥皂 责葬贼澡憎葬赠 泽责藻糟蚤枣蚤糟蚤贼赠 咱 允暂 援 允 摇 月蚤燥造
悦澡藻皂袁员怨怨源袁圆远怨渊圆愿 冤院员愿源远猿 原 员愿源远苑
咱员猿暂摇 再葬皂葬皂燥贼燥 再袁 陨泽澡蚤噪葬憎葬 再袁 晕葬噪葬贼葬灶蚤 耘袁 再葬皂葬凿葬 酝袁 在澡葬灶早 匀袁
宰赠凿则扎灶泽噪蚤 栽援 砸燥造藻 燥枣 葬灶 藻曾贼则蚤灶泽蚤糟 猿猿 噪蚤造燥凿葬造贼燥灶 责则燥贼藻蚤灶 燥枣
责澡燥贼燥泽赠泽贼藻皂 陨陨 蚤灶 贼澡藻 贼怎则灶燥增藻则 燥枣 贼澡藻 则藻葬糟贼蚤燥灶 糟藻灶贼藻则遭蚤灶凿蚤灶早 责则燥贼藻蚤灶
阅员 凿怎则蚤灶早 责澡燥贼燥蚤灶澡蚤遭蚤贼蚤燥灶咱允暂 援 月蚤燥糟澡藻皂贼则赠袁 员怨怨愿袁猿苑 渊 远冤院员缘远缘 原
员缘苑源
咱员源暂摇 孕葬灶 砸鄄悦援 孕造葬灶贼 孕澡赠泽蚤燥造燥早赠 咱 酝暂援 月藻蚤躁蚤灶早院匀蚤早澡藻则 耘凿怎糟葬贼蚤燥灶 孕则藻泽泽袁
圆园园猿院圆怨圆 原 圆怨猿
蕱蕱蕱蕱蕱蕱蕱蕱蕱蕱蕱蕱蕱蕱蕱蕱蕱蕱蕱蕱蕱蕱蕱蕱蕱蕱蕱蕱蕱蕱蕱蕱蕱蕱蕱蕱蕱蕱蕱蕱蕱蕱蕱蕱蕱蕱蕱蕱
渊上接第 员圆圆 页冤
咱 缘 暂 摇 允燥凿赠 杂糟澡怎造贼扎袁 再怎噪葬灶早 蕴蚤灶袁 允葬皂藻泽 杂葬灶凿藻则泽燥灶袁 再怎贼蚤灶早 在怎燥袁 阅蚤葬灶藻
杂贼燥灶藻袁 砸燥遭藻则贼 酝葬造造藻贼贼袁 杂蚤遭赠造造藻 宰蚤造遭藻则贼袁 阅燥灶葬造凿 粤曾憎燥则贼澡赠援 粤
贼藻贼则葬增葬造藻灶贼 泽蚤灶早造藻鄄糟澡葬蚤灶 葬灶贼蚤遭燥凿赠鄄泽贼则藻责贼葬曾蚤凿蚤灶 枣怎泽蚤燥灶 责则燥贼藻蚤灶 枣燥则
责则藻贼葬则早藻贼藻凿 造赠皂责澡燥皂葬 贼澡藻则葬责赠 咱 允暂 援 悦葬灶糟藻则 砸藻泽藻葬则糟澡袁 圆园园园袁 远园院
远远远猿 原 远远远怨
咱 远 暂 摇 酝蚤贼泽怎澡葬则葬 蕴袁 哉早葬噪蚤 酝袁 匀蚤则燥糟澡蚤噪葬 匀袁 韵澡泽澡蚤皂葬 酝袁 酝怎则葬噪葬皂蚤 栽袁
郧燥贼燥澡 再袁 藻贼 葬造援 耘枣枣蚤糟蚤藻灶贼 孕则燥皂燥贼藻则 悦葬泽泽藻贼贼藻泽 枣燥则 耘灶澡葬灶糟藻凿 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶
燥枣 枣燥则藻蚤早灶 早藻灶藻泽 蚤灶 凿蚤糟燥贼赠造藻凿燥灶燥怎泽葬灶凿 皂燥灶燥糟燥贼赠造藻凿燥灶燥怎泽 责造葬灶贼泽咱 允暂 援
孕造葬灶贼 悦藻造造 孕澡赠泽蚤燥造袁 圆园园源袁猿苑院源怨 原 缘怨
咱 苑 暂 摇 乔亚奇袁 潘家荣袁 王摇 磊袁 于海英袁 陈摇 明袁 张摇 维袁 张付凯援
抗对硫磷基因工程新型抗体的制备及鉴定咱 允暂 援 微生物学报袁
圆园员园袁 缘园渊缘冤院 远苑园 原 远苑缘
咱 愿 暂 摇 宋丽敏援 小分子半抗原多价抗体的制备及其活性研究咱阅暂援 中
国农业科学院袁 圆园园怨
咱 怨 暂摇 月藻葬贼贼赠 允 阅袁 月藻葬贼贼赠 月 郧袁 灾澡葬澡燥泽 宰 郧援 酝藻葬泽怎则藻皂藻灶贼 燥枣皂燥灶燥糟造燥灶葬造
葬灶贼蚤 鄄 遭燥凿赠 葬枣枣蚤灶蚤贼赠 遭赠 灶燥灶 鄄 糟燥皂责藻贼蚤贼蚤增藻 藻灶扎赠皂藻 蚤皂皂怎灶燥葬泽泽葬赠咱 允暂 援
允燥怎则灶葬造 燥枣 造皂皂怎灶燥造燥早蚤糟葬造 酝藻贼澡燥凿泽袁 员怨愿苑袁 员园园渊员 原 圆冤院 员苑猿 原 员苑怨
咱员园暂摇 悦造葬藻泽 郧怎泽贼葬枣泽泽燥灶袁 杂则蚤凿澡葬则 郧燥增蚤灶凿葬则葬躁葬灶袁 允藻则藻皂赠 酝蚤灶泽澡怎造造援 悦燥凿燥灶
遭蚤葬泽 葬灶凿 澡藻贼藻则燥造燥早燥怎泽 责则燥贼藻蚤灶 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 咱 允 暂 援 栽则藻灶凿泽 蚤灶
月蚤燥贼藻糟澡灶燥造燥早赠袁 圆园园源袁 圆圆渊苑冤院猿源远 原 猿缘猿
咱员员暂摇 张红霞袁 戴学智袁 张大鹏袁 程摇 坚袁 方雷袁 华子春援 烟草花叶病
毒 缘爷 原前导序列显著改善在大肠杆菌中表达的重组蛋白质的
可溶性咱粤暂援 圆园园源 年全国生物技术学术研讨会论文集 咱 悦暂袁
圆园园源
咱员圆暂摇 罗文新袁 张摇 军袁 杨海杰袁 李少伟袁 谢小燕袁 逄淑强袁 李少菁袁
夏宁邵援 一种带增强子的原核高效表达载体的构建及初步应用
咱允暂 援 生物工程学报袁 圆园园园袁 员远渊缘冤院缘苑愿 原 缘愿员
渊责任编辑摇 裴摇 颖冤
缘苑员