全 文 ：摇 核 农 学 报摇 圆园员猿袁圆苑渊愿冤院员园愿员 耀 员园愿怨允燥怎则灶葬造 燥枣 晕怎糟造藻葬则 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 杂糟蚤藻灶糟藻泽
收稿日期院圆园员圆鄄园愿鄄员猿摇 接受日期院 圆园员猿鄄园缘鄄园猿
基金项目院国家野愿远猿冶计划渊圆园员员粤粤员园粤员园远冤袁国家自然科学基金渊猿员园苑员源苑苑袁猿员员苑员远员员冤袁高等学校博士学科点专项科研基金渊圆园园怨园圆园源员员园园圆源冤袁
陕西省野员猿员员缘冶科技创新工程重大科技专项渊圆园员园在阅运郧 原远愿冤
作者简介院杨书玲袁女袁从事作物遗传育种研究遥 耘鄄皂葬蚤造院造蚤灶早圆园园苑员园岳 员圆远援 糟燥皂
通讯作者院张改生袁男袁教授袁从事小麦雄性不育理论和应用研究遥 耘鄄皂葬蚤造院扎澡葬灶早早泽澡岳 责怎遭造蚤糟援 曾葬援 泽灶援 糟灶
文章编号院员园园园鄄愿缘缘员渊圆园员猿冤园愿鄄员园愿员鄄园怨
小麦 栽葬孕阅运基因的序列分析尧原核表达及纯化
杨书玲员摇 张龙雨员 摇 张改生员 摇 桑摇 青员 摇 刘红占员摇 朱启迪员摇 张新钵员摇 赵新亮员袁圆
渊员 西北农林科技大学袁国家杨凌农业生物技术育种中心 辕国家小麦改良中心杨凌分中心 辕小麦育种教育部
工程研究中心 辕陕西省作物杂种优势研究与利用重点实验室袁陕西 杨凌摇 苑员圆员园园曰圆 河南科技学院袁河南 新乡摇 源缘猿园园猿冤
摘摇 要院为研究 栽葬孕阅运蛋白在小麦生理型雄性不育过程能量代谢途径中的调控机制遥 本试验提取小麦
花药总 砸晕粤并反转录为 糟阅晕粤袁根据 郧藻灶月葬灶噪报道的已知小麦 孕阅运基因序列设计引物袁扩增 栽葬孕阅运基
因的编码区袁采用生物信息学方法对其进行序列分析与功能预测袁得出 栽葬孕阅运 的 韵砸云 为 员园怨缘遭责袁编码
猿远源 个氨基酸袁蛋白分子量为 源员噪阅遥 进一步构建原核表达载体 孕耘栽圆猿凿鄄孕阅运袁转化到大肠杆菌表达菌种
耘援 糟燥造蚤 月蕴圆员渊阅耘猿冤中进行优化表达袁融合蛋白经 杂阅杂鄄孕粤郧耘电泳和 宰藻泽贼藻则灶 遭造燥贼验证后利用亲和层析柱
初步纯化袁针对原核表达过程中出现的非特异蛋白袁采用切胶处理的方法进行二次纯化遥 原核表达结果
表明 陨孕栽郧可诱导一个分子量约 源园噪阅 的特异蛋白袁且主要以包涵体的形式存在袁优化表达条件为院
圆愿益尧园郾 愿皂皂燥造窑蕴 原员 陨孕栽郧尧员缘园则窑皂蚤灶 原员诱导表达 源澡袁表达产物经两次纯化得到 圆皂早的目的蛋白袁为下一步
制备多克隆抗体尧寻找互作蛋白奠定基础遥
关键词院小麦曰栽葬孕阅运基因曰原核表达曰蛋白纯化曰宰藻泽贼藻则灶 遭造燥贼
摇 摇 对小麦雄性不育的研究与利用袁近年焦点主要集
中于遗传型雄性不育和生理型雄性不育两方面袁其中
小麦化学杂交剂诱导的生理型雄性不育袁在生产上具
有配制组合自由尧省时尧省力等优点袁是小麦杂种优势
利用的主要途径之一咱员 原 源暂 遥 对生理型雄性不育机理袁
前人亦进行了研究袁如从基因和蛋白差异表达咱缘 原 苑暂 尧泛
素蛋白酶体途径咱愿暂等袁对化学杂交剂 杂匝 原 员 诱导的小
麦生理型雄性不育机理研究发现袁大量能量代谢途径
相关基因和蛋白的异常表达与雄性不育直接相关遥 能
量代谢对生物体发育具有重要作用袁能量代谢失常将
直接影响到生物体的发育过程遥 悦葬责蚤贼葬灶蚤 等咱怨暂研究发
现植物雄性不育系花药发育过程有氧呼吸途径中相关
酶的活性普遍降低袁认为植物雄性不育花粉败育过程
与能量代谢异常密切相关遥 因此袁本研究推测杀雄剂
杂匝 原员 诱导的小麦雄性不育可能亦与能量代谢的失衡
有一定关系遥
丙酮酸脱氢酶系渊孕赠则怎增葬贼藻 凿藻澡赠凿则燥早藻灶葬泽藻 糟燥皂责造藻曾袁
孕阅悦冤催化丙酮酸氧化脱羧不可逆的形成乙酰 悦燥粤 而
进入 栽悦粤循环袁在细胞线粒体呼吸链能量代谢中起关
键作用袁丙酮酸脱氢酶激酶 渊 孕赠则怎增葬贼藻 凿藻澡赠凿则燥早藻灶葬泽藻
噪蚤灶葬泽藻袁 孕阅运冤是 孕阅悦 的主要调节酶袁它催化 孕阅悦 的
耘员葬亚基磷酸化袁磷酸化的 孕阅悦 不能催化丙酮酸氧化
脱羧反应袁从而导致糖酵解形成的丙酮酸不能进入三
羧酸循环咱员园 原 员猿暂 遥 所以袁孕阅运 在高等生物的能量代谢
调节中起着重要的作用袁对 栽葬孕阅运 蛋白的深入研究将
对揭示小麦生理型雄性不育系中能量代谢调控机制具
有重要促进意义遥
目前对植物中 孕阅运 的研究发现袁拟南芥有 员 种
孕阅运基因袁玉米和水稻各有 圆 种 孕阅运 基因袁并且它们
的同源性较高袁拟南芥尧玉米和人的 孕阅运员 的核酸序列
同源性分别为 苑缘豫 尧愿圆豫和 源圆豫 咱员源暂 遥 水稻 孕阅运员 基因
全长为 员源怨愿 遭责袁编码 猿远猿 个氨基酸袁并对其进行了蛋
白质的原核表达及多克隆抗体的制备咱员缘暂 曰利用反义技
术抑制水稻 孕阅运基因的表达袁后代性状表现为抽穗期
提前尧花粉育性和结实率下降以及生育期缩短咱员远暂 遥 抑
制拟南芥 孕阅运基因的表达袁引起 孕阅悦 活性增强袁花期
员愿园员
核摇 农摇 学摇 报 圆苑 卷
提前袁种子重量及含油量增加咱员苑暂 遥 在燥怎 等咱员愿暂认为袁拟
南芥 孕阅悦 活性的增强并不是 孕阅悦 蛋白表达量的增
加袁而是由于其活性调节酶 孕阅运蛋白的表达水平发生
变化遥
本试验前期工作中袁已经从小麦不育系中克隆了
孕阅运基因并对其表达特征进行了分析袁发现 孕阅运基因
在 杂匝 原员 诱导的小麦生理型雄性不育系和对应核基
因型的遗传型雄性不育中的表达趋势完全不同袁在遗
传型不育系中 孕阅运基因表达上调袁而在生理型雄性不
育系中 孕阅运基因表达下调袁可见在这两种不育类型中
孕阅运基因的调控途径是不一致的咱员怨暂 遥 为进一步研究
栽葬孕阅运基因在 杂匝 原 员 诱导的小麦雄性不育系中的上
下游调节机制袁本研究利用小麦新型化学杂交剂 杂匝 原
员 构建了普通小麦西农 员猿苑远 生理型雄性不育系和其
对应核基因的可育系袁获得目的基因袁在生物信息学分
析该基因及编码蛋白质的基本特征的基础上袁构建原
核表达载体尧诱导表达目的蛋白并对其进行纯化袁旨在
探索 栽葬孕阅运在原核表达系统中的最佳表达条件及去
除非特异蛋白的方法袁获得较纯的目的蛋白袁为进一步
制备 栽葬孕阅运蛋白的抗体尧获得其互作蛋白奠定基础遥
员摇 材料与方法
员郾 员摇 试验材料
供试小麦 渊 栽则蚤贼蚤糟怎皂 葬藻泽贼蚤增怎皂 蕴援 冤 品种为西农
员猿苑远袁圆园员园 年 员园 月种植于西北农林科技大学农场小
麦育种试验田遥 圆园员员 年当供试小麦生长到 云藻藻噪藻爷
泽愿郾 园 耀 愿郾 缘 时期渊即雌雄蕊原基形成到药隔期冤 咱圆园暂 袁将
其分为两组袁一组喷施适量杀雄剂 杂匝 原员袁另一组喷施
等量清水作对照遥 由于喷施 杂匝 原 员 使小麦花药发育
受到抑制袁不能形成正常可育花粉粒袁因此以正常植株
花粉粒不同发育时期的外部形态为标准袁取处理和对
照植株的单核期花药进行总 砸晕粤提取遥
员郾 圆摇 小麦花药总 砸晕粤提取及 糟阅晕粤合成
利用 栽砸晕扎燥造鄄粤 垣试剂渊北京天根生化科技有限公
司冤袁按操作说明提取样品总 砸晕粤袁经核酸蛋白检测仪
检测 砸晕粤提取质量遥 使用 孕则蚤皂 杂糟则蚤责贼 砸栽 砸藻葬早藻灶贼 运蚤贼
渊栽葬运葬砸葬袁大连冤合成第一链 糟阅晕粤袁按试剂盒操作手册
进行反转录操作遥
员郾 猿摇 栽葬孕阅运基因的克隆
以 杂匝 原员 诱导的西农 员猿苑远 生理型雄性不育株单
核期花药的 糟阅晕粤 为模板袁根据 郧藻灶月葬灶噪 报道的小麦
孕阅运 基因 渊 月栽园园怨猿缘缘 冤 序列设计引物 责员 颐 缘忆 原
悦郧郧郧粤栽悦悦粤栽郧粤栽郧郧粤郧栽栽悦郧郧郧栽悦悦栽悦 原 猿忆袁责圆 颐 缘忆 原
郧悦郧栽悦郧粤悦粤郧郧悦粤粤栽郧郧悦栽悦悦栽悦悦郧粤郧栽 原 猿忆袁上下游
分别引入 月葬皂匀陨 和 杂葬蕴陨 渊 栽葬运葬砸葬袁大连冤酶切位点遥
以西农 员猿苑远 可育株单核期花药 糟阅晕粤为模板袁采用高
保真酶 孕则蚤皂藻杂栽粤砸 匀杂 责燥造赠皂藻则葬泽藻渊栽葬运葬砸葬袁大连冤进行
孕悦砸 扩增遥 孕悦砸 反应条件为 怨源益 猿皂蚤灶曰怨源益 员皂蚤灶尧
远园益 员皂蚤灶尧苑圆益 员皂蚤灶袁猿园 个循环曰苑圆益延伸 员园皂蚤灶遥 采
用 孕月杂鄄栽陨陨平末端 阅晕粤片段加 粤试剂盒渊北京天根生
化科技有限公司冤进行克隆转化操作袁选取阳性单克
隆菌落袁提取质粒测序渊华大基因冤遥
员郾 源摇 序列分析与功能预测
分别采用 耘曾孕粤杂赠的 糟燥皂责怎贼藻 孕陨 辕 酝宰 推测蛋白分
子量和等电点尧孕砸韵杂陨栽耘 进行蛋白质功能分析曰应用
运蚤灶葬泽藻 孕澡燥泽 预测蛋白质磷酸化位点曰使用 悦造怎泽贼葬造宰
圆郾 园 软件进行多种氨基酸序列比对曰采用 阅晕粤酝粤晕
远郾 园 软件构建 栽葬孕阅运 与其他动植物相关蛋白的同源
树曰蛋白质在细胞内的定位由在线软件 栽葬则早藻贼孕员郾 员 分
析遥
员郾 缘摇 原核表达载体的构建
重组质粒 责酝阅 原 员怨栽鄄孕阅运 与表达质粒 责耘栽 原 圆猿凿
渊 垣 冤分别用内切酶 月葬皂匀陨 和 杂葬蕴陨 进行双酶切袁酶切
产物用 栽源 连接酶渊栽葬运葬砸葬袁大连冤进行连接袁连接产物
热击转化 耘援 糟燥造蚤 阅匀 缘琢感受态细胞渊北京全式金生物
技术有限公司冤袁蓝白斑筛选单菌落袁孕悦砸 验证的阳性
克隆接种于含氨苄青霉素抗性的 蕴月 液体培养基中培
养 员圆 澡袁抽提质粒进行双酶切验证遥
员郾 远摇 目的蛋白的诱导表达及表达条件的优化
设计多种组合对目的蛋白进行优化表达袁包括不
同诱导时间尧陨孕栽郧 浓度尧温度及摇床转速对目的蛋白
表达量的影响遥
员郾 远郾 员摇 不同诱导时间对融合蛋白表达量的影响
经鉴定构建成功的重组质粒和空质粒分别转化
耘援 糟燥造蚤 月蕴圆员渊阅耘猿冤遥 取重组菌株和空菌株袁在 圆愿益下
培养至 韵阅远园园灶皂 越园郾 缘 耀 园郾 愿袁加入异丙基 原 茁 原 阅 原硫
代吡喃半乳糖苷渊陨孕栽郧冤至终浓度为 园郾 愿 皂皂燥造窑蕴 原员袁同
时设未诱导对照袁诱导表达时间分别为 员尧圆尧猿尧源尧缘 澡袁
各时间段分别取 员皂蕴 菌液 员圆园园园则窑皂蚤灶 原员离心 员皂蚤灶 收
集菌体袁加入 员 辕 员园 倍菌液体积的 栽蚤泽鄄匀糟造 渊园郾 园员皂燥造窑
蕴 原员袁责匀愿郾 园冤袁离心收集上清袁包涵体沉淀用等体积的
愿皂燥造窑蕴 原员尿素裂解袁处理后的上清和沉淀分别进行
杂阅杂鄄孕粤郧耘分析遥
员郾 远郾 圆摇 不同 陨孕栽郧浓度对融合蛋白表达量的影响摇 设
置 陨孕栽郧诱导浓度分别为 园郾 缘尧员郾 园尧员郾 缘尧圆郾 园皂皂燥造窑蕴 原员袁
分别加入含有重组质粒的 蕴月 培养基中袁其余操作步
骤如 员郾 远郾 员遥
圆愿园员
摇 愿 期 小麦 栽葬孕阅运基因的序列分析尧原核表达及纯化
员郾 苑摇 目的蛋白的纯化
将诱导表达后的菌体裂解尧检测后袁经 粤运栽粤
责怎则蚤枣蚤藻则蛋白层析系统渊安玛西亚公司 德国冤进行纯
化遥 将收集的洗脱峰蛋白用 员圆豫 杂阅杂鄄孕粤郧耘 进行分离
检测袁凝胶经考马斯亮蓝 砸圆缘园 染色后袁回收目的条
带袁加入蛋白提取液袁置于 源益冰箱 猿凿 后袁员圆园园园 则窑
皂蚤灶 原员离心 员园皂蚤灶袁上清即为纯化的目的蛋白遥
员郾 愿摇 宰藻泽贼藻则灶 月造燥贼贼蚤灶早分析
诱导后的菌液经 杂阅杂鄄孕粤郧耘 电泳鉴定后袁电转移
至 孕灾阅云膜上袁用含 缘豫脱脂奶粉的封闭液室温封闭 猿
澡袁加入鼠抗 匀蚤泽单克隆抗体作为一抗袁室温孵育 员 澡袁
栽月杂栽缓冲液洗涤 猿 次袁每次 圆皂蚤灶袁用辣根过氧化物酶
渊匀砸孕冤标记的羊抗鼠 陨早郧 作为二抗袁室温反应 员 澡袁
栽月杂栽洗涤 缘 次后用化学发光法充分显色袁拍片保存遥
圆摇 结果与分析
圆郾 员摇 栽葬孕阅运基因的获得及序列分析
花药组织的发育关系到雄性生殖细胞的发育袁进
而影响育性袁选取小麦花药为试验材料分析相关基因袁
更具说服力遥 以单核期花药的 糟阅晕粤 为模板袁进行
孕悦砸扩增袁产物经 员郾 缘豫琼脂糖凝胶电泳分析袁可见约
员园园园 遭责的目的片段袁大小与预期相符渊图 员冤遥
注院 酝院 阅蕴圆园园园曰员 和 圆院栽葬孕阅运基因遥
晕燥贼藻院 酝院 阅蕴圆园园园曰 员 葬灶凿 圆院 栽葬孕阅运 早藻灶藻援
图 员摇 栽葬孕阅运基因的 孕悦砸扩增结果
云蚤早援 员摇 孕悦砸 葬皂责造蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 枣燥则 栽葬孕阅运 早藻灶藻
测序结果的分析表明袁插入的目的基因片段长度
为 员园怨缘 遭责渊图 圆冤袁与已注册的 月栽园园怨猿缘缘 序列相似性
为 怨愿郾 员苑豫 遥 栽葬孕阅运基因在对照和 杂匝 原员 处理后材料
中的序列是一致的袁没有发现该基因点突变袁插入和缺
失的情况袁因此可以排除 杂匝 原 员 对该基因序列的影
响袁并且本试验克隆产物构建的重组载体 责酝阅 原 员怨栽鄄
孕阅运可用于融合表达载体的构建遥
生物信息学分析 栽葬孕阅运基因袁推导该编码序列编
码 猿远源 个氨基酸残基袁预测蛋白分子量为 源员 噪阅尧责陨 为
远郾 员员曰对目的蛋白进行亚细胞定位预测其位于线粒体
内曰分析其保守区序列发现院第 远 耀 员苑缘 个氨基酸残基
属于一个线粒体支链 琢 原酮酸脱氢酶激酶结构域袁属
于 晕 端结构域曰第 圆圆怨 耀 猿缘苑 个氨基酸包含一个
匀粤栽孕葬泽藻鄄糟结构域袁包含一个 粤栽孕结合位点尧一个 酝早圆
垣结合位点和一个 郧鄄载鄄郧 模体遥 对 栽葬孕阅运 氨基酸序
列的多重比较和磷酸化位点分析结果表明院目的蛋白
有 猿 个磷酸化位点袁在 员怨员尧圆源缘 处各有一个丝氨酸位
点袁在 圆缘猿 处有一个酪氨酸位点袁其催化作用的激酶分
别为 悦阅悦圆尧孕运郧尧陨晕杂砸渊图 猿冤遥 同源树显示袁本研究推
导出的 栽葬孕阅运氨基酸序列与登录号为 月栽园园怨猿缘缘 的小
麦尧水稻尧玉米尧大豆和拟南芥等高等植物的 孕阅运 序列
同源性分别为 怨怨豫 尧怨圆豫 尧愿怨郾 缘豫 尧苑缘豫 尧苑猿郾 愿豫 曰与哺
乳动物小鼠和人的同源性分别为 猿愿郾 愿豫 尧猿愿郾 缘豫 渊图
源冤遥 进而推测 栽葬孕阅运序列与水稻尧玉米等禾本科作物
相比袁同源性较高袁属于同一家族曰与大豆尧拟南芥等其
它科植物归属不同的亚类曰与小鼠尧人哺乳动物比较袁
相似性较低袁亲缘关系较远袁分属不同的家族遥
圆郾 圆摇 表达载体的构建
重组质粒 责耘栽圆猿凿鄄孕阅运经 孕悦砸 和双酶切鉴定袁结
果检测到 员园园园 遭责左右的目的基因片段与 缘园园园 遭责 左
右的表达载体 责耘栽 原 圆猿凿渊 垣 冤片段渊图 缘冤遥 表明重组
质粒 责耘栽圆猿凿鄄孕阅运已成功转入感受态细胞袁可进行后
续原核表达试验遥
圆郾 猿摇 重组蛋白的诱导表达及表达条件的优化
设计了多种组合对目的蛋白进行优化表达袁经
员圆豫 杂阅杂鄄 孕粤郧耘分析发现重组蛋白在 员 澡开始大量表
达袁且 源 澡达到最高袁之后表达量稍微下降渊图 远 原 粤冤曰
陨孕栽郧的浓度为 园郾 缘 皂皂燥造窑蕴 原员和 员郾 园 皂皂燥造窑蕴 原员时融合
蛋白表达量无明显差异袁之后随诱导浓度的增加融合
蛋白表达量逐渐降低渊图 远 原 月冤袁推测 陨孕栽郧 浓度过高
可能对大肠杆菌细胞有毒害作用曰摇床转速因诱导温
度及时间的不同而影响目的蛋白的表达遥 综合以上最
佳诱导条件袁最终选择优化表达条件为院园郾 愿 皂皂燥造窑蕴 原员
陨孕栽郧尧圆愿益袁员缘园 则窑皂蚤灶 原员袁诱导 源 澡遥 同时还发现目标
蛋白带只在沉淀中表达袁上清中则无渊图 远 原 粤冤袁说明
融合蛋白主要以包涵体形式存在遥 重组载体样品在约
源园 噪阅 处可见特异的蛋白表达条带袁与预计的融合蛋
白大小一致袁而其未诱导表达的样品和空载体样品则
无渊图 远 原 粤冤遥
圆郾 源摇 目的蛋白的纯化
猿愿园员
核摇 农摇 学摇 报 圆苑 卷
图 圆摇 栽葬孕阅运基因 韵砸云序列及其氨基酸序列分析
云蚤早援 圆摇 粤灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 灶怎糟造藻燥贼蚤凿藻 葬灶凿 蚤贼泽 葬皂蚤灶燥 葬糟蚤凿 泽藻择怎藻灶糟藻泽 燥枣 栽葬孕阅运
采用优化的表达条件进行大量诱导表达融合蛋
白遥 溶解后的包涵体袁经镍亲和层析柱纯化袁收集到的
洗脱峰经检测表明袁此峰中含有约 源园 噪阅目标蛋白带袁
但是该条带后面在约 猿园 噪阅 处有两条非特异条带渊图
源愿园员
摇 愿 期 小麦 栽葬孕阅运基因的序列分析尧原核表达及纯化
注院杂 原丝氨酸位点袁再 原酪氨酸位点袁糟凿糟圆 原细胞分裂周期蛋白激酶袁孕运郧 原蛋白激酶 郧袁陨晕杂砸 原胰岛素受体激酶
晕燥贼藻院杂 原 杂藻则蚤灶藻 泽蚤贼藻泽袁 再 原 栽赠则燥泽蚤灶藻 泽蚤贼藻袁 糟凿糟圆 原 糟藻造造 凿蚤增蚤泽蚤燥灶 糟赠糟造藻 责则燥贼藻蚤灶 噪蚤灶葬泽藻袁 孕运郧 原 糟郧酝孕 原 凿藻责藻灶凿藻灶糟藻 责则燥贼藻蚤灶 噪蚤灶葬泽藻袁 陨晕杂砸 原 蚤灶泽怎造蚤灶
图 猿摇 小麦 栽葬孕阅运推导的氨基酸序列与磷酸化位点分析
云蚤早援 猿摇 粤灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 凿藻凿怎糟藻凿 葬皂蚤灶燥 葬糟蚤凿 泽藻择怎藻灶糟藻泽 葬灶凿 责澡燥泽责澡燥则赠造葬贼蚤燥灶 泽蚤贼藻 燥枣 栽葬孕阅运
图 源摇 高等植物和动物中 孕阅运蛋白的同源进化树分析
云蚤早援 源摇 孕澡赠造燥早藻灶藻贼蚤糟 贼则藻藻 燥枣 孕阅运 责则燥贼藻蚤灶 枣则燥皂
责造葬灶贼泽 葬灶凿 葬灶蚤皂葬造泽
注院 酝院 阅晕粤分子量标准 栽则葬灶泽 圆噪曰 员和 圆院 阳性重组质粒双酶切片段遥
晕燥贼藻院酝院 栽则葬灶泽圆噪 阅晕粤 皂葬则噪藻则曰 员 葬灶凿 圆院 砸藻糟燥皂遭蚤灶葬灶贼 责造葬泽皂蚤凿援
责耘栽圆猿凿 原 孕阅运 凿蚤早藻泽贼藻凿 憎蚤贼澡 月葬皂匀陨 葬灶凿 杂葬蕴陨
图 缘摇 阳性重组质粒 责耘栽圆猿凿 原 孕阅运的双酶切鉴定
云蚤早援 缘摇 砸藻泽贼则蚤糟贼蚤增藻 藻灶扎赠皂藻 凿蚤早藻泽贼蚤燥灶 燥枣
则藻糟燥皂遭蚤灶葬灶贼 责造葬泽皂蚤凿 责耘栽圆猿凿 原 孕阅运
苑 原 粤冤遥 为了得到较纯的 源园 噪阅 重组蛋白袁将收集到
的洗脱峰进行 杂阅杂鄄孕粤郧耘电泳分离袁进一步割胶富集袁
经过冷冻干燥处理袁得到 圆 皂早的纯化蛋白遥
圆郾 缘摇 宰藻泽贼藻则灶 月造燥贼贼蚤灶早分析
进一步利用 匀蚤泽 标签单克隆抗体进 宰藻泽贼藻则灶
月造燥贼贼蚤灶早分析遥 结果显示袁作为对照的空载体 责耘栽 原
圆猿凿渊 垣 冤表达产物尧未诱导重组质粒转化的菌体蛋白
均没有检测到免疫信号曰未经 晕蚤鄄晕栽粤 柱纯化的重组
蛋白和经过 晕陨鄄晕栽粤 柱纯化的重组蛋白能够被鼠抗
匀蚤泽单克隆抗体特异性识别袁但有两条非特异带渊图未
显示冤曰进一步割胶富集的蛋白能检测到特异的免疫
信号渊图 苑 原 月冤袁表明 栽葬孕阅运 基因已经在 耘援 糟燥造蚤 月蕴圆员
渊阅耘猿冤中成功表达遥
猿摇 讨论
植物雄性不育的研究是杂种优势利用理论研究的
重要内容袁能量代谢失衡与植物雄性不育大量研究证
明存在一定关系咱怨暂 袁而线粒体是为机体提供能量的动
力工厂遥 细胞存亡与物质能量代谢调节契合于丙酮
酸袁糖类经过初步酵解后形成丙酮酸袁丙酮酸被运输到
线粒体内经过氧化脱羧形成乙酰辅酶 粤 进入三羧酸
循环渊栽悦粤冤袁最后经过氧化磷酸化形成大量的 粤栽孕遥
线粒体丙酮酸脱氢酶复合体渊皂贼孕阅悦冤调控丙酮酸进入
栽悦粤循环并且催化的反应不可逆袁两种调节酶 孕阅运 辕
孕阅孕通过对 孕阅悦鄄耘员葬 亚基的磷酸化和去磷酸化使
孕阅悦 失活或复活袁更上游信号又调控 孕阅运 辕 孕阅孕咱圆员 原 圆圆暂 遥
孕阅运作为 孕阅悦的负调控酶袁调控 栽悦粤 循环的速度袁对
能量代谢有极其重要的作用袁对 孕阅运上游调控机制研
缘愿园员
核摇 农摇 学摇 报 圆苑 卷
注院粤院 不同诱导时间对表达量的影响援 酝院 标准蛋白质分子量曰员院空载体诱导 缘 澡曰圆 原 苑院重组子诱导 园尧员尧圆尧猿尧源尧缘 澡的沉淀蛋白曰
愿院重组子诱导 源 澡的破菌上清曰
月院 不同 陨孕栽郧浓度对表达量的影响援 葬 原 凿院陨孕栽郧浓度分别为 园援 缘尧员援 园尧员援 缘尧圆援 园 皂皂燥造窑蕴 原员 遥 箭头所示目的蛋白带
晕燥贼藻院 粤院 栽澡藻 蚤灶枣造怎藻灶糟藻 燥枣 凿蚤枣枣藻则藻灶贼 蚤灶凿怎糟藻皂藻灶贼 贼蚤皂藻 燥灶 贼澡藻 葬皂燥怎灶贼 燥枣 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶援 酝院 孕则燥贼藻蚤灶 皂燥造藻糟怎造葬则 憎藻蚤早澡贼 泽贼葬灶凿葬则凿曰 员院 责耘栽 原 圆猿凿渊 垣 冤
贼则葬灶泽枣燥则皂藻凿 遭葬糟贼藻则蚤葬造 糟藻造造泽 蚤灶凿怎糟藻凿则藻泽责藻糟贼蚤增藻造赠 枣燥则 缘 澡 遭赠 园援 愿 皂皂燥造窑蕴 原员 陨孕栽郧曰 圆 原 苑院 栽澡藻 凿藻责则燥贼藻蚤灶 燥枣 贼澡藻 则藻糟燥皂遭蚤灶葬灶贼 责造葬泽皂蚤凿 责耘栽圆猿凿 原 孕阅运
贼则葬灶泽枣燥则皂藻凿 遭葬糟贼藻则蚤葬造 糟藻造造泽蚤灶凿怎糟藻凿 则藻泽责藻糟贼蚤增藻造赠 枣燥则 园袁 员袁 圆袁 猿袁 源袁 缘 澡 遭赠 园援 愿 皂皂燥造窑蕴 原员 陨孕栽郧曰 愿院栽澡藻 泽怎责藻则灶葬贼葬灶贼 责则燥贼藻蚤灶燥枣 贼澡藻 则藻糟燥皂遭蚤灶葬灶贼
摇 摇 摇 摇 责造葬泽皂蚤凿 责耘栽圆猿凿 原 孕阅运 贼则葬灶泽枣燥则皂藻凿 遭葬糟贼藻则蚤葬造 糟藻造造泽 蚤灶凿怎糟藻凿 则藻泽责藻糟贼蚤增藻造赠 枣燥则 源 澡 遭赠 园援 愿 皂皂燥造窑蕴 原员 陨孕栽郧援
月院 栽澡藻 蚤灶枣造怎藻灶糟藻 燥枣 凿蚤枣枣藻则藻灶贼 陨孕栽郧 糟燥灶糟藻灶贼则葬贼蚤燥灶 燥灶 贼澡藻 葬皂燥怎灶贼 燥枣 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶援 葬 原 凿院 糟燥灶糟藻灶贼则葬贼蚤燥灶 燥枣 陨孕栽郧 则藻泽责藻糟贼蚤增藻造赠 枣燥则 园援 缘袁 员援 园袁 员援 缘 葬灶凿
摇 摇 摇 摇 圆郾 园 皂皂燥造窑蕴 原员 援 栽澡藻 葬则则燥憎 则藻责则藻泽藻灶贼泽 贼澡藻 贼葬则早藻贼 责则燥贼藻蚤灶援
图 远摇 杂阅杂 原 孕粤郧耘分析表达产物
云蚤早援 远摇 杂阅杂 原 孕粤郧耘 葬灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 贼澡藻 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 燥枣 责耘栽圆猿凿 原 孕阅运 葬灶凿 责耘栽 原圆猿凿渊 垣 冤
注院粤院 杂阅杂 原 孕粤郧耘 分析重组蛋白初次纯化结果遥 酝院 预染
皂葬则噪藻则曰 员院 空载体诱导 源 澡曰圆院 重组载体诱导前曰 猿院 重组载体诱
摇 导 源 澡曰 源院 过 澡蚤泽柱纯化的目的蛋白曰 缘院 过柱后的杂蛋白
月院宰藻泽贼藻则灶 月造燥贼蚤灶早验证目的蛋白两步纯化结果援
葬袁遭院 切胶纯化的目的蛋白遥
晕燥贼藻院 粤院 杂阅杂 原 孕粤郧耘 葬灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 责怎则蚤枣蚤藻凿 则藻糟燥皂遭蚤灶葬灶贼责则燥贼藻蚤灶泽援 酝院
孕则燥贼藻蚤灶 皂燥造藻糟怎造葬则 皂葬则噪藻则曰 员院 责耘栽 原 圆猿凿渊 垣 冤 贼则葬灶泽枣燥则皂藻凿 遭葬糟贼藻则蚤葬造
糟藻造造泽 蚤灶凿怎糟藻凿 枣燥则 源 澡曰 圆院 砸藻糟燥皂遭蚤灶葬灶贼 责造葬泽皂蚤凿 责耘栽圆猿凿 原 孕阅运
贼则葬灶泽枣燥则皂藻凿 遭葬糟贼藻则蚤葬造 糟藻造造泽 蚤灶凿怎糟藻凿 枣燥则 园 澡曰 猿院 砸藻糟燥皂遭蚤灶葬灶贼 责造葬泽皂蚤凿
责耘栽圆猿凿 原 孕阅运 贼则葬灶泽枣燥则皂藻凿 遭葬糟贼藻则蚤葬造 糟藻造造泽 蚤灶凿怎糟藻凿 枣燥则 源 澡曰 源院 栽澡藻
责怎则蚤枣蚤藻凿 责则燥贼藻蚤灶 葬枣贼藻则 晕蚤圆 垣 原 葬枣枣蚤灶蚤贼赠糟澡则燥皂葬贼燥早则葬责澡赠曰 缘院 燥贼澡藻则
责则燥贼藻蚤灶泽 葬枣贼藻则 晕蚤圆 垣 原 葬枣枣蚤灶蚤贼赠 糟澡则燥皂葬贼燥早则葬责澡赠援 月院 宰藻泽贼藻则灶 遭造燥贼
葬灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 贼葬则早藻贼 责则燥贼藻蚤灶援 葬袁遭院 杂蚤早灶葬造泽 燥枣 贼葬则早藻贼 责则燥贼藻蚤灶 憎葬泽 枣燥怎灶凿
葬枣贼藻则 责怎则蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 遭赠 噪灶蚤枣蚤灶早 杂阅杂 原 孕粤郧耘 早藻造援
图 苑摇 重组蛋白的纯化及宰藻泽贼藻则灶 月造燥贼贼蚤灶早验证
云蚤早援 苑摇 孕怎则蚤枣蚤藻凿 枣怎泽蚤燥灶 责则燥贼藻蚤灶 憎葬泽 葬灶葬造赠扎藻凿 遭赠
杂阅杂鄄孕粤郧耘 葬灶凿 宰藻泽贼藻则灶 月造燥贼贼蚤灶早
究发现袁琢 雌激素相关受体渊耘砸砸琢冤的超量表达增加
图 愿摇 孕阅运圆 的 匀粤栽孕葬泽藻赃悦结构
云蚤早援 愿摇 栽澡藻 猿阅 泽贼则怎糟贼怎则藻 燥枣 匀粤栽孕葬泽藻赃悦 凿燥皂葬蚤灶 蚤灶 孕阅运圆
了 孕郧悦 原 员琢 激活 孕阅运源 基因袁耘砸砸琢 的沉默降低了
孕郧悦 原员琢 对 孕阅运源 的激活能力袁耘砸砸琢 的差异分布调
节 孕阅运源 基因而协调能量代谢咱圆猿暂 遥
本试验获得了 栽葬孕阅运 的完整开放阅读框袁编码
猿远源 个氨基酸残基袁分子量 源员 噪阅遥 利用生物信息学对
其进行序列分析与功能预测袁研究发现小麦尧水稻尧玉
米的 孕阅运序列同源性较高袁并且植物尧哺乳动物尧线
虫尧果蝇等生物的 孕阅运都含有 缘 个与细菌 匀粤栽孕葬泽藻赃糟
相似的高度保守的结构域咱员源暂 遥 匀粤栽孕葬泽藻赃糟 结构域包
含 员猿 个 琢 螺旋和 愿 个 茁 折叠渊图 愿冤袁具有结合 粤栽孕
的功能及催化功能袁其催化机理与组氨酸激酶的催化
机理相似袁有多处组氨酸残基参与磷酸基团的转移袁可
远愿园员
摇 愿 期 小麦 栽葬孕阅运基因的序列分析尧原核表达及纯化
以使组氨酸残基自身磷酸化袁产生一个高能磷酸基团
随之传递给接受者袁其催化底物的磷酸接受基团是丝
氨酸残基袁既具有转移酶和激酶的功能咱圆源 原 圆远暂 遥
对植物中 孕阅运圆 的结构研究发现袁晕 端区域不保
守袁起调节作用袁主要由 琢螺旋组成曰悦端区域保守袁具
有催化功能袁催化中心由 缘 个反向平行的 茁 折叠和 猿
个 琢螺旋组成的 琢 原 茁 夹层构成袁两端通过 琢 螺旋连
接起来咱圆苑 原 圆怨暂 遥 孕阅运圆 通常以二聚体形式存在袁二聚体
拥有两个大沟袁方向背对朝外袁在 孕阅悦 表面迅速翻移
以寻找 耘圆 的疏水结构域袁当结合上 耘圆 亚基上的疏水
结构域时袁有助于促使二聚体中心部位的暴露而与 耘员
相结合袁催化 耘员 磷酸化袁阻断丙酮酸到乙酰 悦燥粤 反应
的进行咱圆缘暂 袁进而抑制 栽悦粤 循环及氧化磷酸化途径而
影响能量代谢途径的正常进行遥 但是袁要想了解
栽葬孕阅运蛋白在 杂匝 原 员 诱导小麦雄性不育过程中能量
代谢途径中的具体生化功能袁必须从蛋白质水平上深
入研究遥 原核表达体系是研究蛋白质结构和功能的基
础袁本研究在获得目的基因完整编码区的基础上袁首次
构建了 栽葬孕阅运原核表达体系对目的蛋白进行成功表
达遥
影响大肠杆菌表达融合蛋白的主要因素包括院大
肠杆菌菌株尧诱导温度尧诱导剂 陨孕栽郧 的浓度尧诱导时
间咱猿园暂 遥 试验表明 栽葬孕阅运基因在大肠杆菌内主要以包
涵体的形式表达袁许多外源蛋白主要以无活性尧不溶性
的包涵体形式产生咱猿员暂 遥 包涵体的形成原因很多袁外源
基因的快速高效表达是其中的原因之一咱猿圆暂 曰融合蛋白
随诱导温度和时间增加表达量逐渐增加袁达到一定量
后呈稳定状态袁随后蛋白量有降低趋势曰考虑到 陨孕栽郧
对大肠杆菌生长及表达的可能影响袁选 园郾 愿皂皂燥造窑蕴 原员
为理想浓度曰摇床转速因诱导温度及诱导时间的不同
而影响目的蛋白的表达遥 最终选择最佳表达条件为院
园郾 愿皂皂燥造窑蕴 原员 陨孕栽郧尧圆愿益尧员缘园则窑皂蚤灶 原员袁诱导 源澡遥
表达载体 责耘栽 原 圆猿凿渊 垣 冤带有组氨酸标签袁经过
原核表达得到的融合蛋白的 悦 端带有 远 个 匀蚤泽 标签袁
由于 匀蚤泽标签分子量较小袁几乎不影响融合蛋白的分
子量袁所以原核表达的重组蛋白分子量与预测的
栽葬孕阅运蛋白分子量相符遥 用 晕蚤鄄晕栽粤 亲和层析柱对融
合蛋白进行纯化袁结果发现除了目的蛋白渊源园噪阅冤以
外袁还有两条稳定的非特异性条带渊约 猿园 噪阅冤渊图 苑 原
粤冤袁其原因可能在于真核生物的结构蛋白要进行原核
表达袁其基因中存在较多稀有密码子袁这些稀有密码子
大量或连续性的出现可能会引起表达量的降低袁甚至
使蛋白合成中途停止导致出现了截短的蛋白遥
为了得到较单一的目的蛋白袁对表达产物进行纯
化袁目前分离纯化目的蛋白的方法有多种咱猿猿 原 猿源暂 袁但是
得到的目的蛋白量有限尧成本较高袁且蛋白纯化过程步
骤越多袁损失的蛋白越多遥 本试验通过探索袁找到一种
很好的提取目的蛋白的方法袁过程简单袁效率较高袁最
终得到 圆皂早单一目的蛋白遥 本研究对 栽葬孕阅运 蛋白进
行了初步探索袁建立了原核表达体系袁并进一步分离纯
化了 栽葬孕阅运 蛋白袁为下一步制备多克隆抗体尧研究其
功能奠定了基础袁为研究 栽葬孕阅运蛋白在 杂匝 原员 诱导的
小麦生理型不育过程中能量代谢方面的调控机制提供
了科学依据遥
源摇 结论
本研究在获得了 栽葬孕阅运 基因全长 糟阅晕粤 的基础
上袁初次将其亚克隆至原核表达载体 责耘栽 原 圆猿凿渊 垣 冤
中袁构建了重组表达载体 责耘栽圆猿凿鄄孕阅运袁并在大肠杆菌
表达菌株 月蕴圆员渊阅耘猿冤中得到成功的优化表达袁获得与
预期相符的 源园 噪阅 的重组蛋白袁经过两步纯化最终得
到高质量的 栽葬孕阅运 蛋白渊图 苑 原 月冤袁为下一步制备多
克隆抗体袁研究其功能奠定了基础袁也为研究 栽葬孕阅运
蛋白在 杂匝 原 员 诱导的小麦生理型不育过程中能量代
谢方面的调控机制提供依据遥
参考文献院
咱 员 暂摇 砸葬躁葬则葬皂 杂援 孕则燥泽责藻糟贼泽 葬灶凿 责则燥皂蚤泽藻 燥枣 憎澡藻葬贼 遭则藻藻凿蚤灶早 蚤灶 贼澡藻 圆员泽贼
糟藻灶贼怎则赠 咱允暂 援 耘怎责澡赠贼蚤糟葬袁 圆园园员袁 员员怨渊员冤院 猿 原 员缘
咱 圆 暂摇 赵昌平援 中国杂交小麦研究现状与趋势咱 允暂 援 中国农业科技导
报袁 圆园员园袁 员圆渊圆冤院 缘 原 愿
咱 猿 暂摇 张瑜袁 牛娜袁 张改生袁 王青袁 葛峰辉袁 曹栎袁 马守才援 黏类小麦
悦酝杂不育基因 则枣增员 的分子细胞遗传学跟踪鉴定及定向转育研究
咱允暂 援 核农学报袁 圆园员园袁 圆源渊远冤院 员员圆源 原 员员猿员
咱 源 暂摇 李文袁 王国槐袁 官春云援 化学杂交剂对不同品种油菜的杀雄效
果研究咱允暂 援 核农学报袁 圆园员猿袁 圆苑渊圆冤院 员猿怨 原 员源缘
咱 缘 暂摇 王俊生袁 袁蕾袁 位明明袁 张改生袁 张龙雨袁 袁正杰袁 孙瑞袁 叶景
秀袁 牛娜袁马守才袁李红霞援 小麦生理型雄性不育花药中能量相
关基因的表达咱允暂 援 核农学报袁 圆园园怨袁 圆猿渊远冤院 怨圆愿 原 怨猿源
咱 远 暂摇 陈蕊红袁 叶景秀袁 张改生袁 王俊生袁 牛娜袁 马守才袁 赵继新袁 朱
建楚援 小麦质核互作型雄性不育系及其保持系花药差异蛋白质
组学分析咱允暂 援 生物化学与生物物理进展袁 圆园园怨袁 猿远渊源冤院 源猿员 原
源源园
咱 苑 暂摇 叶景秀袁 陈蕊红袁 张改生袁 王俊生袁 王书平袁 李莉袁 牛娜袁 马守
才袁 李红霞袁 朱建楚援 杀雄剂 杂匝 原 员 诱导小麦雄性不育花药蛋
白质组分分析咱允暂 援 农业生物技术学报袁 圆园园怨袁 员苑渊缘冤院 员 原 苑
咱 愿 暂摇 王俊生袁 袁蕾袁 张明珠袁 张改生袁 牛娜袁 马守才袁 李红霞援 化学
杂交剂 杂匝 原 员 诱导小麦泛素 辕 圆远杂 蛋白酶体途径的表达咱 允暂 援 农
业生物技术学报袁 圆园员园袁 员愿渊源冤院 远怨缘 原 苑园员
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核摇 农摇 学摇 报 圆苑 卷
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允燥怎则灶葬造 燥枣 酝燥造藻糟怎造葬则 月蚤燥造燥早赠袁 员怨怨怨袁 圆怨源渊猿冤院 苑源缘 原 苑缘远
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咱允暂 援 孕造葬灶贼 孕澡赠泽蚤燥造燥早赠袁 员怨苑苑袁 缘怨渊缘冤院 愿缘源 原 愿缘愿
咱员员暂摇 酝藻灶凿藻扎 粤 栽袁 酝蚤藻则灶赠噪 允 粤袁 砸葬灶凿葬造造 阅 阅援 砸藻早怎造葬贼蚤燥灶 燥枣 责赠则怎增葬贼藻
凿藻澡赠凿则燥早藻灶葬泽藻 糟燥皂责造藻曾 葬糟贼蚤增蚤贼赠 蚤灶 责造葬灶贼 糟藻造造泽 咱允暂 援 耘怎则燥责藻葬灶 允燥怎则灶葬造
燥枣 月蚤燥糟澡藻皂蚤泽贼则赠袁 圆园园猿袁 圆苑园渊远冤院 员园源猿 原 员园源怨
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凿藻澡赠凿则燥早藻灶葬泽藻 糟燥皂责造藻曾 遭赠 责澡燥泽责澡燥则赠造葬贼蚤燥灶 咱 允暂 援 孕造葬灶贼 孕澡赠泽蚤燥造燥早赠袁
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咱员猿暂摇 运燥噪 粤 阅袁 匀藻灶早藻增藻造凿 粤 云袁 酝葬则贼蚤灶 粤袁 宰藻泽贼责澡葬造 粤 匀援 栽澡藻 责赠则怎增葬贼藻
凿藻澡赠凿则燥早藻灶葬泽藻 皂怎造贼蚤鄄藻灶扎赠皂藻 糟燥皂责造藻曾 枣则燥皂 郧则葬皂鄄灶藻早葬贼蚤增藻 遭葬糟贼藻则蚤葬
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责澡燥泽责澡燥则赠造葬贼藻泽 泽藻则蚤灶藻 则藻泽蚤凿怎藻泽 咱 允暂 援 月蚤燥糟澡藻皂蚤糟葬造 允燥怎则灶葬造袁 圆园园园袁
猿源怨院 员怨缘 原 圆园员
咱员缘暂摇 谭才邓袁 李静袁 周玲艳袁 李峰袁 庄楚雄援 水稻丙酮酸脱氢酶激酶
员 多克隆抗体的制备咱允暂 援 江苏农业科学袁 圆园员园袁 渊圆冤院 员源 原 员远
咱员远暂摇 允葬灶 粤袁 晕葬噪葬皂怎则葬 匀袁 匀葬灶凿葬 匀袁 陨糟澡蚤噪葬憎葬 匀袁 酝葬贼泽怎皂燥贼燥 匀袁
运燥皂葬贼泽怎 杂援 郧蚤遭遭藻则藻造造蚤灶 则藻早怎造葬贼藻泽 皂蚤贼燥糟澡燥灶凿则蚤葬造 责赠则怎增葬贼藻
凿藻澡赠凿则燥早藻灶葬泽藻 葬糟贼蚤增蚤贼赠 蚤灶 则蚤糟藻 咱 允暂 援 孕造葬灶贼 葬灶凿 悦藻造造 孕澡赠泽蚤燥造燥早赠袁
圆园园远袁 源苑渊圆冤院 圆源源 原 圆缘猿
咱员苑暂摇 酝葬则蚤造造蚤葬 耘 云袁 酝蚤糟葬造造藻枣 月 允袁 酝蚤糟葬造造藻枣 酝袁 宰藻灶蚤灶早藻则 粤袁 孕藻凿藻则泽藻灶 运
运袁 在燥怎 允 栽袁 栽葬赠造燥则 阅 悦援 月蚤燥糟澡藻皂蚤糟葬造 葬灶凿 责澡赠泽蚤燥造燥早蚤糟葬造 泽贼怎凿蚤藻泽 燥枣
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皂蚤贼燥糟澡燥灶凿则蚤葬造 责赠则怎增葬贼藻 凿藻澡赠凿则燥早藻灶葬泽藻 噪蚤灶葬泽藻 咱 允 暂 援 允燥怎则灶葬造 燥枣
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咱员愿暂摇 在燥怎 允袁 匝蚤 匝 郧袁 运葬贼葬增蚤糟 灾袁 酝葬则蚤造造蚤葬 耘 云袁 栽葬赠造燥则 阅 悦援 耘枣枣藻糟贼泽 燥枣
葬灶贼蚤泽藻灶泽藻 则藻责则藻泽泽蚤燥灶 燥枣 葬灶 粤则葬遭蚤凿燥责泽蚤泽 贼澡葬造蚤葬灶葬 责赠则怎增葬贼藻
凿藻澡赠凿则燥早藻灶葬泽藻 噪蚤灶葬泽藻 糟阅晕粤 燥灶 责造葬灶贼 凿藻增藻造燥责皂藻灶贼 咱 允 暂 援 孕造葬灶贼
酝燥造藻糟怎造葬则 月蚤燥造燥早赠袁 员怨怨怨袁 源员渊远冤院 愿猿苑 原 愿源怨
咱员怨暂摇 张龙雨袁 袁蕾袁 杨书玲袁 张改生袁 王俊生袁 宋瑜龙袁 赵卓军袁 牛
娜袁 马守才援 小麦雄性不育系中 栽葬孕阅悦鄄耘员琢及其调节酶基因的
表达特征咱允暂 援 作物学报袁 圆园员员袁 猿苑渊源冤院 远圆园 原 远圆愿
咱圆园暂摇 刘宏伟袁 张改生袁 王军卫袁 王小利袁 方振武援 化学杂交剂 杂匝 原 员
诱导小麦雄性不育及与不同小麦品种互作效应的研究咱 允暂 援 西
北农林科技大学学报院自然科学版袁 圆园园猿袁 猿员渊源冤院 员缘 原 员愿
咱圆员暂摇 漆正堂袁 丁树哲袁 贺 杰援 丙酮酸脱氢酶活性调控在线粒体代谢
与生长平衡中的作用咱 允暂 援 生命的化学袁 圆园园愿袁 圆愿渊猿冤院 猿园苑 原
猿园怨
咱圆圆暂摇 酝藻灶凿藻扎 粤 栽袁 酝蚤藻则灶赠噪 允 粤 葬灶凿 砸葬灶凿葬造造 阅 阅援 砸藻早怎造葬贼蚤燥灶 燥枣 责赠则怎增葬贼藻
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燥枣 月蚤燥糟澡藻皂蚤泽贼赠袁 圆园园猿袁 圆苑园渊远冤院 员园源猿 原 员园源怨
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糟燥灶凿蚤贼蚤燥灶泽 咱 允 暂 援 再葬噪怎早葬噪怎 在葬泽泽澡蚤鄄躁燥怎则灶葬造 燥枣 贼澡藻 责澡葬则皂葬糟藻怎贼蚤糟葬造
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责赠则怎增葬贼藻 凿藻澡赠凿则燥早藻灶葬泽藻 噪蚤灶葬泽藻 圆 糟燥灶贼葬蚤灶蚤灶早 责澡赠泽蚤燥造燥早蚤糟葬造 葬灶凿
泽赠灶贼澡藻贼蚤糟 造蚤早葬灶凿泽 咱允暂 援 月蚤燥糟澡藻皂蚤泽贼则赠袁 圆园园远袁 源缘渊圆冤院 源园圆 原 源员缘
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允燥怎则灶葬造 燥枣 月蚤燥造燥早蚤糟葬造 悦澡藻皂蚤泽贼则赠袁 圆园园员袁 圆苑远渊源园冤院 猿苑源源猿 原 猿苑源缘园
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粤则葬遭蚤凿燥责泽蚤泽 贼澡葬造蚤葬灶葬 责赠则怎增葬贼藻 凿藻澡赠凿则燥早藻灶葬泽藻 噪蚤灶葬泽藻 咱 允暂 援 耘怎则燥责藻葬灶
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咱猿园暂摇 倪志勇袁李波袁范玲援 棉花肉桂醇脱氢酶基因 郧澡悦粤阅猿 的克隆及
原核表达援 核农学报袁 圆园员园袁 圆源渊缘冤院 怨员园 原 怨员远
咱猿员暂摇 张付凯袁 乔亚奇袁 王磊袁 兰丽平袁 潘家荣援 抗对硫磷基因工程四
价抗体在大肠杆菌中高效表达与鉴定援 核农学报袁 圆园员圆袁 圆远
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咱猿圆暂摇 张军杰袁 周会袁 胡育峰袁 田孟良袁 刘汉梅袁 黄玉碧援 玉米基因
泽遭藻员 糟阅晕粤的克隆与原核表达援 核农学报袁 圆园园怨袁 圆猿渊员冤院 苑园 原
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咱猿猿暂摇 于在江袁马学恩袁 周建华援 切胶纯化表达蛋白包涵体的可行性分
析咱允暂 援 生物技术袁 圆园园苑袁 员苑渊猿冤院 源远 原 源愿
咱猿源暂摇 冯爱花袁 陈宗梅袁 李静袁 程备久袁 范军援 玉米叶绿体铁氧还蛋白
员 的原核表达及部分性质分析援 核农学报袁 圆园员员袁 圆缘渊员冤院 远圆 原
远远
愿愿园员
允燥怎则灶葬造 燥枣 晕怎糟造藻葬则 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 杂糟蚤藻灶糟藻泽
圆园员猿袁圆苑渊愿冤院员园愿员 耀 员园愿怨
杂藻择怎藻灶糟藻 粤灶葬造赠泽蚤泽袁 孕则燥噪葬则赠燥贼蚤糟 耘曾责则藻泽泽蚤燥灶 葬灶凿 孕怎则蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣
栽葬孕阅运 郧藻灶藻 蚤灶 宰澡藻葬贼 渊栽则蚤贼蚤糟怎皂 葬藻泽贼蚤增怎皂 蕴援 冤
再粤晕郧 杂澡怎鄄造蚤灶早员 摇 在匀粤晕郧 蕴燥灶早鄄赠怎员 摇 在匀粤晕郧 郧葬蚤鄄泽澡藻灶早员 摇 杂粤晕郧 匝蚤灶早员 摇 蕴陨哉 匀燥灶早鄄扎澡葬灶员
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