全 文 ：摇 核 农 学 报摇 圆园员圆袁圆远渊猿冤院园缘员员 耀 园缘员缘允燥怎则灶葬造 燥枣 晕怎糟造藻葬则 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 杂糟蚤藻灶糟藻泽
文章编号院员园园园鄄愿缘缘员渊圆园员圆冤园猿鄄园缘员员鄄园远
食品辐照标志物 阅蚤匀栽的人工抗原合成及鉴定
王志伟员袁圆袁猿 摇 潘家荣猿 摇 李淑荣圆 摇 王志东圆 摇 高美须圆
李秉超员 摇 睢摇 珂圆袁猿 摇 王摇 磊猿
渊员郾 沈阳农业大学食品学院袁辽宁 沈阳摇 员员园愿远远曰 圆郾 中国农业科学院农产品加工研究所 辕农业部
农产品加工综合性重点实验室袁北京摇 员园园员怨猿曰猿郾 中国计量学院生命科学学院袁浙江 杭州摇 猿员园园员愿冤
摘摇 要院以二氢脱氧胸腺嘧啶渊阅蚤匀栽冤为初始反应物袁应用琥珀酸酐法合成二氢脱氧胸腺嘧啶的衍生物袁
即半抗原 阅蚤匀栽鄄悦韵韵匀袁经薄层色谱渊栽蕴悦冤和核磁共振波谱渊晕酝砸冤对其进行鉴定曰采用混合酸酐法与活
化酯法分别将半抗原与载体蛋白 月杂粤尧韵灾粤进行偶联袁制备二氢脱氧胸腺嘧啶的人工抗原和包被原袁通
过紫外扫描尧杂阅杂鄄孕粤郧耘凝胶电泳方法对其进行鉴定袁偶联比分别为 怨郾 愿颐 员和 员圆颐 员遥 人工抗原偶联成功
后免疫 月粤蕴月 辕 糟小鼠制备多抗血清袁间接非竞争 耘蕴陨杂粤方法检测效价达 员颐 圆郾 缘远 伊 员园源袁表明人工抗原合
成成功遥
关键词院二氢脱氧胸腺嘧啶曰 半抗原曰 人工抗原曰 酶联免疫
杂再晕栽匀耘杂陨杂 粤晕阅 陨阅耘晕栽陨云陨悦粤栽陨韵晕 韵云 栽匀耘 粤砸栽陨云陨悦陨粤蕴 粤晕栽陨郧耘晕
云韵砸 阅蚤匀栽 陨晕 陨砸砸粤阅陨粤栽陨韵晕 云韵韵阅
宰粤晕郧 在澡蚤鄄憎藻蚤员袁圆袁猿 摇 孕粤晕 允蚤葬鄄则燥灶早猿摇 蕴陨 杂澡怎鄄则燥灶早圆 摇 宰粤晕郧 在澡蚤鄄凿燥灶早圆
郧粤韵 酝藻蚤鄄曾怎圆 摇 蕴陨 月蚤灶早鄄糟澡葬燥员 摇 杂哉陨 运藻圆袁猿 摇 宰粤晕郧 蕴藻蚤猿
渊员郾 悦燥造造藻早藻 燥枣 云燥燥凿 杂糟蚤藻灶糟藻袁 杂澡藻灶赠葬灶早 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 哉灶蚤增藻则泽蚤贼赠袁 杂澡藻灶赠葬灶早袁 蕴蚤葬燥灶蚤灶早摇 员员园愿远远曰
圆郾 悦燥皂责则藻澡藻灶泽蚤增藻 运藻赠 蕴葬遭燥则葬贼燥则赠 燥枣 粤早则燥鄄孕则燥凿怎糟贼泽 孕则燥糟藻泽泽蚤灶早袁 酝蚤灶蚤泽贼则赠 燥枣 粤早则蚤糟怎造贼怎则藻 辕 粤早则燥鄄枣燥燥凿 责则燥糟藻泽泽蚤灶早 陨灶泽贼蚤贼怎贼藻袁
悦澡蚤灶藻泽藻 粤糟葬凿藻皂赠 燥枣 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 杂糟蚤藻灶糟藻泽袁 月藻蚤躁蚤灶早摇 员园园员怨猿曰 猿郾 悦燥造造藻早藻 燥枣 蕴蚤枣藻 杂糟蚤藻灶糟藻泽袁 悦澡蚤灶葬 允蚤造蚤葬灶早 哉灶蚤增藻则泽蚤贼赠袁 匀葬灶早扎澡燥怎袁 在澡藻躁蚤葬灶早摇 猿员园园员愿冤
粤遭泽贼则葬糟贼院陨灶 贼澡藻 责则藻泽藻灶贼 泽贼怎凿赠袁 缘袁 远鄄阅蚤澡赠凿则燥贼澡赠皂蚤凿蚤灶藻 匀葬责贼藻灶 渊 阅蚤匀栽鄄悦韵韵匀冤 憎葬泽 泽赠灶贼澡藻泽蚤扎藻凿 遭赠 怎泽蚤灶早 缘袁 远鄄
阅蚤澡赠凿则燥贼澡赠皂蚤凿蚤灶藻 渊阅蚤匀栽冤 葬泽 则葬憎 皂葬贼藻则蚤葬造援 阅蚤匀栽鄄悦韵韵匀 憎葬泽 蚤凿藻灶贼蚤枣蚤藻凿 遭赠 贼澡蚤灶 造葬赠藻则 糟澡则燥皂葬贼燥早则葬责澡赠 葬灶凿 员匀鄄晕酝砸援
匀葬责贼藻灶 憎葬泽 糟燥灶躁怎早葬贼藻凿 贼燥 遭燥增蚤灶藻 泽藻则怎皂 葬造遭怎皂蚤灶 渊月杂粤冤 葬灶凿 燥增葬造遭怎皂蚤灶 渊韵灾粤冤 贼燥 燥遭贼葬蚤灶 葬则贼蚤枣蚤糟蚤葬造 蚤皂皂怎灶藻 葬灶贼蚤早藻灶 葬灶凿
糟燥葬贼蚤灶早 葬灶贼蚤早藻灶袁 则藻泽责藻糟贼蚤增藻造赠援 粤枣贼藻则 凿藻贼藻糟贼藻凿 遭赠 哉灾 泽责藻糟贼则燥泽糟燥责赠 葬灶凿 杂阅杂鄄孕粤郧耘袁 贼澡藻 则葬贼蚤燥泽 燥枣 匀葬责贼藻灶 贼燥 责则燥贼藻蚤灶 憎藻则藻
糟葬造糟怎造葬贼藻凿援 栽澡藻 糟燥灶躁怎早葬贼蚤燥灶 则葬贼蚤燥泽 燥枣 蚤皂皂怎灶燥早藻灶 葬灶凿 糟燥葬贼蚤灶早 葬灶贼蚤早藻灶 憎藻则藻 怨郾 愿颐 员 葬灶凿 员圆颐 员袁 则藻泽责藻糟贼蚤增藻造赠援 粤灶贼蚤泽藻则葬 憎藻则藻
燥遭贼葬蚤灶藻凿 遭赠 蚤皂皂怎灶蚤扎蚤灶早 月粤蕴月 辕 糟 憎蚤贼澡 蚤皂皂怎灶燥早藻灶 葬灶凿 贼澡藻 贼蚤贼藻则 憎藻则藻 员 颐 圆郾 缘远 伊 员园源袁 憎澡蚤糟澡 蚤灶凿蚤糟葬贼藻凿 贼澡藻 泽赠灶贼澡藻泽蚤泽 燥枣
葬则贼蚤枣蚤糟蚤葬造 葬灶贼蚤早藻灶 憎葬泽 泽怎糟糟藻泽泽枣怎造援
运藻赠 憎燥则凿泽院阅蚤匀栽曰 匀葬责贼藻灶曰 葬则贼蚤枣蚤糟蚤葬造 葬灶贼蚤早藻灶曰 耘蕴陨杂粤
收稿日期院圆园员员鄄员圆鄄圆园摇 接受日期院圆园员员鄄园猿鄄员怨
基金项目院国家科技支撑计划项目渊圆园园怨月粤粤圆源月园缘冤袁国防科技工业民用专项科研技术研究项目
作者简介院王志伟渊员怨愿缘鄄冤袁男袁辽宁沈阳人袁硕士研究生袁研究方向为辐照食品安全检测和免疫学研究遥 耘鄄皂葬蚤造院扎澡蚤憎藻蚤憎岳 赠藻葬澡援 灶藻贼
通讯作者院李秉超渊员怨缘缘鄄冤袁男袁辽宁沈阳人袁教授袁研究方向为食品生物化学遥 耘鄄皂葬蚤造院 愿愿源愿苑远缘猿岳 员远猿援 糟燥皂
李淑荣渊员怨远愿鄄冤袁女袁黑龙江北安人袁研究员袁主要从事食品生物技术方面的研究遥
摇 摇 经过几十年的研究袁辐照技术作为一种高效尧生
态尧安全的高新技术袁对确保食品的卫生安全尧减少产
后损失尧促进贸易与消费起着不可替代的作用遥 其应
用已被越来越多的国家所认可袁据初步统计袁全球已有
员员缘
核摇 农摇 学摇 报 圆远 卷
猿愿 个国家和地区批准了 缘源愿 种食品和调味品可用辐
照处理咱员袁圆暂 遥 但鉴于辐照食品的特殊性袁悦粤悦 辐照食
品的通用标准和很多国家的法规都规定对辐照食品要
进行标识袁悦粤悦 辐照食品的通用规则中规定袁辐照食
品的最大吸收剂量不应超过 员园噪郧赠袁即使最终产品的
辐照成分构成小于 员豫 袁也必须强制在标签上注明该
产品已辐照咱猿袁源暂 遥 悦粤悦 目前已经颁布了 员园 种辐照食
品的鉴定方法袁如热释光 渊 栽蕴冤 法尧电子自旋共振
渊耘杂砸冤法和光释光渊孕杂陨冤法尧阅晕粤彗星法等咱缘 耀 员员暂 袁为辐
照食品的监管提供技术支撑袁但这些鉴定方法检测时
间长尧前处理繁琐袁需要昂贵的仪器设备和专业人员操
作遥 随着辐照食品国际贸易的正常进行袁各国对辐照
食品鉴定技术的要求愈加迫切袁在国际贸易中袁尤其是
海关和商检部门袁需要鉴定的样品越来越多袁急需建立
简便尧快速尧特异尧灵敏的鉴定方法遥
酶联免疫吸附法 渊 耘灶扎赠皂藻鄄造蚤灶噪藻凿 蚤皂皂怎灶泽燥则遭藻灶贼
葬泽泽葬赠袁 耘蕴陨杂粤冤是一种结合免疫特异反应和酶促反应
的快速检测方法袁它基于抗原与抗体的特异性反应袁具
有特异性强尧灵敏度高尧分析量大尧安全快速等优点袁在
检测食品中药物残留及真菌毒素等危害物方面得到广
泛应用咱员圆暂 遥 酶联免疫分析在辐照食品鉴定中的应用
探索已有一些报道袁如食品辐照特异性产物 圆 原十二
烷基环丁酮的酶联免疫测定方法研究等咱员猿 耀 员远暂 遥 粤灶灶藻
蕴 栽赠则藻皂葬灶等用电子加速器辐照虾袁利用产生的特异性
降解产物 阅蚤匀栽渊缘袁远鄄阅蚤澡赠凿则燥贼澡赠皂蚤凿蚤灶藻袁二氢脱氧胸腺
嘧啶袁图 员冤成功制备了单克隆抗体袁首次进行了酶联
免疫分析的研究袁结果表明酶联免疫具备对辐照食品
检测的能力遥 但单抗只针对单一抗原决定簇袁抗体固
定的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围遥
多克隆抗体是由多个不同克隆的 月 细胞产生的袁是多
细胞的混合物袁与抗体的亲和力和灵敏度相对较高袁目
标更广泛遥 本研究以食品辐照特异性辐解产物
阅蚤匀栽咱员袁远暂为研究对象袁通过混合酸酐法尧活化酯法设计
和合成半抗原和人工抗原袁制备多克隆抗体袁为建立基
于食品特异性辐解产物 阅蚤匀栽 的食品辐照免疫鉴定方
法提供理论依据和技术支撑遥
员摇 材料与方法
员郾 员摇 材料
员郾 员郾 员摇 试 剂 摇 二 氢 脱 氧 胸 腺 嘧 啶 渊 缘袁 远鄄
阅蚤澡赠凿则燥贼澡赠皂蚤凿蚤灶藻冤尧羟琥珀酰亚胺渊晕匀杂冤尧牛血清白蛋
白渊月杂粤冤尧卵血清白蛋白渊韵灾粤冤尧氯甲酸异丁酯尧水溶
性碳化二亚胺渊耘阅粤悦冤和透析袋均购于美国 杂蚤早皂葬 公
图 员摇 二氢脱氧胸腺嘧啶分子结构
云蚤早援 员 酝燥造藻糟怎造葬则 泽贼则怎糟贼怎则藻 燥枣 凿蚤澡赠凿则燥贼澡赠皂蚤凿蚤灶藻
司袁所用试剂均为进口分装分析纯曰晕忆晕 原二环己基碳
二亚胺渊阅悦悦冤购于德国 酝耘砸悦运鄄杂糟澡怎糟澡葬则凿则曰晕忆晕 原二
甲基甲酰胺渊阅酝云冤尧三正丁胺和琥珀酸酐均购于北京
化学试剂公司袁所用试剂均为分析纯级遥
员郾 员郾 圆 摇 仪器与设备 摇 酝蚤造造蚤责燥则藻 纯水系统袁美国
酝蚤造造蚤责燥则藻公司曰月蚤燥鄄砸葬凿 远愿园 酶标仪袁美国伯乐公司曰
粤造造藻早则葬型低温离心机袁美国 月藻糟噪皂葬灶鄄糟燥怎造贼藻则 公司曰台
式冷冻干燥机袁美国 蕴葬遭糟燥灶糟燥 公司曰猿圆园 型 责匀 酸度
计袁德国 酝藻贼贼造藻则鄄栽燥造藻凿燥 公司曰微型旋涡混合仪袁德国
陨运粤 公司曰核磁共振波谱仪 粤灾粤晕悦耘 粤灾 源园园酝匀扎
阅蚤早蚤贼葬造 云栽鄄晕酝砸 杂责藻糟贼则燥皂藻贼藻则 袁瑞士 月砸哉运耘砸公司曰哉灾鄄
圆源缘园 紫外光谱仪袁日本岛津公司曰旋转蒸发仪袁上海亚
荣生化仪器厂曰磁力搅拌器袁江苏荣华仪器制造有限公
司遥
员郾 员郾 猿摇 试验动物摇 月粤蕴月 辕 糟小鼠渊雌性 源 周龄冤袁由浙
江大学实验动物中心提供遥
员郾 圆摇 方法
员郾 圆郾 员摇 半抗原制备及鉴定 摇 称取 阅蚤匀栽 缘皂早 和琥珀
酸酐 员远郾 源皂早袁溶于 缘皂造 无水吡啶中遥 远园益加热袁搅拌袁
回流 员园澡遥 反应结束后袁向溶液中加入 员园皂造 二氯甲
烷袁收集下层混合物袁然后用 员园皂造 缘豫 渊增 辕 增冤盐酸冲洗
猿 次袁弃掉二氯甲烷层袁残留物用 员园皂造 乙醚溶解袁用
员园皂造去离子水洗 猿 次袁乙醚层用无水硫酸镁干燥袁真
空抽滤袁经硅胶柱层析纯化袁乙醚全部挥发后重结晶得
匀葬责贼藻灶袁即 阅蚤匀栽鄄悦韵韵匀遥 在反应过程中采用薄层色谱
渊栽蕴悦冤进行跟踪袁并对产物用核磁共振图谱渊匀鄄晕酝砸冤
进行鉴定遥 确定摩尔比后袁进行倍数放大试验袁收集多
次试验产物袁即半抗原遥
员郾 圆郾 圆摇 阅蚤匀栽人工抗原的合成摇 采用混合酸酐法与活
化酯法分别将半抗原 阅蚤匀栽 与载体蛋白 月杂粤尧韵灾粤 进
行偶联遥
员郾 圆郾 圆郾 员摇 混合酸酐制备人工抗原 阅蚤匀栽鄄悦韵韵匀鄄月杂粤摇
称取 阅蚤匀栽鄄悦韵韵匀 粉末 远郾 远愿皂早 溶于 猿皂造 无水 阅酝云
圆员缘
摇 猿 期 食品辐照标志物 阅蚤匀栽的人工抗原合成及鉴定
中袁振荡搅拌袁加入 源园滋造三正丁胺袁冰浴下加入氯甲酸
异丁酯 源园滋造袁源益搅拌反应 员澡袁后升至室温 员澡袁将此称
为反应液 员遥 称取 员圆园皂早 月杂粤 溶于 员圆皂造 园郾 圆皂燥造 辕 蕴 硼
酸盐缓冲液渊责匀愿郾 苑冤中袁此为溶液 圆遥 将反应液 员 于室
温搅拌下逐滴加入到溶液 圆 中袁员缘益下搅拌过夜遥 混
合液 源益蒸馏水搅拌透析袁源澡 换水 员 次袁共换 远 次袁直
到透析液中测不出半抗原紫外吸收为止袁冷冻干燥袁得
阅蚤匀栽鄄悦韵韵匀鄄月杂粤袁分装备用遥
员郾 圆郾 圆郾 圆摇 活化酯法制备包被原 阅蚤匀栽鄄悦韵韵匀鄄韵灾粤摇
称取 阅蚤匀栽鄄悦韵韵匀粉末 远郾 远愿皂早 溶于 造皂造无水 阅酝云中袁
然后将 愿园皂早 阅悦悦 加热溶解于 猿皂造 无水 阅酝云 中遥 将
阅悦悦 溶解冷却至室温加到 酝月悦 溶液中袁加入 圆愿皂早
晕匀杂袁室温下搅拌反应 缘澡遥 然后置 源益冰箱中密闭静
置 圆澡 以上袁离心取上清液袁称为反应液 圆遥 称取 韵灾粤
源园皂早袁分别溶于 源皂造尧园郾 园缘皂燥造 辕 蕴尧责匀愿郾 园 的 孕月 中遥 将
反应液 圆 搅拌加入至蛋白溶液中袁然后逐渐升至室温
搅拌反应 造澡袁于 源益下缓慢搅拌反应过夜遥 次日袁将反
应液分别装入透析袋内袁于 园郾 园员皂燥造 辕 蕴尧责匀苑郾 源 的 孕月杂
和 源益条件下透析袁每 远澡换 员 次透析液袁共换 远 次袁直
至透析液中检不出半抗原紫外吸收为止袁得 阅蚤匀栽鄄
悦韵韵匀鄄韵灾粤溶液袁分装于冻存管中袁 原 圆园益冻存遥
员郾 圆郾 圆郾 猿摇 人工抗原的鉴定摇 人工抗原的鉴定主要通
过 哉灾 紫外扫描及 杂阅杂鄄孕粤郧耘 凝胶电泳 圆 种方法进
行遥
渊员冤 紫外扫描鉴定院将人工抗原和 月杂粤 稀释至适
当浓度袁在波长 员怨园 耀 源园园灶皂 范围内进行扫描袁获得半
抗原的紫外光谱遥
渊圆冤 杂阅杂鄄孕粤郧耘 凝胶电泳鉴定院选择浓缩胶浓度
为 缘豫 袁分离胶浓度为 员圆豫 袁浓缩胶电压为 员圆园灾袁分离
胶电压为 远园灾袁上样量分别为 圆园滋造 和 源园滋造袁采用考马
斯亮蓝染色袁脱色后用紫外凝胶成像系统照相观察遥
员郾 圆郾 猿摇 人工抗原偶联比的测定摇 根据朗伯 原比尔定
律袁波长一定时袁混合物的紫外吸收具有加合性遥 采用
全长紫外分光光度计对半抗原尧载体蛋白及偶联物进
行扫描袁根据吸收峰确定偶联是否成功咱员苑暂 遥 结合比计
算公式如下院
结合比 越 着糟燥灶躁怎早葬贼藻 原 着责则燥贼藻蚤灶着澡葬责贼藻灶 越渊韵阅糟燥灶躁怎早葬贼藻 原 韵阅责则燥贼藻蚤灶冤 伊 悦澡葬责贼藻灶 伊 酝责则燥贼藻蚤灶韵阅澡葬责贼藻灶 伊 酝澡葬责贼藻灶 伊 悦责则燥贼藻蚤灶摇 摇 其中院韵阅糟燥灶躁怎早葬贼藻为偶联物吸光值曰韵阅责则燥贼藻蚤灶为蛋白质
吸光值曰韵阅澡葬责贼藻灶为半抗原吸光值曰悦澡葬责贼藻灶为半抗原浓度曰
悦责则燥贼藻蚤灶为蛋白质浓度曰酝责则燥贼藻蚤灶为蛋白质分子量曰酝澡葬责贼藻灶为
抗原分子量遥
员郾 圆郾 源摇 多抗血清的制备 摇 将 阅蚤匀栽鄄悦韵韵匀鄄月杂粤 用生
理盐水稀释袁加入等量弗氏完全佐剂充分混匀乳化袁于
月粤蕴月 辕 糟小鼠背部皮下多点注射袁初次免疫剂量为
员园园滋早 辕只袁以后每间隔 圆 周将弗氏完全佐剂换成弗氏
不完全佐剂同法进行加强免疫袁免疫剂量逐步少量增
加遥 从第 源 次起袁每次免疫后 员 周断尾取血袁血清于
源益放置过夜袁缘园园园则 辕 皂蚤灶 离心 员缘皂蚤灶袁弃沉淀袁上层血
清置于 源益冰箱中备用咱员愿暂 袁使用时按 员颐 员园园 稀释遥
员郾 圆郾 缘摇 间接非竞争 耘蕴陨杂粤 法测定抗血清效价 摇 以
阅蚤匀栽鄄悦韵韵匀鄄韵灾粤作为包被原袁将 阅蚤匀栽鄄悦韵韵匀鄄月杂粤 抗
血清倍比稀释袁采用间接非竞争 耘蕴陨杂粤 法对抗血清进
行检测袁反应后于 源缘园灶皂波长下测定 韵阅 值袁每孔测 源
次袁取平均值遥
多克隆抗体对半抗原的抑制率通过间接竞争
耘蕴陨杂粤渊悦陨鄄耘蕴陨杂粤冤进行测定遥 按照最佳抗原抗体工作
浓度和优化条件进行袁将半抗原用 孕月杂栽渊园郾 园员皂燥造 辕 蕴
孕月杂袁 责匀苑郾 源袁含 园郾 园缘豫 栽憎藻藻灶鄄圆园冤配制浓度分别为
员缘远郾 圆缘尧猿员圆郾 缘尧远圆缘尧员圆缘园尧圆缘园园尧缘园园园尧员园园园园灶早 辕 皂造 的标
准溶液袁建立竞争抑制曲线袁并计算 陨悦缘园遥
圆摇 结果与分析
圆郾 员摇 半抗原的制备与鉴定
将标品 阅蚤匀栽经 员郾 圆郾 员 合成路线反应后得到结晶
固体袁将 阅蚤匀栽和得到结晶固体溶液进行 栽蕴悦 检测袁展
开剂为甲醇颐二氯甲烷颐乙酸 越 员颐 怨颐 园郾 员 渊灾 辕 灾 辕 灾冤袁结
果如图 圆袁得到白色固体的荧光点明显区别于原料点袁
计算白色固体 砸 枣 越 园郾 源愿袁初步说明得到白色固体为目
标产物 匀葬责贼藻灶袁但还需合成进一步验证遥
图 圆摇 匀葬责贼藻灶 栽蕴悦检测结果
云蚤早援 圆摇 栽蕴悦 泽责藻糟贼则怎皂 燥枣 匀葬责贼藻灶
粤院二氢脱氧胸腺嘧啶曰月院半抗原
粤院阅蚤匀栽曰 月院 匀葬责贼藻灶
猿员缘
核摇 农摇 学摇 报 圆远 卷
圆郾 圆摇 阅蚤匀栽鄄悦韵韵匀半抗原的核磁共振波谱鉴定
由核磁共振检测结果可知袁 渊员匀晕酝砸冤 渊 阅酝杂韵鄄
凿远冤院啄责责皂 员员郾 园缘远渊 泽袁 员匀袁要悦韵韵匀冤袁怨郾 愿远园 渊 泽袁 匀袁猿鄄
晕匀冤袁缘郾 愿园猿 渊 泽袁 匀袁 晕要悦要匀冤袁源郾 苑猿苑 渊 泽袁匀袁要韵匀冤袁
源郾 圆园苑渊泽袁圆匀袁要悦匀圆冤袁猿郾 缘远远渊泽袁匀袁匀鄄猿忆冤袁猿郾 圆圆怨渊泽袁匀袁匀鄄源忆冤袁猿郾 源园怨渊 贼袁圆匀袁要悦匀圆冤袁圆郾 苑园远 耀 圆郾 苑愿园渊 贼袁圆匀袁要悦匀圆冤袁圆郾 园远怨渊泽袁匀袁缘鄄匀冤袁圆郾 圆圆愿渊 泽袁圆匀袁要悦匀圆冤袁员郾 圆源圆渊皂袁猿匀袁缘鄄悦匀猿 冤袁但 苑郾 圆怨愿 耀 苑郾 猿怨远 出现了杂峰袁这可
能是由于过柱纯化未完全袁但目标基团羧基的吸收峰
已经出现袁证明产物就是半抗原袁可以进行人工抗原的
偶联制备遥
圆郾 猿摇 人工抗原的鉴定
圆郾 猿郾 员 摇 哉灾 鉴定 摇 月杂粤尧 韵灾粤尧 阅蚤匀栽鄄悦韵韵匀尧 阅蚤匀栽鄄
悦韵韵匀鄄月杂粤和 阅蚤匀栽鄄悦韵韵匀鄄韵灾粤 缘 个样品经紫外分光
光度计扫描袁结果如图 猿尧图 源 所示袁月杂粤 和 韵灾粤 分别
在 圆苑愿灶皂 和 圆苑怨灶皂 波长处有最大吸收峰袁 阅蚤匀栽鄄
悦韵韵匀鄄月杂粤和 阅蚤匀栽鄄悦韵韵匀鄄韵灾粤的最大吸收峰分别在
圆远园灶皂和 圆愿苑灶皂波长处遥 根据 哉灾吸收的合加性原理
可知袁整合后的特征峰与半抗原和载体没有重合袁出现
了偏移袁且根据朗伯 原比尔定律计算 阅蚤匀栽鄄悦韵韵匀 与
月杂粤和 韵灾粤的偶合比分别为 怨郾 愿颐 员和 员圆颐 员袁一般认为
偶联比在 缘 颐 员 耀 猿园 颐 员范围内能产生较好的特异性抗
体咱员怨暂 袁故本研究所获得的偶联比说明半抗原已分别与
载体 月杂粤和 韵灾粤偶联成功遥
图 猿摇 半抗原尧月杂粤及免疫抗原偶
联物的紫外吸收光谱
云蚤早援 猿摇 哉造贼则葬增蚤燥造藻贼 泽责藻糟贼则怎皂 燥枣 贼澡藻 匀葬责贼藻灶尧
匀葬责贼藻灶鄄月杂粤尧月杂粤
圆郾 猿郾 圆摇 杂阅杂鄄孕粤郧耘凝胶电泳摇 对 阅蚤匀栽鄄悦韵韵匀鄄月杂粤 偶
联物进行 杂阅杂鄄孕粤郧耘 鉴定袁图 缘 显示合成的人工抗原
阅蚤匀栽鄄悦韵韵匀鄄月杂粤条带的迁移率比其 月杂粤 的迁移率略
小袁表明人工抗原的分子质量比其相应载体的分子质
量增大遥 分析认为袁这是由于载体连接上一定数目的
图 源摇 半抗原尧韵灾粤及包被原
偶联物的紫外吸收光谱
云蚤早援 源摇 哉造贼则葬增蚤燥造藻贼 泽责藻糟贼则怎皂 燥枣 贼澡藻 匀葬责贼藻灶尧
韵灾粤尧匀葬责贼藻灶鄄韵灾粤
半抗原袁该结果表明 阅蚤匀栽鄄悦韵韵匀 已经与 月杂粤 成功偶
联咱员苑暂 遥 图 缘 中 源 和 缘 条带的合成抗原在相应位置均
出现了不同程度的拖带现象袁可能是由载体蛋白质和
小分子物质结合的分子数目不一致引起的遥 紫外扫描
法计算出的只是每个载体蛋白质结合的小分子的平均
数目袁杂阅杂鄄孕粤郧耘 结果则对载体与半抗原相连接时的
随机性和不均等性有更真实的反应遥
图 缘摇 阅蚤匀栽鄄悦韵韵匀鄄月杂粤偶联物的
杂阅杂鄄孕粤郧耘电泳鉴定
云蚤早援 缘摇 陨凿藻灶贼蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣 阅蚤匀栽鄄悦韵韵匀鄄月杂粤
糟燥灶躁怎早葬贼蚤燥灶 遭赠 杂阅杂鄄孕粤郧耘
员院蛋白质 皂葬则噪藻则曰圆院圆园滋造 月杂粤标准物院猿院源园滋造 月杂粤 标准
物曰源院圆园滋造 合成物 阅蚤匀栽鄄悦韵韵匀鄄月杂粤曰缘院源园滋造 合成物
摇 摇 阅蚤匀栽鄄悦韵韵匀鄄月杂粤
员院责则燥贼藻蚤灶 皂葬则噪藻则曰 圆院 圆园滋造 月杂粤 泽贼葬灶凿葬则凿 泽怎遭泽贼葬灶糟藻曰 猿院
源园滋造 月杂粤 泽贼葬灶凿葬则凿 泽怎遭泽贼葬灶糟藻曰 源院 圆园滋造 阅蚤匀栽鄄悦韵韵匀鄄月杂粤
摇 泽赠灶贼澡藻贼蚤糟曰 缘院 源园滋造 阅蚤匀栽鄄悦韵韵匀鄄月杂粤 泽赠灶贼澡藻贼蚤糟
圆郾 源摇 多克隆抗体效价的测定
免疫后小鼠血清效价经间接非竞争 耘蕴陨杂粤 检测袁
源员缘
摇 猿 期 食品辐照标志物 阅蚤匀栽的人工抗原合成及鉴定
结果如表 员 所示袁小鼠均能产生较高效价的阳性抗血
清袁其中小鼠 员尧猿 号血清抗体效价均达到 员颐 员园源袁圆 号
小鼠抗体效价稍低袁但也可达到 员颐 远郾 源 伊 员园猿遥 此结果
表明合成的人工抗原 匀葬责贼藻灶鄄月杂粤 可很好地刺激动物
产生抗体袁但由于动物个体的差异袁各个小鼠产生的效
价略有不同遥
表 员摇 抗 阅蚤匀栽鄄悦韵韵匀鄄月杂粤血清效价
栽葬遭造藻 员摇 栽蚤贼则藻泽 燥枣 葬灶贼蚤鄄泽藻则葬 葬早葬蚤灶泽贼 阅蚤匀栽
小鼠
皂蚤糟藻
抗血清稀释倍数 凿蚤造怎贼蚤燥灶 则葬贼蚤燥 燥枣 葬灶贼蚤泽藻则怎皂
源园园 愿园园 员远园园 猿圆园园 远源园园 员圆愿园园 圆缘远园园
空白
糟燥灶贼则燥造 早则燥怎责
阴性
灶藻早葬贼蚤增藻 早则燥怎责
员裕 圆郾 远怨缘 员郾 猿苑缘 园郾 怨员缘 园郾 猿苑缘 园郾 圆缘圆 园郾 员缘圆 园郾 园怨远 园郾 园缘源 园郾 园远猿
圆裕 员郾 远圆猿 园郾 怨猿猿 园郾 缘缘缘 园郾 猿圆缘 园郾 员愿远 园郾 员圆猿 园郾 园怨圆 园郾 园缘源 园郾 园远苑
猿裕 圆郾 苑圆员 圆郾 圆源远 员郾 圆苑缘 园郾 远怨圆 园郾 源缘源 园郾 圆苑缘 园郾 员缘缘 园郾 园远员 园郾 园远远
圆郾 缘摇 抗体亲和力测定
选择效价较高的 猿 号小鼠的抗血清进行亲和性鉴
定遥 由图 远 可知袁抑制率与 阅蚤匀栽 的浓度呈明显的线
性关系袁表明 阅蚤匀栽在 员缘远郾 圆缘 耀 员园园园园灶早 辕 皂造范围内袁能
与包被原竞争性地结合血清中的抗体袁抑制了抗体与
包被原的结合遥 将其 韵阅源缘园值转化为 月 辕 月园再对 蕴早咱阅蚤匀栽 辕 员园园暂进行回归分析袁小鼠多抗血清标准抑制曲
线的线性回归方程为 赠 越 原 园郾 圆猿园园曾 垣 园郾 缘远缘员袁相关系
数 砸圆 越 园郾 怨怨园缘袁根据回归方程计算多抗血清对 阅蚤匀栽
的 陨悦缘园为 员怨员郾 愿远远怨灶早 辕 皂造袁表明所获 阅蚤匀栽 抗血清对半
抗原具有较高的亲和性遥
图 远摇 阅蚤匀栽抗血清的竞争抑制曲线
云蚤早援 远摇 悦燥皂责藻贼蚤贼蚤增藻 蚤灶澡蚤遭蚤贼蚤燥灶 糟怎则增藻泽
燥枣 葬灶贼蚤泽藻则怎皂 燥枣 阅蚤匀栽
猿摇 讨论
阅蚤匀栽是一种小分子袁相对分子量为 圆源源郾 圆源袁为半
抗原袁无法为免疫 栽 细胞提供识别位点袁不具备免疫
原性袁所以在制备人工抗原前袁首先要对其半抗原进行
设计袁因 阅蚤匀栽是末端有要韵匀 基团的核苷类袁为突出
待测物分子的特征结构袁半抗原设计时常在特征结构
和载体蛋白之间引入一定长度的连接分子袁即连接臂遥
预试验中尝试了 圆 种方法修饰连接臂袁既高碘酸盐氧
化法和琥珀酸酐法袁前者主要通过氧化核苷上的邻二
醇为醛基袁利用醛基和蛋白偶联遥 但制备过程复杂袁副
产物较多袁而且硼氧化还原可破坏半抗原结构袁影响活
性遥 用琥珀酸酐法对 阅蚤匀栽 的末端羟基修饰袁在过程
中采用 栽蕴悦及 晕酝砸进行表征袁操作过程简单袁效果较
好袁可达到试验要求遥 高效抗原的制备是得到高亲和
力抗体的重要前提袁在半抗原偶联人工免疫抗原的载
体蛋白选择上袁有兔血清蛋白 渊 砸杂粤冤尧人血清蛋白
渊匀杂粤冤尧甲状腺球蛋白渊栽郧冤等遥 蛋白载体的选择通常
与被免疫的动物具有异源性袁这样动物机体产生的免
疫应答较强袁从而容易获得高效价抗体遥 但也有人认
为自身蛋白也可作为载体袁免疫效果优于异源蛋
白咱圆员暂 遥 本试验中选用 月杂粤 作为免疫抗原的载体蛋
白袁韵灾粤作为包被抗原的载体蛋白遥 这 圆 种蛋白是人
工抗原合成中比较常用的蛋白载体袁其物理化学性质
稳定袁且含有较高赖氨酸含量和自由氨基基团咱圆圆暂 遥 动
物免疫试验结果显示袁免疫的剂量尧次数袁佐剂的选择
均会对免疫结果产生影响遥 第一次免疫剂量为
员缘园滋早 辕只袁采用尾静脉注射免疫袁结果小鼠免疫后出
现严重的副反应袁后方案调整为背部皮下多点注射袁免
疫剂量降低至 员园园滋早 辕只袁结果表明免疫效果较好袁成
功获得了高效价尧特异性较好的多抗血清袁为以后进一
步研制 耘蕴陨杂粤检测辐照食品试剂盒奠定了基础遥
源摇 结论
本研究通过混合酸酐法尧活化酯法使半抗原与蛋
白质偶联制备了人工抗原 阅蚤匀栽鄄悦韵韵匀鄄月杂粤 和包被原
阅蚤匀栽鄄悦韵韵匀鄄韵灾粤袁并采用 哉灾 紫外光谱鉴定和 杂阅杂鄄
孕粤郧耘 方法进行人工抗原的鉴定遥 阅蚤匀栽鄄悦韵韵匀鄄月杂粤
和 阅蚤匀栽鄄悦韵韵匀鄄韵灾粤 的最大吸收峰分别在 圆远园灶皂 和
缘员缘
允燥怎则灶葬造 燥枣 晕怎糟造藻葬则 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 杂糟蚤藻灶糟藻泽
圆园员圆袁圆远渊猿冤院园缘员员 耀 园缘员远
圆愿苑灶皂波长处袁合成的人工抗原特征峰与半抗原和载
体没有重合袁偶联比在 缘颐 员 耀 猿园颐 员之间袁符合小分子免
疫要求遥
参考文献院
咱 员 暂 摇 施培新援食品辐照加工原理与技术咱酝暂援 北京院中国农业科学技
术出版社袁圆园园源院员 原 圆
咱 圆 暂 摇 陈殿华援 中国辐照食品的产业化发展咱 允暂 援 核农学报袁圆园园源郾 员源
渊愿圆冤院愿员 原 愿愿
咱 猿 暂 摇 蕴怎糟噪皂葬灶 郧 允援 云燥燥凿 蚤则则葬凿蚤葬贼蚤燥灶院 则藻早怎造葬贼燥则赠 葬泽责藻糟贼泽 蚤灶 贼澡藻 粤泽蚤葬 葬灶凿
孕葬糟蚤枣蚤糟 则藻早蚤燥灶咱允暂 援 砸葬凿蚤葬贼蚤燥灶 孕澡赠泽蚤糟泽 葬灶凿 悦澡藻皂蚤泽贼则赠袁圆园园圆袁远猿院圆愿缘
原 圆愿愿
咱 源 暂 摇 运蚤皂 酝袁 酝燥则藻澡燥怎泽藻援 云燥燥凿 蚤则则葬凿蚤葬贼蚤燥灶鄄哉杂 则藻早怎造葬贼燥则赠 糟燥灶泽蚤凿藻则葬贼蚤燥灶泽
咱允暂 援 砸葬凿蚤葬贼蚤燥灶 孕澡赠泽蚤糟泽 葬灶凿 悦澡藻皂蚤泽贼则赠袁圆园园圆袁远猿院圆愿员 原 圆愿源
咱 缘 暂 摇 酝葬则糟 云 阅藻泽则燥泽蚤藻则泽援 悦怎则则藻灶贼 泽贼葬贼怎泽 燥枣 贼澡藻 耘孕砸 皂藻贼澡燥凿 贼燥 凿藻贼藻糟贼
蚤则则葬凿蚤葬贼藻凿 枣燥燥凿咱允暂 援 粤责责造蚤藻凿 砸葬凿蚤葬贼蚤燥灶 葬灶凿 蚤泽燥贼燥责藻泽袁员怨怨远袁源苑院员远圆员
原 员远圆愿
咱 远 暂 摇 砸蚤糟葬则凿燥 粤援 酝燥造蚤灶泽援 阅藻贼藻糟贼蚤燥灶 皂藻贼澡燥凿泽 枣燥则 蚤则则葬凿蚤葬贼藻凿 枣燥燥凿泽咱 允暂 援 云燥燥凿
陨则则葬凿蚤葬贼蚤燥灶袁圆园园员袁员源院猿源苑 原 猿远猿
咱 苑 暂 摇 月燥则凿 砸 允袁 韵爷 悦燥灶灶燥则 砸 耘援 宰澡燥 憎葬灶贼泽 蚤则则葬凿蚤葬贼藻凿 枣燥燥凿钥 哉灶贼葬灶早造蚤灶早
糟燥皂责造藻曾 责怎遭造蚤糟 燥责蚤灶蚤燥灶咱允暂 援 云燥燥凿 栽藻糟澡灶燥造燥早赠袁员怨愿怨袁源猿院愿苑 原 怨园
咱 愿 暂 摇 匀藻灶藻则赠 阅藻造蚤灶糟藻援 阅藻贼藻糟贼蚤燥灶 皂藻贼澡燥凿泽 枣燥则 蚤则则葬凿蚤葬贼藻凿 枣燥燥凿泽 葬灶鄄燥增藻则增蚤藻憎
咱允暂 援 砸葬凿蚤葬贼蚤燥灶 孕澡赠泽蚤糟泽 葬灶凿 悦澡藻皂蚤泽贼则赠袁 圆园园圆袁 远猿院源缘缘 原 源缘愿
咱 怨 暂 摇 匀怎皂遭藻则贼燥 悦藻则凿葬援 阅藻贼藻糟贼蚤燥灶 燥枣 蚤则则葬凿蚤葬贼藻凿 枣则燥扎藻灶 枣燥燥凿 憎蚤贼澡 贼澡藻 阅晕粤
糟燥皂藻贼 葬泽泽葬赠院 蚤灶贼藻则造葬遭燥则葬贼燥则赠 贼藻泽贼咱 允暂 援 允燥怎则灶葬造 燥枣 贼澡藻 杂糟蚤藻灶糟藻 燥枣 云燥燥凿
葬灶凿 粤早则蚤糟怎造贼怎则藻袁苑远袁猿院源猿缘 原 源源圆
咱员园暂摇 悦葬则皂藻灶 月葬则遭葬袁 悦葬造增燥 酝 酝袁 匀藻则则葬蚤扎 酝援 阅藻贼藻糟贼蚤燥灶 燥枣 则葬凿蚤燥造赠贼蚤糟
澡赠凿则燥糟葬则遭燥灶泽 遭赠 泽怎责藻则糟则蚤贼蚤糟葬造 枣造怎蚤凿 藻曾贼则葬糟贼蚤燥灶 葬灶凿 早葬泽
糟澡则燥皂葬贼燥早则葬责澡蚤糟鄄皂葬泽泽 泽责藻糟贼则燥皂藻贼则蚤糟 葬灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 蚤则则葬凿蚤葬贼藻凿 糟澡藻藻泽藻
咱允暂 援 云燥燥凿 悦澡藻皂蚤泽贼则赠袁 圆园园怨袁 员员源渊源冤院 员缘员苑 原 员缘圆圆
咱员员暂摇 匀藻灶藻则赠 阅藻造蚤灶糟藻援 阅藻贼藻糟贼蚤燥灶 皂藻贼澡燥凿泽 枣燥则 蚤则则葬凿蚤葬贼藻凿 枣燥燥凿泽 葬灶鄄燥增藻则增蚤藻憎
咱允暂 援 砸葬凿蚤葬贼蚤燥灶 孕澡赠泽蚤糟泽 葬灶凿 悦澡藻皂蚤泽贼则赠袁 员怨怨远袁 源愿渊猿冤院 猿苑愿 原 猿苑怨
咱员圆暂摇 商博东袁王栩冬袁张摇 维袁朱韦静援 酶联免疫吸附法在食品安全
分析中的应用咱 允暂 援 中国卫生检验杂志袁圆园园缘袁员缘 渊员员冤院员源园远 原
员源园愿
咱员猿暂摇 悦澡则蚤泽贼燥责澡藻则 栽 耘造造蚤燥贼贼袁 蕴赠灶灶藻 匀葬皂蚤造贼燥灶援 阅藻贼藻糟贼蚤燥灶 燥枣 陨则则葬凿蚤葬贼藻凿
悦澡蚤糟噪藻灶 酝藻葬贼 遭赠 粤灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 蕴蚤责蚤凿 耘曾贼则葬糟贼泽 枣燥则 圆鄄杂怎遭泽贼蚤贼怎贼藻凿
悦赠糟造燥遭怎贼葬灶燥灶藻泽 哉泽蚤灶早 葬灶 耘灶扎赠皂藻 蕴蚤灶噪藻凿 陨皂皂怎灶燥泽燥则遭藻灶贼 咱 允 暂 援
粤灶葬造赠泽贼袁 员怨怨缘袁 员圆园院圆猿猿苑 原 圆猿源员
咱员源暂摇 蕴赠灶灶藻 匀葬皂蚤造贼燥灶袁 匀蚤造葬则赠 杂贼藻增藻灶泽燥灶 酝袁 阅藻则藻噪 砸援 月燥赠凿援 阅藻贼藻糟贼蚤燥灶 燥枣
圆鄄泽怎遭泽贼蚤贼怎贼藻凿 糟赠糟造燥遭怎贼葬灶藻泽 葬泽 蚤则则葬凿蚤葬贼蚤燥灶 责则燥凿怎糟贼泽 燥枣 造蚤责蚤凿鄄糟燥灶贼葬蚤灶蚤灶早
枣燥燥凿泽院 泽赠灶贼澡藻泽蚤泽 葬灶凿 葬责责造蚤糟葬贼蚤燥灶泽 燥枣 糟蚤泽鄄 葬灶凿 贼则葬灶泽鄄圆鄄渊 贼藻贼则葬凿藻糟鄄缘忆鄄
藻灶赠造冤 糟赠糟造燥遭怎贼葬灶燥灶藻泽 葬灶凿 员员鄄渊 圆忆鄄燥曾燥糟赠糟造燥遭怎贼赠造 冤 怎灶凿藻糟葬灶燥蚤糟 葬糟蚤凿
咱允暂 援 允 悦澡藻皂 杂燥糟 孕藻则噪蚤灶 栽则葬灶泽袁 员怨怨远袁 渊员冤院员猿怨 原 员源远
咱员缘暂摇 粤灶灶藻 蕴 栽赠则藻皂葬灶袁 郧则葬澡葬皂 粤 月燥灶憎蚤糟噪袁 悦澡则蚤泽贼燥责澡藻则 允 杂皂蚤贼澡援
阅藻贼藻糟贼蚤燥灶 燥枣 蚤则则葬凿蚤葬贼藻凿 枣燥燥凿 遭赠 蚤皂皂怎灶燥葬泽泽葬赠鄄凿藻增藻造燥责皂藻灶贼 葬灶凿
燥责贼蚤皂蚤扎葬贼蚤燥灶 燥枣 葬灶 耘蕴陨杂粤 枣燥则 凿蚤澡赠凿则燥贼澡赠皂蚤凿蚤灶藻 蚤灶 蚤则则葬凿蚤葬贼藻凿 责则葬憎灶泽
咱允暂 援 陨灶贼藻则灶葬贼蚤燥灶葬造 允燥怎则灶葬造 燥枣 云燥燥凿 杂糟蚤藻灶糟藻驭栽藻糟澡灶燥造燥早赠袁 圆园园源袁猿怨院
缘猿猿 原 缘源园
咱员远暂摇 宰蚤造造蚤葬皂泽 允 匀 匀援 栽赠则藻皂葬灶袁粤 蕴援 陨皂皂怎灶燥造燥早蚤糟葬造 凿藻贼藻糟贼蚤燥灶 燥枣 皂燥凿蚤枣蚤藻凿
阅晕粤 遭葬泽藻泽 蚤灶 蚤则则葬凿蚤葬贼藻凿 枣燥燥凿咱 允暂 援 阅藻贼藻糟贼蚤燥灶 酝藻贼澡燥凿泽 枣燥则 陨则则葬凿蚤葬贼藻凿
云燥燥凿院悦怎则则藻灶贼 杂贼葬贼怎泽袁 员怨怨远院猿远苑 原 猿苑源
咱员苑暂摇 杨利国 援 酶免疫测定技术咱酝暂援 南京院南京大学出版社袁员怨怨愿院
圆缘远
咱员愿暂摇 允葬藻 运燥燥 蕴藻藻袁 运蚤 悦澡葬灶早 粤澡灶袁 韵藻藻 杂怎噪 孕葬则噪袁 杂澡蚤灶 再燥怎灶早 运葬灶早援
阅藻增藻造燥责皂藻灶贼 燥枣 葬灶 耘蕴陨杂粤 枣燥则 贼澡藻 凿藻贼藻糟贼蚤燥灶 燥枣 贼澡藻 则藻泽蚤凿怎藻泽 燥枣 贼澡藻
蚤灶泽藻糟贼蚤糟蚤凿藻 蚤皂蚤凿葬糟造燥责则蚤凿 蚤灶 葬早则蚤糟怎造贼怎则葬造 葬灶凿 藻灶增蚤则燥灶皂藻灶贼葬造 泽葬皂责造藻泽
咱允暂 援 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 葬灶凿 云燥燥凿 悦澡藻皂蚤泽贼则赠袁圆园园员袁源怨袁缘院圆员缘怨 原 圆员远苑
咱员怨暂摇 杂蚤灶早澡 运 灾袁 运葬怎则 允袁 灾葬则泽澡灶藻赠 郧 悦援 杂赠灶贼澡藻泽蚤泽 葬灶凿 糟澡葬则葬糟贼藻则蚤扎葬贼蚤燥灶 燥枣
澡葬责贼藻灶鄄责则燥贼藻蚤灶 糟燥灶躁怎早葬贼藻泽 枣燥则 葬灶贼蚤遭燥凿赠 责则燥凿怎糟贼蚤燥灶 葬早葬蚤灶泽贼 泽皂葬造造
皂燥造藻糟怎造藻泽咱允暂 援 月蚤燥糟燥灶躁怎早葬贼藻 悦澡藻皂袁 圆园园源袁员缘渊员冤院员远愿 原 员苑猿
咱圆园暂摇 洪孝庄援 蛋白质连接技术 咱酝暂援 北京院中国医药科技出版社袁
员怨怨猿院员 原 员苑
咱圆员暂摇 运燥灶藻灶憎葬蚤泽皂葬灶 杂袁 云蚤灶凿噪蚤灶 酝袁 悦燥澡藻灶 陨 砸援 杂藻造枣 葬灶凿 云燥则藻蚤早灶 匀杂孕远园 栽
糟藻造造 耘责蚤贼燥责藻 孕藻责贼蚤凿藻泽 杂藻则增藻 葬泽 陨皂皂怎灶燥早藻灶蚤糟 悦葬则则蚤藻则泽 枣燥则 葬 栽蚤灶凿
杂怎早葬则粤灶贼蚤早藻灶咱允暂 援 陨皂皂怎灶燥造燥早赠袁员怨怨缘袁员缘源院缘怨苑苑 原 缘怨愿缘
咱圆圆暂摇 栽燥灶早 阅藻憎藻灶袁 匀藻泽澡藻灶早 再葬灶早袁 宰葬灶早 允蚤灶赠蚤援 砸藻糟藻灶贼 葬凿增葬灶糟藻泽 蚤灶 贼澡藻
泽赠灶贼澡藻泽蚤泽 燥枣 葬则贼蚤枣蚤糟蚤葬造 葬灶贼蚤早藻灶 葬灶凿 蚤贼泽 葬责责造蚤糟葬贼蚤燥灶 蚤灶 贼澡藻 凿藻贼藻糟贼蚤燥灶 燥枣
责藻泽贼蚤糟蚤凿藻 则藻泽蚤凿怎藻 咱 允 暂 援 粤皂藻则蚤糟葬灶 允燥怎则灶葬造 燥枣 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 葬灶凿
月蚤燥造燥早蚤糟葬造 杂糟蚤藻灶糟藻袁 圆园园苑袁圆渊圆冤院 愿愿 原 怨猿
渊责任编辑摇 裴摇 颖冤
远员缘