全 文 ：摇 核 农 学 报摇 圆园员圆袁圆远渊怨冤院员圆苑员 耀 员圆苑苑允燥怎则灶葬造 燥枣 晕怎糟造藻葬则 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 杂糟蚤藻灶糟藻泽
收稿日期院圆园员圆鄄园猿鄄园远摇 接受日期院圆园员圆鄄园远鄄园苑
基金项目院农业部公益性行业渊农业冤科研专项渊圆园员圆园猿园源园冤袁河南省扶持企业自主创新资金项目袁河南省农业科学院科技发展及示范推广专项
基金
作者简介院王摇 耀渊员怨愿远鄄冤袁男袁河南三门峡人袁博士研究生袁研究方向为食品安全检测遥 耘鄄皂葬蚤造院贼蚤早藻则愿远员圆员缘岳 员远猿援 糟燥皂
通讯作者院邓瑞广渊员怨远园鄄冤袁男袁河南平顶山人袁研究员袁硕士生导师袁主要从事动物疫病和食品安全快速检测技术研究遥 耘鄄皂葬蚤造院则早凿怨怨怨岳 员远猿援 糟燥皂
文章编号院员园园园鄄愿缘缘员渊圆园员圆冤园怨鄄员圆苑员鄄园苑
赭曲霉毒素 粤模拟表位的筛选及免疫学鉴定
王摇 耀员袁圆 摇 胡骁飞员 摇 裴亚峰员 摇 赵摇 东员 摇 刘运超员 摇 张改平员 摇 李志西圆 摇 邓瑞广员
渊员援 河南省农业科学院 辕农业部动物免疫学重点实验室袁河南省动物免疫学重点实验室袁河南 郑州摇 源缘园园园圆曰
圆援 西北农林科技大学食品科学与工程学院袁 陕西 杨凌摇 苑员圆员园园冤
摘摇 要院从噬菌体随机七肽库中筛选得到赭曲霉毒素 粤的模拟表位袁并以其替代毒素标品建立赭曲霉毒
素 粤免疫学快速检测方法遥 以纯化的抗赭曲霉毒素 粤单克隆抗体渊韵栽粤 皂粤遭冤为配基袁亲和筛选融合表
达在丝状 酝员猿 噬菌体次要衣壳蛋白渊孕芋冤上的随机七肽库袁以 耘蕴陨杂粤 方法鉴定阳性克隆袁并以筛选的
模拟表位建立赭曲霉毒素 粤的 耘蕴陨杂粤检测方法遥 经过 源 轮亲和筛选袁共得到 圆圆 株与 韵栽粤 皂粤遭 特异结
合的阳性噬菌体克隆袁且该结合都能够被 韵栽粤 标品阻断袁阅晕粤 测序及多肽核心序列分析后袁得到赭曲
霉毒素 粤的模拟表位的主要序列为院酝孕蕴宰载阅蕴袁载为任意氨基酸袁以阳性噬菌体克隆建立的竞争 耘蕴陨杂粤
检测方法袁线性范围为 圆缘园 耀 愿园园园责早 辕 皂造遥 基于制备的 韵栽粤 皂粤遭袁利用噬菌体随机七肽库可成功筛选到
赭曲霉毒素 粤的模拟表位袁并能够替代 韵栽粤标品建立直接竞争模式的免疫学快速检测方法遥
关键词院噬菌体随机七肽库曰赭曲霉毒素 粤曰模拟表位曰单克隆抗体
杂悦砸耘耘晕陨晕郧 粤晕阅 陨酝酝哉晕韵蕴韵郧陨悦粤蕴 悦匀粤砸粤悦栽耘砸陨在粤栽陨韵晕 韵云 栽匀耘
酝陨酝陨悦运陨晕郧 耘孕陨栽韵孕耘 韵云 韵悦匀砸粤栽韵载陨晕 粤
宰粤晕郧 再葬燥员袁圆 摇 匀哉 载蚤葬燥鄄枣藻蚤员 摇 孕耘陨 再葬鄄枣藻灶早员 摇 在匀粤韵 阅燥灶早员 摇 蕴陨哉 再怎灶鄄糟澡葬燥员 摇 在匀粤晕郧 郧葬蚤鄄责蚤灶早员
蕴陨 在澡蚤鄄曾蚤圆 摇 阅耘晕郧 砸怎蚤鄄早怎葬灶早员
渊员援 运藻赠 蕴葬遭燥则葬贼燥则赠 枣燥则 粤灶蚤皂葬造 陨皂皂怎灶燥造燥早赠 燥枣 贼澡藻 酝蚤灶蚤泽贼则赠 燥枣 粤早则蚤糟怎造贼怎则藻袁 匀藻灶葬灶 运藻赠 蕴葬遭燥则葬贼燥则赠 燥枣 粤灶蚤皂葬造 陨皂皂怎灶燥造燥早赠 辕 匀藻灶葬灶
粤糟葬凿藻皂赠 燥枣 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 杂糟蚤藻灶糟藻泽袁 在澡藻灶早扎澡燥怎袁 匀藻灶葬灶摇 源缘园园园圆曰
圆援 悦燥造造藻早藻 燥枣 云燥燥凿 杂糟蚤藻灶糟藻 葬灶凿 耘灶早蚤灶藻藻则蚤灶早袁 晕燥则贼澡憎藻泽贼 粤驭云 哉灶蚤增藻则泽蚤贼赠袁 再葬灶早造蚤灶早袁 杂澡葬葬灶曾蚤摇 苑员圆员园园冤
粤遭泽贼则葬糟贼院栽燥 泽糟则藻藻灶 贼澡藻 皂蚤皂蚤糟噪蚤灶早 藻责蚤贼燥责藻 燥枣 韵糟澡则葬贼燥曾蚤灶 粤 枣则燥皂 孕澡援 阅援 鄄苑栽酝 葬灶凿 藻泽贼葬遭造蚤泽澡 贼澡藻 蚤皂皂怎灶燥葬泽泽葬赠 枣燥则
凿藻贼藻糟贼蚤灶早 韵栽粤 憎蚤贼澡 蚤贼援 粤灶 葬灶贼蚤鄄韵糟澡则葬贼燥曾蚤灶 粤 皂燥灶燥糟造燥灶葬造 葬灶贼蚤遭燥凿赠 憎葬泽 怎泽藻凿 葬泽 造蚤早葬灶凿袁 遭蚤燥责葬灶灶蚤灶早 憎葬泽 凿燥灶藻 贼燥 泽糟则藻藻灶 贼澡藻
皂蚤皂蚤糟噪蚤灶早 藻责蚤贼燥责藻 枣则燥皂 葬 孕澡援 阅援 鄄苑栽酝袁 憎澡蚤糟澡 憎葬泽 凿蚤泽责造葬赠藻凿 葬泽 葬 枣怎泽蚤燥灶 责则燥贼藻蚤灶 憎蚤贼澡 贼澡藻 糟燥葬贼 责则燥贼藻蚤灶芋 燥枣 枣蚤造葬皂藻灶贼燥怎泽
责澡葬早藻 酝员猿袁 贼澡藻 责燥泽蚤贼蚤增藻 糟造燥灶藻泽 憎葬泽 蚤凿藻灶贼蚤枣蚤藻凿 遭赠 耘蕴陨杂粤袁 葬灶凿 藻泽贼葬遭造蚤泽澡藻凿 葬 蚤皂皂怎灶燥葬泽泽葬赠 枣燥则 凿藻贼藻糟贼蚤灶早 韵栽粤 憎蚤贼澡 贼澡藻
责燥泽蚤贼蚤增藻 责澡葬早藻泽援 粤枣贼藻则 枣燥怎则 则燥怎灶凿泽 燥枣 责葬灶灶蚤灶早袁 圆圆 责燥泽蚤贼蚤增藻 糟造燥灶藻泽 糟燥怎造凿 遭蚤灶凿 贼燥 贼澡藻 韵栽粤 皂粤遭 葬灶凿 贼澡藻 遭蚤灶凿蚤灶早 糟燥怎造凿 遭藻
遭造燥糟噪藻凿 遭赠 贼澡藻 枣则藻藻 燥糟澡则葬贼燥曾蚤灶 粤援 宰蚤贼澡 贼澡藻 阅晕粤 泽藻择怎藻灶糟蚤灶早 葬灶凿 责藻责贼蚤凿藻 糟燥则藻 泽藻择怎藻灶糟藻 葬灶葬造赠泽蚤泽袁 贼澡藻 葬皂蚤灶燥 泽藻择怎藻灶糟藻 燥枣
贼澡藻 皂蚤皂蚤糟噪蚤灶早 藻责蚤贼燥责藻 蚤泽 酝孕蕴宰载阅蕴渊载 蚤泽 葬灶赠 葬皂蚤灶燥 葬糟蚤凿 则藻泽蚤凿怎藻泽冤 援 粤 糟燥皂责藻贼蚤贼蚤增藻 耘蕴陨杂粤 蚤皂皂怎灶燥葬泽泽葬赠 憎葬泽 藻泽贼葬遭造蚤泽澡藻凿
憎蚤贼澡 贼澡藻 责燥泽蚤贼蚤增藻 糟造燥灶藻泽袁 贼澡藻 造蚤灶藻葬则 则葬灶早藻 燥枣 贼澡藻 蚤灶澡蚤遭蚤贼蚤燥灶 糟怎则增藻泽 蚤泽 遭藻贼憎藻藻灶 圆缘园责早 辕 皂造 葬灶凿 愿园园园责早 辕 皂造援 月葬泽藻凿 燥灶 贼澡藻
韵栽粤 皂粤遭袁 贼澡藻 责澡葬早藻 凿蚤泽责造葬赠 贼藻糟澡灶蚤择怎藻 糟葬灶 遭藻 泽怎糟糟藻泽泽枣怎造造赠 葬责责造蚤藻凿 贼燥 泽糟则藻藻灶 贼澡藻 皂蚤皂蚤糟噪蚤灶早 藻责蚤贼燥责藻 燥枣 韵糟澡则葬贼燥曾蚤灶 粤袁
贼澡藻 燥遭贼葬蚤灶 责澡葬早藻 糟葬灶 则藻责造葬糟藻凿 韵糟澡则葬贼燥曾蚤灶 粤 贼燥 藻泽贼葬遭造蚤泽澡 贼澡藻 蚤皂皂怎灶燥葬泽泽葬赠援
运藻赠 憎燥则凿泽院孕澡葬早藻 则葬灶凿燥皂 苑 责藻责贼蚤凿藻 造蚤遭则葬则赠曰 韵糟澡则葬贼燥曾蚤灶 粤曰 皂蚤皂蚤糟噪蚤灶早 藻责蚤贼燥责藻曰 皂燥灶燥糟造燥灶葬造 葬灶贼蚤遭燥凿赠
员苑圆员
核摇 农摇 学摇 报 圆远 卷
摇 摇 赭曲霉毒素渊韵糟澡则葬贼燥曾蚤灶冤是曲霉属和青霉属的某
些菌株产生的次级代谢产物袁它包含 苑 种结构类似的
化合物袁其中毒性最大尧分布最广尧产毒量最高尧对农作
物污染最重尧与人类健康关系最为密切的是赭曲霉毒
素 粤渊韵糟澡则葬贼燥曾蚤灶 粤袁韵栽粤冤 咱员暂 遥 其作用的靶器官主要是
肾脏和肝脏袁是一种强烈的肾尧肝毒素袁并具有较强的
致癌尧致畸和致突变作用咱圆暂 遥 由于 韵栽粤广泛存在于农
产品及畜产品袁且能经食物链进入人体袁对人类生命健
康造成危害袁因此实现对 韵栽粤 的快速尧准确检测意义
重大遥 目前袁对 韵栽粤 检测方法有化学分析法尧仪器分
析法和免疫学分析法等遥 其中免疫学分析法以敏感度
高袁检出限低的优势在 韵栽粤 定性尧定量检测中广泛应
用袁实现了 韵栽粤快速尧简便尧高灵敏检测袁对保障我国
农产品安全有着积极意义咱猿暂 遥 但是袁当前免疫学检测
方法是建立在以标记毒素或偶联毒素为竞争抗原基础
上的有毒检测体系袁存在毒素标品昂贵尧对生产及操作
人员的健康有害以及偶联反应重复性差等缺陷袁制约
了它的应用和推广咱源暂 遥 近年来袁利用噬菌体随机肽库
技术得到的模拟表位肽替代毒素作为竞争抗原袁建立
的无毒检测体系袁推动了 韵栽粤 免疫学检测的快速发
展咱缘暂 遥 噬菌体随机肽库技术是以大量随机编码的多
肽序列插入噬菌体展示载体袁形成噬菌体展示文库遥
每个噬菌体粒子或者噬菌体只展示一种序列的外源肽
链袁不同的噬菌体粒子或者噬菌体展示不同序列的外
源肽链咱远暂 遥 本研究的目的是以抗 韵栽粤 的单克隆抗体
为配基袁从噬菌体随机七肽库中亲和筛选 韵栽粤的模拟
表位袁并利用 韵栽粤 的抗原模拟表位替代人工合成抗
原袁建立无需 韵栽粤标品的 耘蕴陨杂粤快速检测方法遥
员摇 材料和方法
员郾 员摇 试验材料
噬菌体随机七肽库渊 孕澡援 阅援 鄄苑栽酝 孕澡葬早藻 阅蚤泽责造葬赠
孕藻责贼蚤凿藻 蕴蚤遭则葬则赠 运蚤贼冤购自 晕藻憎 耘灶早造葬灶凿 月蚤燥造葬遭泽 公司曰抗
韵栽粤单克隆抗体由河南省动物免疫学重点实验室制
备曰辣根过氧化物酶标记的抗 酝员猿 抗体购自 孕葬则皂葬糟蚤葬
公司曰牛血清白蛋白渊月杂粤冤尧赭曲霉毒素 粤渊韵栽粤冤尧玉
米赤霉烯酮渊在耘晕冤尧伏马菌素 月员渊云月员冤尧黄曲霉毒素
月员渊粤云月员冤尧氨苄西林渊粤酝孕冤尧诺氟沙星渊晕云冤尧磺胺二
甲嘧啶渊杂酝圆冤尧氯霉素渊悦粤孕冤尧泰乐菌素渊栽蕴冤标准品
均购自美国 杂蚤早皂葬公司曰怨远 孔酶标板购自 悦燥泽贼藻则曰试验
用超纯水由本实验室制备曰其他试剂均为市售分析纯
级遥
员郾 圆摇 试验方法
员郾 圆郾 员摇 抗 韵栽粤 单克隆抗体的纯化 摇 用辛酸鄄硫酸铵
法纯化抗体袁参考 蕴葬皂遭藻则贼咱苑暂所述方法袁稍加改进遥 腹
水 远园园园 辕 皂蚤灶离心 员缘皂蚤灶袁取上清袁用 远皂燥造 辕 蕴的乙酸鄄乙
酸钠缓冲溶液渊责匀 越 源郾 园冤稀释 缘 倍袁用 缘皂燥造 辕 蕴 晕葬韵匀
调 责匀至 源郾 缘遥 逐滴加入辛酸至终浓度为 圆缘滋造 辕 皂造袁室
温搅拌 猿园皂蚤灶袁远园园园则 辕 皂蚤灶离心 猿园皂蚤灶袁收集上清遥 上清
经中速滤纸过滤 圆 次后与 员园 伊 孕月杂按 员颐 员园 比例混合袁
用 缘皂燥造 辕 蕴 晕葬韵匀 调 责匀 至 苑郾 源袁放入冰箱冷却至 源益遥
每毫升上述混合液加 园郾 圆苑苑愿早 固体硫酸铵袁源益搅拌
猿园皂蚤灶袁以 远园园园则 辕 皂蚤灶 离心 圆园皂蚤灶袁弃上清袁沉淀用少量
员 伊 孕月杂溶液溶解袁员 伊 孕月杂 溶液透析除去硫酸铵袁经
杂阅杂鄄孕粤郧耘鉴定袁阅哉圆远园园 核酸蛋白分析仪测定单克隆
抗体的含量袁 原 圆园益分装冻存遥
员郾 圆郾 圆摇 亲和筛选噬菌体随机七肽库摇 纯化抗 韵栽粤 单
克隆抗体每孔 员园园滋造渊员园园滋早 辕 皂造袁园郾 员皂燥造 辕 蕴 晕葬匀悦韵猿溶
液稀释冤袁源益 包被过夜袁源益 封闭 圆澡 渊缘皂早 辕 皂造 月杂粤袁
园郾 员皂燥造 辕 蕴 晕葬匀悦韵猿 溶液冤袁用 栽月杂栽 渊 缘园皂皂燥造 辕 蕴 栽则蚤泽鄄匀悦造袁责匀苑郾 缘袁员缘园皂皂燥造 辕 蕴 晕葬悦造袁园郾 员豫 栽憎藻藻灶鄄圆园冤洗涤 远
次袁每孔加入稀释后的噬菌体肽库 员园园滋造渊约含噬菌体
圆 伊 员园员员责枣怎冤袁室温下轻摇震荡 员澡袁弃去液体袁用 栽月杂栽
洗涤 员园 次袁洗去未结合的噬菌体后袁每孔加入洗脱液
渊郧造赠鄄匀悦造袁责匀圆郾 圆冤员园园滋造袁室温下轻摇震荡 愿皂蚤灶渊切勿
超过 愿皂蚤灶冤袁吸出洗脱液袁加入 员缘滋造 中和缓冲液至中
性遥 中和后的洗脱液除留一部分作滴度测定外袁其余
的洗脱液加到 圆园皂造 蕴月 培养液渊接种有处于对数生长
前期的 耘援 糟燥造蚤 耘砸圆苑猿愿冤中进行扩增培养袁猿苑益震荡培
养 源 耀 缘澡 后袁源益 员圆园园园则 辕 皂蚤灶 离心 员园皂蚤灶袁上清液加入
员 辕 远 体积的 孕耘郧 辕 晕葬悦造 溶液渊圆园豫 孕耘郧鄄愿园园园袁圆郾 缘皂燥造 辕 蕴
晕葬悦造冤袁源益沉淀过夜遥 沉淀后袁源益 员圆园园园则 辕 皂蚤灶 离心
员缘皂蚤灶袁弃上清袁再用 员皂造 栽月杂栽 悬浮噬菌体袁加入 员 辕 远
体积的 孕耘郧 辕 晕葬悦造 冰上孵育 远园皂蚤灶遥 再 源益 离心
员缘皂蚤灶袁去上清袁沉淀用 圆园园滋造 栽月杂栽溶液悬浮遥 测定滴
度后袁进行第 圆 次尧第 猿 次和第 源 次亲和筛选遥 每次加
入的噬菌体量都为 圆 伊 员园员员 责枣怎袁包被的抗体量分别为
苑缘尧缘园 和 圆缘滋早 辕 皂造遥 栽月杂栽 中 栽憎藻藻灶鄄圆园 的含量从第二
轮筛选起增至 园郾 缘豫 遥 其余步骤与第一轮筛选相同遥
第 源 轮筛选后的洗脱产物经滴度测定后袁从总量不到
员园园 个噬菌斑的平板上挑选若干蓝色噬菌斑袁分别置
于 员皂造接种处于对数生长期前期的 耘援 糟燥造蚤 耘砸圆苑猿愿 的
蕴月培养液中进行扩增培养尧纯化并测定滴度遥 所有的
亲和筛选操作过程均在超净工作台中完成袁所用溶液
都经过高压灭菌袁以避免受到野生型 酝员猿 噬菌体污
染咱愿暂 遥
员郾 圆郾 猿摇 孕澡葬早藻鄄耘蕴陨杂粤鉴定阳性噬菌体克隆摇 用 员园滋早 辕
圆苑圆员
摇 怨 期 赭曲霉毒素 粤模拟表位的筛选及免疫学鉴定
皂造纯化后的抗 韵栽粤 单克隆抗体包被 耘蕴陨杂粤 板袁缘皂早 辕
皂造 月杂粤 溶液封闭遥 每孔 员园园滋造 栽月杂栽 铺底袁每个要鉴
定的噬菌体克隆从 员颐 圆园园园 开始倍比稀释咱怨暂 袁猿苑益作用
员澡袁用 孕月杂栽洗涤 远 次袁加入 员颐 缘园园园 倍稀释的辣根过氧
化物酶标记的抗 酝员猿 单抗 员园园滋造 辕孔袁猿苑益作用 员澡袁
孕月杂栽 洗涤 远 次遥 加 栽酝月 显色液 员园园滋造 辕孔袁显色
源皂蚤灶袁圆皂燥造 辕 蕴 匀圆 杂韵源 员园园滋造 辕孔终止反应袁测定 源缘园灶皂
波长吸光度值渊粤冤遥 用原始肽库包板作为阳性对照袁
抗 在耘晕单抗包板作阴性对照渊晕悦冤袁抗 韵栽粤 单抗包板
加 孕月杂栽 作空白对照渊月悦冤遥 以待测孔 韵阅源缘园值逸晕悦
韵阅源缘园值的 圆郾 员 倍渊孕 辕 晕逸圆郾 员冤袁判为阳性咱员园暂 遥员郾 圆郾 源摇 最佳包被浓度和噬菌体工作浓度的选择摇 选
用纯化后的抗 韵栽粤单克隆抗体为包被原袁抗体的浓度
分别为 圆园尧员缘尧员园尧缘尧猿 和 员滋早 辕 皂造袁包被在 怨远 孔酶标板
中袁并封闭袁分别测定效价袁得到每个稀释倍数所对应
的噬菌体稀释倍数袁然后再分别测定敏感性袁计算
陨悦缘园袁选出 陨悦缘园最好的一组袁其所对应的包被浓度即为
最佳包被浓度袁对应的噬菌体浓度即为噬菌体最佳工
作浓度遥
员郾 圆郾 缘摇 阳性噬菌体克隆敏感性鉴定摇 采取直接竞争
耘蕴陨杂粤法鉴定阳性噬菌体克隆的敏感性袁纯化后的抗
韵栽粤单克隆抗体以最佳包被浓度包被好的 耘蕴陨杂粤 板袁
缘皂早 辕 皂造 月杂粤溶液封闭遥 加入不同浓度的 韵栽粤渊用乙
醇溶解袁孕月杂为稀释液配制冤缘园滋造 和阳性噬菌体 缘园滋造
渊工作浓度为优化后的噬菌体最佳工作浓度冤袁猿苑益
员澡袁用 孕月杂栽洗涤 远 次袁加入 员颐 缘园园园 倍稀释的辣根过氧
化物酶标记的抗 酝员猿 单克隆抗体渊员园园滋造 辕孔冤袁猿苑益作
用 员澡袁洗涤 远 次遥 加 栽酝月 显色液 渊员园园滋造 辕孔冤显色
源皂蚤灶袁圆皂燥造 辕 蕴 匀圆 杂韵源 员园园滋造 辕孔终止反应袁测定 源缘园灶皂
波长吸光度渊粤冤值遥 计算各浓度的结合率袁并作标准
曲线遥 结合率渊豫 冤 越 月 辕 月园 伊 员园园豫 渊月园为不加 韵栽粤 的粤值袁月为加 韵栽粤的 粤值冤遥
表 员摇 亲和筛选中噬菌体的富集
栽葬遭造藻 员摇 耘灶则蚤糟澡皂藻灶贼 燥枣 责澡葬早藻 蚤灶 遭蚤燥责葬灶灶蚤灶早
筛选轮次
则燥怎灶凿 燥枣 责葬灶灶蚤灶早
抗体包被量
葬灶贼蚤遭燥凿赠 渊滋早 辕 皂造冤
噬菌体投入量
责澡葬早藻 蚤灶责怎贼 渊责枣怎 辕 皂造冤
噬菌体洗脱量
责澡葬早藻 燥怎贼责怎贼 渊责枣怎 辕 皂造冤
回收率
则藻糟燥增藻则赠 则葬贼藻 渊豫 冤
员 员园园 员 伊 员园员员 苑郾 猿 伊 员园缘 苑郾 猿 伊 员园 原 源
圆 苑缘 员 伊 员园员员 源郾 源 伊 员园远 源郾 源 伊 员园 原 猿
猿 缘园 员 伊 员园员员 猿郾 圆缘 伊 员园怨 猿郾 圆缘 伊
源 圆缘 员 伊 员园员员 苑郾 愿 伊 员园怨 苑郾 愿
员郾 圆郾 远摇 阳性噬菌体克隆特异性鉴定摇 抗 韵栽粤单克隆
抗体的特异性鉴定是以 韵栽粤 及常见的真菌产物等作
为抑制剂袁用阻断 耘蕴陨杂粤测定各抑制物的 陨悦缘园袁以单克
隆抗体对 韵栽粤的 陨悦缘园与各抑制物的 陨悦缘园之比的百分数
为其交叉反应率渊悦砸豫 冤咱员员暂 袁参照此方法袁以 韵栽粤 和
韵栽粤结构类似的小分子化合物的单克隆抗体为包被
原袁包被量都为 员园滋早 辕 皂造遥 用 孕澡葬早藻 耘蕴陨杂粤测定阳性噬
菌体克隆对抗 韵栽粤 单克隆抗体和其他单克隆抗体的
韵阅源缘园值袁待测孔 韵阅源缘园值臆晕悦 韵阅源缘园值的 圆郾 员 倍渊孕 辕 晕臆圆郾 员冤袁判为阴性袁待测孔 韵阅源缘园值逸晕悦 韵阅源缘园值的 圆郾 员
倍渊孕 辕 晕逸圆郾 员冤袁判为阳性遥 若阳性噬菌体克隆与其他
小分子化合物单克隆抗体 耘蕴陨杂粤 结果都为阴性袁说明
该噬菌体克隆特异性好遥
员郾 圆郾 苑摇 阳性克隆的 阅晕粤测序及多肽序列分析摇 取扩
增和纯化后的噬菌体 缘园滋造袁进行噬菌体全菌测序遥 根
据插入的 阅晕粤序列翻译出氨基酸序列袁 原 怨远 早芋测序
引物 缘忆鄄匀韵悦悦悦 栽悦粤 栽粤郧 栽栽粤 郧悦郧 栽粤粤 悦郧 原猿忆遥
圆摇 结果与分析
圆郾 员摇 抗 韵栽粤单克隆抗体纯化结果
韵栽粤 腹水纯化后通过 杂阅杂鄄孕粤郧耘 鉴定可知渊图
员冤袁经分离纯化后的抗体在泳道中呈现 圆 条带袁分子
量约为 缘缘 和 圆远噪阅袁分别与抗体的重尧轻链分子量大小
一致袁且无其他杂带袁说明抗体纯化达到很好的效果遥
图 员摇 腹水纯化后 杂阅杂鄄孕粤郧耘图谱
云蚤早援 员摇 杂阅杂鄄孕粤郧耘 燥枣 责怎则蚤枣蚤藻凿 葬泽糟蚤贼藻泽
猿苑圆员
核摇 农摇 学摇 报 圆远 卷
圆郾 圆摇 亲和筛选结果
经过 源 轮亲和筛选袁每一轮投入的噬菌体量相同袁
但随着抗体包被量的减少尧洗涤液 栽憎藻藻灶鄄圆园 含量的增
加袁每轮选择性吸附于抗体的噬菌体量均有所增加袁噬
菌体的洗脱量从 苑郾 猿 伊 员园缘责枣怎 辕 皂造增加到 苑郾 愿 伊 员园怨责枣怎 辕
皂造袁回收率从 苑郾 猿 伊 员园 原源豫增加到 苑郾 愿豫 袁说明包被的
抗 韵栽粤单克隆抗体对噬菌体随机肽库中的噬菌体展
示多肽进行了有效的选择性富集袁即含有赭曲霉毒素
粤模拟表位的噬菌体粒子得到富集遥 结果见表 员遥
圆郾 猿摇 孕澡葬早藻鄄耘蕴陨杂粤鉴定阳性噬菌体克隆结果
从第 源 轮亲和筛选洗脱液的 员园远滴度板上挑取 圆圆
株噬菌体单克隆袁分别编号 源蕴员 耀 源蕴圆圆遥 图 圆 为 源蕴员 耀
源蕴圆圆 孕澡葬早藻鄄耘蕴陨杂粤 结果袁由图可看出袁圆圆 株噬菌体克
隆都能够与抗 韵栽粤单克隆抗体很好的结合袁孕 辕 晕 值都
远远大于 圆郾 员遥 因此袁初步鉴定该 圆圆 株噬菌体克隆均
为阳性克隆遥
图 圆摇 源蕴员 耀 源蕴圆圆 噬菌体克隆 孕澡葬早藻鄄耘蕴陨杂粤结果
云蚤早援 圆摇 栽澡藻 则藻泽怎造贼泽 燥枣 孕澡葬早藻鄄耘蕴陨杂粤
圆郾 源摇 最佳包被浓度和噬菌体工作浓度测定结果
表 圆 是在不同的包被抗体浓度下袁孕澡葬早藻鄄耘蕴陨杂粤
检测的试验结果袁根据该结果得到噬菌体的最佳工作
浓度渊韵阅源缘园值为 员郾 园 耀 员郾 缘 之间所对应噬菌体工作浓
度的 圆 倍冤袁再测定噬菌体的敏感性袁结果如图 猿遥 由
图 猿 可知袁包被的抗体浓度为 员园滋早 辕 皂造袁噬菌体稀释倍
数为 员颐 缘园园园 时袁陨悦缘园最低遥 因此选取最佳抗体包被浓
度是 员园滋早 辕 皂造袁最佳噬菌体工作浓度为 员颐 缘园园园遥
表 圆摇 间接 孕澡葬早藻鄄耘蕴陨杂粤结果
栽葬遭造藻 圆摇 栽澡藻 则藻泽怎造贼泽 燥枣 蚤灶凿蚤则藻糟贼 孕澡葬早藻鄄耘蕴陨杂粤
噬菌体稀释倍数
凿蚤造怎贼蚤燥灶 燥枣 责澡葬早藻
抗体包被量 葬灶贼蚤遭燥凿赠渊滋早 辕 皂造冤
圆园 员缘 员园 缘 猿 员
员颐 圆园园园 猿郾 源员愿 猿郾 源园源 猿郾 员愿愿 圆郾 缘缘缘 员郾 怨缘远 园郾 猿怨愿
员颐 源园园园 圆郾 缘远猿 圆郾 猿苑圆 圆郾 猿源苑 员郾 苑员员 员郾 圆苑源 园郾 圆猿苑
员颐 愿园园园 员郾 苑苑苑 员郾 苑员圆 员郾 缘猿圆 员郾 员缘员 园郾 苑源苑 园郾 圆猿猿
员颐 员远园园园 员郾 园愿缘 员郾 园缘远 园郾 怨园圆 园郾 远缘猿 园郾 源缘愿 园郾 圆员猿
员颐 猿圆园园园 园郾 远猿怨 园郾 缘远园 园郾 缘园员 园郾 猿缘愿 园郾 圆猿远 园郾 员怨猿
员颐 远源园园园 园郾 猿源员 园郾 猿猿怨 园郾 猿园园 园郾 圆园远 园郾 员愿愿 园郾 员愿怨
员颐 员圆愿园园园 园郾 圆愿远 园郾 员苑怨 园郾 圆远员 园郾 员愿远 园郾 员圆苑 园郾 员远圆
晕悦 园郾 园怨园 园郾 员员圆 园郾 员远园 园郾 园怨远 园郾 园愿源 园郾 园远愿
月悦 园郾 园远远 园郾 园苑怨 园郾 园苑源 园郾 园愿愿 园郾 园源愿 园郾 园圆远
图 猿摇 不同包被浓度对应的 陨悦缘园趋势图
云蚤早援 猿摇 陨悦缘园 则怎灶 糟澡葬则贼 燥枣 凿蚤枣枣藻则藻灶贼
责葬糟噪葬早藻 糟燥灶糟藻灶贼则葬贼蚤燥灶
圆郾 缘摇 阳性噬菌体克隆敏感性鉴定结果
以直接竞争法鉴定噬菌体的敏感性袁经鉴定袁圆圆
株噬菌体克隆敏感性较好袁都能被赭曲霉毒素 粤 标品
抑制遥 根据图 源 所示结果袁全部的数据能够呈现出的
曲线趋势均是典型的 杂 型曲线袁所得到的线性范围是
选取快速下降区间部分袁因此可以得出线性范围为
圆缘园 耀 愿园园园责早 辕 皂造遥
圆郾 远摇 阳性噬菌体克隆特异性鉴定结果
以抗 栽蕴尧在耘晕尧晕云尧粤酝孕尧云月员尧杂酝圆尧悦粤孕尧粤云月员 的
单克隆抗体渊由河南省动物免疫学重点实验室制备冤
为阴性对照袁分别进行 孕澡葬早藻鄄耘蕴陨杂粤测定袁数据结果表
明袁圆圆 株噬菌体仅能够与抗 韵栽粤 单克隆抗体结合袁即
孕 辕 晕值大于 圆郾 员袁与其他 愿 种无关单克隆抗体不能结
摇 摇 摇 摇
源苑圆员
摇 怨 期 赭曲霉毒素 粤模拟表位的筛选及免疫学鉴定
表 猿摇 源蕴员怨 噬菌体克隆特异性鉴定结果
栽葬遭造藻 猿摇 栽澡藻 则藻泽怎造贼 燥枣 贼澡藻 泽责藻糟蚤葬造 蚤凿藻灶贼蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣 责澡葬早藻 源蕴员怨糟造燥灶藻
单抗
皂粤遭
稀释倍数
凿蚤造怎贼蚤燥灶 糟燥灶糟藻灶贼则葬贼蚤燥灶
圆园园园 源园园园 愿园园园 员远园园园 猿圆园园园 远源园园园 员圆愿园园园
空白
遭造葬糟噪
韵栽粤 员郾 园源缘 园郾 远愿员 园郾 源圆远 园郾 猿园愿 园郾 员远员 园郾 员员缘 园郾 园愿园 园郾 园缘源
栽蕴 园郾 园愿愿 园郾 园远愿 园郾 园愿缘 园郾 园远愿 园郾 园怨缘 园郾 园苑猿 园郾 园苑猿 园郾 园远怨
在耘晕 园郾 园怨圆 园郾 园远员 园郾 园苑缘 园郾 园远源 园郾 园远愿 园郾 园远源 园郾 园缘远 园郾 园缘猿
晕云 园郾 园远园 园郾 园缘员 园郾 园愿愿 园郾 园缘愿 园郾 园苑园 园郾 园缘愿 园郾 园缘猿 园郾 园缘员
粤酝孕 园郾 园苑员 园郾 园缘源 园郾 园怨源 园郾 园远猿 园郾 园远猿 园郾 园远员 园郾 园远员 园郾 园远员
云月员 园郾 园远缘 园郾 园缘远 园郾 员员源 园郾 园缘怨 园郾 园苑愿 园郾 园远圆 园郾 园愿员 园郾 园苑远
杂酝圆 园郾 园远圆 园郾 园缘远 园郾 园愿远 园郾 园缘愿 园郾 园远怨 园郾 园远员 园郾 园缘远 园郾 园缘猿
悦粤孕 园郾 园缘怨 园郾 园源怨 园郾 园怨苑 园郾 园缘苑 园郾 园苑远 园郾 园远圆 园郾 园远苑 园郾 园缘愿
粤云月员 园郾 员源员 园郾 员员源 园郾 园愿苑 园郾 园苑员 园郾 园怨员 园郾 园苑怨 园郾 员园圆 园郾 园愿远
合袁即 孕 辕 晕值小于 圆郾 员遥 因此可以说明 圆圆 株噬菌体特
异性很好袁本文以 源蕴员怨 株噬菌体数据为例袁结果见表
猿尧图 缘遥
图 源摇 源蕴员圆 耀 源蕴圆圆 的直接竞争 耘蕴陨杂粤结果
云蚤早援 源 栽澡藻 泽贼葬灶凿葬则凿 糟怎则增藻泽 燥枣 凿蚤则藻糟贼 糟燥皂责藻贼蚤贼蚤增藻 耘蕴陨杂粤
圆郾 苑摇 阳性噬菌体 阅晕粤序列分析
圆圆 株阳性克隆经 阅晕粤 测序后袁翻译得到插入七
肽的氨基酸序列渊表 源冤遥 由表 源 可知袁赭曲霉毒素 粤
图 缘摇 源蕴员怨 噬菌体克隆特异性鉴定结果
云蚤早援 缘摇 栽澡藻 则藻泽怎造贼 燥枣 贼澡藻 泽责藻糟蚤葬造 蚤凿藻灶贼蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶
燥枣 责澡葬早藻 糟造燥灶藻
模拟表位的主要多肽序列为院酝孕蕴宰载阅蕴袁载 为任意氨
基酸遥
猿摇 讨论
猿郾 员摇 孕澡葬早藻鄄耘蕴陨杂粤鉴定阳性噬菌体克隆
在鉴定阳性噬菌体克隆时袁噬菌体加入量很关键遥
常用的方法是通过双层琼脂平板法测定噬菌体的滴
度袁算出噬菌体的浓度袁一般加入量是 员 伊 员园员圆 责枣怎袁按
照每株噬菌体的滴度结果袁算出相对应的噬菌体加入
量袁再进行 源 倍系列稀释遥 此方法的弊端是工作量巨
大袁滴度结果有偏差等遥 在总结常规 耘蕴陨杂粤 方法基础
上袁本试验得到新的方法袁即按照每株噬菌体克隆的稀
释倍数测定 耘蕴陨杂粤结果袁每株噬菌体都从相应的稀释
倍数进行倍比稀释袁且通过蓝白斑筛选试验和噬菌体
全菌测序可以判断出噬菌体在进行扩增时是否被野生
型的噬菌体污染遥 该方法的引入大大减少了试验的
缘苑圆员
核摇 农摇 学摇 报 圆远 卷
摇 摇 摇 摇 表 源摇 阳性噬菌体插入 阅晕粤和多肽序列结果
栽葬遭造藻 源摇 栽澡藻 阅晕粤 葬灶凿 责藻责贼蚤凿藻 泽藻择怎藻灶糟藻泽 燥枣 责燥泽蚤贼蚤增藻 糟造燥灶藻泽
阳性噬菌体克隆编号
灶怎皂遭藻则 燥枣 责燥泽蚤贼蚤增藻 责澡葬早藻
阅晕粤序列
阅晕粤 泽藻择怎藻灶糟藻泽
多肽序列
责藻责贼蚤凿藻 泽藻择怎藻灶糟藻泽
源蕴远 悦栽栽悦悦栽栽郧郧粤粤郧悦栽郧悦栽栽郧栽栽 蕴孕宰运蕴蕴灾
源蕴员源 栽栽郧悦悦栽栽郧郧粤粤郧悦栽栽栽栽郧郧悦郧 蕴孕宰运蕴蕴粤
源蕴圆园 栽栽郧悦悦郧栽郧郧悦郧郧栽栽郧悦栽栽郧悦栽 蕴孕宰砸蕴蕴粤
源蕴员猿尧源蕴员愿尧源蕴猿尧源蕴愿尧源蕴圆圆 粤栽郧悦悦郧悦栽栽栽郧郧郧粤郧郧粤栽悦栽郧 酝孕蕴宰耘阅蕴
源蕴缘尧源蕴员员尧源蕴员怨尧源蕴员苑 粤栽郧悦悦郧悦栽栽栽郧郧栽悦栽郧粤栽悦栽郧 酝孕蕴宰杂阅蕴
源蕴员缘 粤栽郧悦悦栽粤栽栽栽郧郧栽悦郧郧粤栽悦栽郧 酝孕陨宰杂阅蕴
源蕴员远 粤栽郧悦悦栽粤栽栽栽郧郧郧悦栽郧粤栽粤栽栽 酝孕陨宰粤阅陨
源蕴怨 栽粤栽悦粤栽栽栽栽悦悦郧郧粤栽郧栽栽栽栽栽 再匀云孕阅灾云
源蕴圆 栽粤栽悦粤栽栽栽栽郧栽栽郧粤栽郧栽栽栽栽栽 再匀云灾阅灾云
源蕴员 栽粤栽悦粤栽栽栽栽郧郧栽郧粤郧栽栽郧栽粤栽 再匀云郧耘蕴再
源蕴苑 栽粤栽悦粤栽栽粤郧郧栽栽郧粤栽悦栽郧栽粤栽 再匀匝灾阅蕴再
源蕴员圆尧源蕴员园 悦粤栽悦粤栽栽栽栽悦郧郧郧粤栽悦栽栽栽粤栽 匀匀云砸阅蕴再
源蕴圆员 悦粤栽悦粤栽栽栽栽粤粤栽郧粤栽栽栽郧栽粤栽 匀匀云晕阅蕴再
源蕴源 悦粤栽悦悦郧粤栽郧悦悦郧悦悦郧悦悦郧悦粤郧 匀孕酝孕孕孕匝
工作量袁同时也使整个试验系统更稳定尧重复性更高遥
猿郾 圆摇 阳性噬菌体克隆特异性鉴定
筛选噬菌体随机七肽库得到的噬菌体单克隆是否
特异性与 韵栽粤 皂粤遭结合袁需要进行特异性鉴定遥 由于
缺少此方面试验袁所以参考单克隆抗体的特异性鉴定
方法袁它是以靶标抗原以外的其他抗原作为抑制剂袁再
测定交叉反应率袁因此设计以 韵栽粤 皂粤遭外的 愿 种无关
单抗为对照袁测定筛选到的噬菌体单克隆与无关单抗
反应的 韵阅源缘园值袁若 韵阅源缘园值都处于阴性水平袁说明该噬
菌体克隆的特异性很好遥 本试验结果证明了此方法的
可行性和准确性遥
猿郾 猿摇 阳性噬菌体 阅晕粤序列分析
本研究得到赭曲霉毒素 粤 的模拟表位的主要序
列为院酝孕蕴宰载阅蕴袁载为任意氨基酸遥 与之前报道的赭
曲霉毒素 粤的模拟表位的氨基酸序列渊 陨砸孕酝灾载载袁 载
为任意氨基酸冤不一致咱缘袁 员圆暂 袁这是由于模拟表位肽与
单克隆抗体之间的结合是一一对应关系袁抗体不同株袁
模拟表位肽也差别很大袁同时分析本研究得到的氨基
酸序列收敛情况袁可以发现特殊的氨基酸序列占主导
地位袁比如 酝孕蕴宰载阅蕴袁其他序列的密码子在一个或者
更多的位置上有差异袁这样的结果表示院筛选所采用的
文库具有合适的多样性曰筛选的进行基于氨基酸序列
结合特性的倾向性袁而这种结合特性往往与多肽的空
间结构相关袁它们的一级结构并不一定高度同源咱员猿暂 遥
纯度高尧特异性强尧敏感性高的单克隆抗体是获得优质
抗原模拟表位的首要条件袁本课题采用的抗 韵栽粤单克
隆抗体具有高纯度尧强特异性尧高敏感性等特性袁单克
隆抗体间接 耘蕴陨杂粤 效价达 员 颐 苑郾 远愿 伊 员园缘袁 陨悦缘园 为
员员圆郾 愿责早 辕 皂造袁亲和常数为 怨郾 苑源 伊 员园员员 蕴 辕 皂燥造袁与赭曲霉
毒素 月交叉反应率为 员苑豫 袁为试验开展奠定了良好的
基础遥
源摇 结论
本试验利用噬菌体随机七肽库可成功筛选到赭曲
霉毒素 粤的模拟表位遥 经过 源 轮亲和筛选袁共得到 圆圆
株与 韵栽粤 皂粤遭 特异结合的阳性噬菌体克隆袁且该结合
都能够被 韵栽粤标品阻断遥 阅晕粤 测序及多肽核心序列
分析后袁得到赭曲霉毒素 粤 的模拟表位的主要序列
为院酝孕蕴宰载阅蕴袁载为任意氨基酸遥 以阳性噬菌体克隆
建立的竞争 耘蕴陨杂粤 检测方法袁线性范围为 圆缘园 耀
愿园园园责早 辕 皂造袁检测下限 员园园责早 辕 皂造遥 为制备 韵栽粤 无毒
耘蕴陨杂粤检测试剂盒和试纸条奠定了良好的基础遥
参考文献院
咱 员 暂摇 匀觟澡造藻则 阅援 韵糟澡则葬贼燥曾蚤灶 粤 蚤灶 枣燥燥凿 葬灶凿 枣藻藻凿院 燥糟糟怎则则藻灶糟藻袁 造藻早蚤泽造葬贼蚤燥灶
葬灶凿 皂燥凿藻 燥枣 葬糟贼蚤燥灶 咱 允 暂 援 在藻蚤贼泽糟澡则蚤枣贼 枣怎则 耘则灶葬澡则怎灶早泽憎蚤泽泽藻灶泽糟澡葬枣贼袁
员怨怨愿袁 猿苑渊员冤院 圆 原 员圆
咱 圆 暂摇 悦则藻责责赠 耘 耘袁 月葬怎凿则蚤皂燥灶贼 陨袁 月藻贼遭藻凿藻则 粤 酝援 孕则藻增藻灶贼蚤燥灶 燥枣
灶藻责澡则燥贼燥曾蚤糟蚤贼赠 燥枣 燥糟澡则葬贼燥曾蚤灶 粤袁 葬 枣燥燥凿 糟燥灶贼葬皂蚤灶葬灶贼咱 允暂 援 栽燥曾蚤糟燥造燥早赠
造藻贼贼藻则泽袁 员怨怨缘袁 愿圆院 愿远怨 原 愿苑苑
咱 猿 暂摇 蕴藻蚤贼灶藻则 粤袁 在觟造造灶藻则葬 孕袁 孕葬燥造蚤造造燥员 粤袁 藻贼 葬造援 悦燥皂责葬则蚤泽燥灶 燥枣 皂藻贼澡燥凿泽 枣燥则
贼澡藻 凿藻贼藻则皂蚤灶葬贼蚤燥灶 燥枣 燥糟澡则葬贼燥曾蚤灶 粤 蚤灶 憎蚤灶藻咱 允暂 援 粤灶葬造赠贼蚤糟葬 悦澡蚤皂蚤糟葬
粤糟贼葬袁 圆园园圆袁 源缘猿渊员冤院 猿猿 原 源员
咱 源 暂摇 杂糟燥贼贼 允 运袁 杂皂蚤贼澡 郧 孕援 杂藻葬则糟澡蚤灶早 枣燥则 责藻责贼蚤凿藻 造蚤早葬灶凿泽 憎蚤贼澡 葬灶 藻责蚤贼燥责藻
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咱 缘 暂摇 蕴蚤怎 砸 砸袁 再怎 在袁 匀藻 匝 匀袁 藻贼 葬造援 粤灶 蚤皂皂怎灶燥葬泽泽葬赠 枣燥则 燥糟澡则葬贼燥曾蚤灶 粤
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咱 远 暂摇 孕葬灶凿藻 允袁 杂扎藻憎糟扎赠噪 酝 酝袁 郧则燥增藻则 粤 运援 孕澡葬早藻 凿蚤泽责造葬赠院 糟燥灶糟藻责贼袁
远苑圆员
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圆园员园袁 圆愿渊远冤院 愿源怨 原 愿缘愿
咱 苑 暂 摇 蕴葬皂遭藻则贼 蕴 粤袁 宰葬则灶藻则 宰 郧袁 宰藻蚤 砸 砸袁 藻贼 葬造援 栽澡藻 责则燥贼藻糟贼蚤增藻 遭怎贼
灶燥灶泽赠灶藻则早蚤泽贼蚤糟 藻枣枣藻糟贼 燥枣 凿蚤藻贼葬则赠 茁 原 糟葬则燥贼藻灶藻 葬灶凿 增蚤贼葬皂蚤灶 耘 燥灶 泽噪蚤灶
贼怎皂燥则蚤早藻灶藻泽蚤泽 蚤灶 杂噪澡 皂蚤糟藻 咱 允暂 援 晕怎贼则蚤贼蚤燥灶 葬灶凿 悦葬灶糟藻则袁 员怨怨源袁 员
渊圆员冤院 员 原 员圆
咱 愿 暂 摇 月则葬贼噪燥增蚤 栽援 孕则燥早则藻泽泽 蚤灶 责澡葬早藻 凿蚤泽责造葬赠院 藻增燥造怎贼蚤燥灶 燥枣 贼澡藻 贼藻糟澡灶蚤择怎藻
葬灶凿 蚤贼泽 葬责责造蚤糟葬贼蚤燥灶泽 咱 允 暂 援 悦藻造造怎造葬则 葬灶凿 酝燥造藻糟怎造葬则 蕴蚤枣藻 杂糟蚤藻灶糟藻泽袁
圆园员园袁 远苑渊缘冤院 苑源怨 原 苑远苑
咱 怨 暂 摇 在澡葬燥 再 蕴袁 在澡葬灶早 郧 孕袁 蕴蚤怎 匝 栽袁 藻贼 葬造援 阅藻增藻造燥责皂藻灶贼 燥枣 葬 造葬贼藻则葬造 枣造燥憎
糟燥造造燥蚤凿葬造 早燥造凿 蚤皂皂怎灶燥葬泽泽葬赠 泽贼则蚤责 枣燥则 贼澡藻 则葬责蚤凿 凿藻贼藻糟贼蚤燥灶 燥枣
藻灶则燥枣造燥曾葬糟蚤灶 则藻泽蚤凿怎藻泽 咱 允 暂 援 允燥怎则灶葬造 燥枣 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 葬灶凿 云燥燥凿
悦澡藻皂蚤泽贼则赠袁 圆园园愿袁 缘远渊圆源冤院 员圆员猿愿 原 员圆员源圆
咱员园暂摇 栽蚤躁泽泽藻灶 孕援 孕则葬糟贼蚤糟藻 葬灶凿 贼澡藻燥则赠 燥枣 藻灶扎赠皂藻 蚤皂皂怎灶燥葬泽泽葬赠泽 咱 酝 暂援
耘造泽藻增蚤藻则 杂糟蚤藻灶糟藻 蕴贼凿袁 员怨愿缘
咱员员暂摇 杂澡藻造增藻则 宰 蕴袁 杂皂蚤贼澡 阅 允援 阅藻增藻造燥责皂藻灶贼 燥枣 葬灶 蚤皂皂怎灶燥葬泽泽葬赠 枣燥则 贼澡藻 茁
原 葬凿则藻灶藻则早蚤糟 葬早燥灶蚤泽贼 则葬糟贼燥责葬皂蚤灶藻咱 允暂 援 允燥怎则灶葬造 燥枣 陨皂皂怎灶燥葬泽泽葬赠 葬灶凿
陨皂皂怎灶燥糟澡藻皂蚤泽贼则赠袁 圆园园园袁 圆员渊员冤院 员 原 圆猿
咱员圆暂摇 刘仁荣袁 余 宙袁 何庆华袁 王 希袁 许 杨援 噬菌体展示肽库筛选赭
曲霉毒素 粤模拟表位的研究咱允暂 援 卫生研究袁 圆园园缘袁 猿源渊源冤院 源源愿
原 源缘园
咱员猿暂摇 悦造葬糟噪泽燥灶 栽袁 蕴燥憎皂葬灶 匀 月援 孕澡葬早藻 凿蚤泽责造葬赠院 葬 责则葬糟贼蚤糟葬造 葬责责则燥葬糟澡
咱酝暂援 韵曾枣燥则凿 哉灶蚤增藻则泽蚤贼赠 孕则藻泽泽袁 圆园园源
渊责任编辑摇 邱爱枝冤
苑苑圆员