全 文 ：核 农 学 报　 ２０１３ꎬ２７(６):０７６８ ~ ０７７４
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｒ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
收稿日期:２０１２￣０８￣２９　 接受日期:２０１３￣０１￣１６
基金项目:中国海洋石油总公司科技项目(ＣＮＯＯＣ￣ＫＪ １２５ ＺＤＸＭ ００ ０００ ００ ＮＦＣＹ ２０１１￣０４)
作者简介:王新新(１９８３￣)ꎬ男ꎬ山东德州人ꎬ博士ꎬ主要从事农业微生物学研究ꎮ Ｅ￣ｍａｉｌ: ｗａｎｇｘｘ２００８９９＠ １６３. ｃｏｍ
文章编号:１０００￣８５５１(２０１３)６￣０７６８￣０７
茎瘤固氮根瘤菌 Ａｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｃａｕｌｉｎｏｄａｎｓ
ＯＲＳ５７１ 基因组密码子使用偏好性分析
王新新１ꎬ２ 　 吴 亮２ 　 朱生凤３ 　 赵 林１ 　 安 伟２ 　 陈 宇１ꎬ２
( １ 天津大学环境科学与工程学院ꎬ天津　 ３０００７２ꎻ２ 中海石油环保服务有限公司ꎬ
天津　 ３００４５２ꎻ３ 中国海洋石油总公司ꎬ北京　 １０００１０)
摘　 要:目前对于自生固氮菌和共生固氮菌的密码子使用特征已有较深入的了解ꎬ然而对于既可以进行
自生固氮又可以共生固氮的固氮菌的认识仍十分有限ꎮ 本研究采用对应分析、相关分析和卡方检验等
方法对具有这一特征的茎瘤固氮根瘤菌 ＯＲＳ５７１ 基因组密码子进行分析ꎬ以期深入了解该类固氮菌密
码子使用特征ꎮ 以有效密码子数量(ＥＮＣ)和密码子第 ３ 位 ＧＣ含量(ＧＣ３ｓ)分别为 ｘ、ｙ轴绘制 ＥＮＣ￣ｐｌｏｔ
图谱ꎬ同时绘制描述仅受基因组碱基组成影响条件下的 ＥＮＣ和 ＧＣ３ｓ关系的期望曲线ꎮ 结果发现ꎬ部分
基因位于期望曲线上ꎬ说明该菌密码子偏好性受到了基因组碱基组成影响ꎮ 对应分析和相关分析表明ꎬ
包括固氮相关基因在内的全部基因在对应分析第 １ 向量轴上的坐标值均与密码子适应指数和 ＧＣ３ｓ 呈
显著负相关(Ｐ < ０􀆰 ０５)ꎬ说明该菌码子偏好性还受基因表达水平和 ＧＣ３ｓ 的影响ꎮ ２２ 个密码子的使用
频率在高表达基因中显著增多ꎬ确定为最优密码子ꎮ 其中 ２１ 个密码子以 Ｇ / Ｃ 结尾ꎬ说明最优密码子有
强烈的 ＧＣ３ｓ偏好ꎮ
关键词:对应分析ꎻ 相关分析ꎻ 卡方检验ꎻ 固氮ꎻ 最优密码子
　 　 大多数物种并不是均衡地使用每个密码子来编码
氨基酸ꎬ而是常常倾向于选择其中的一种或多种ꎬ表现
出密码子偏好性ꎮ 对于这一现象ꎬ目前“选择 －突变
平衡”假说给予了较好的解释[１]ꎮ 由于进化过程中选
择压力的存在ꎬ导致物种倾向于使用某些密码子ꎮ 然
而由于自然突变ꎬ基因组中也存在各种非最优密码子ꎮ
物种最终表现出的密码子使用特征就是这两种因素综
合作用的结果ꎮ 因此ꎬ密码子偏好性的研究有助于理
解物种的进化压力和自然突变的关系ꎬ从而揭示其在
特定生存环境下的进化特征[２ － ６]ꎮ 除此之外ꎬ对密码
子偏好性的深入分析还可获得最优密码子ꎬ可用于指
导外源基因的优化表达[７ － ８]ꎮ 因此ꎬ密码子偏好性分
析具有重要的理论意义和实践意义ꎬ目前已成为基因
组学的研究热点之一ꎮ
固氮菌通过固氮作用将空气中的氮气转化为植物
可吸收的氮素营养ꎬ对维持氮元素的生物地化循环和
生态系统稳定具有重要作用ꎬ一直是各国研究人员关
注的焦点ꎮ 对于棕色固氮菌(Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ)等
自生固氮菌以及弗兰克氏菌(Ｆｒａｎｋｉａ)、苜蓿中华根瘤
菌 ( Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ ) 和 大 豆 慢 生 根 瘤 菌
(Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ)等共生固氮菌的密码子使
用特征已有较深入的了解[９ － １２]ꎮ 然而对于既可以进
行自生固氮又可以共生固氮的固氮菌的认识仍十分有
限ꎮ 近些年来ꎬ具有这一特征的茎瘤固氮根瘤菌
(Ａｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｃａｕｌｉｎｏｄａｎｓ)ＯＲＳ５７１ 菌株已经完成基因
组测序ꎬ为了解其密码子使用特征提供了基础[１３ － １４]ꎮ
本研究采用多元统计分析、相关性分析和卡方检验等
方法对茎瘤固氮根瘤菌 ＯＲＳ５７１ 的密码子偏好性进行
分析ꎬ以期为该类固氮菌密码子使用特征的深入了解
提供理论基础和数据参考ꎮ
１　 材料与方法
１􀆰 １　 数据
茎瘤固氮根瘤菌 ＯＲＳ５７１ 的基因组序列来源于
ＮＣＢＩ 数 据 库 ( ｆｔｐ: / / ｆｔｐ. ｎｃｂｉ. ｎｉｈ. ｇｏｖ / ｇｅｎｏｍｅｓ /
８６７
　 ６ 期 茎瘤固氮根瘤菌 Ａｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｃａｕｌｉｎｏｄａｎｓ ＯＲＳ５７１ 基因组密码子使用偏好性分析
Ｂａｃｔｅｒｉａ / Ａｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ＿ ｃａｕｌｉｎｏｄａｎｓ ＿ ＯＲＳ ＿ ５７１ ＿
ｕｉｄ５８９０５)ꎬＧｅｎｂａｎｋ登录号为 ＮＣ＿００９９３７ꎮ 为了减少
长度较短的基因变异带来的误差ꎬ删除长度在 ３００ ｂｐ
以下的基因序列[１５ － １６]ꎬ剩余 ４４５２ 个基因用于分析密
码子使用特征ꎮ
１􀆰 ２　 同义密码子偏好性检测
基因的 Ｔ３ｓ、Ｃ３ｓ、Ａ３ｓ、Ｇ３ｓ 和 ＧＣ３ｓ 是密码子第 ３
位为 Ｔ、Ｃ、Ａ、Ｇ 和 ＧＣ 的比例ꎮ 最优密码子使用频率
(Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｏｆ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｏｄｏｎｓꎬＦＯＰ)是所使用的最优密
码子占总密码子数的比例ꎮ 有效密码子数量
(Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｃｏｄｏｎｓꎬＥＮＣ)用于反映密码子使
用偏离随机使用的程度ꎬ取值范围在 ２０ ~ ６１ 之间ꎬ取
值越低偏离程度越大ꎮ 采用 ＣｏｄｏｎＷ １􀆰 ４􀆰 ２ 软件计算
以上各参数(ｈｔｔｐ: / / ｃｏｄｏｎｗ. ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ. ｎｅｔ)ꎮ 密码子
适应指数(Ｃｏｄｏｎ ａｄａｐｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘꎬＣＡＩ)参照大肠杆菌
(Ｅ. ｃｏｌｉ)中已知高表达基因编写 Ｐｅｒｌ 程序进行计算ꎬ
用于衡量基因表达水平的高低ꎮ 首先从 Ｇｅｎｂａｎｋ中获
得 Ｅ. ｃｏｌｉ的 ２７ 个极端高表达基因序列[１７]ꎮ 采用 Ｂｌａｓｔ
２􀆰 ２􀆰 ２７ 软件将其与茎瘤固氮根瘤菌 ＯＲＳ５７１ 基因组进
行进行本地 Ｂｌａｓｔ比对ꎬ以 １０ － ６的 Ｅ值为阈值编写 Ｐｅｒｌ
程序获得该菌株中的高表达基因序列ꎬ以此为参考数
据集采用 ＤＡＭＢＥ ５􀆰 ３􀆰 ２ 软件计算各基因的 ＣＡＩ
值[１８]ꎮ 同义密码子相对使用度(Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｓｙｎｏｎｙｍｏｕｓ
ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅꎬＲＳＣＵ)是同义密码子实际观测值与平均
使用期望值的比值ꎬ采用 ＤＡＭＢＥ ５􀆰 ３􀆰 ２ 软件进行计
算[１９]ꎮ
１􀆰 ３　 ＥＮＣ￣ｐｌｏｔ绘图
以 ＧＣ３ｓ 为横坐标 ＥＮＣ 为纵坐标ꎬ绘制 ＥＮＣ￣ｐｌｏｔ
以检测密码子使用特征受基因组碱基组成影响的程
度ꎮ ＥＮＣ 的期望曲线按照公式 ＥＮＣ ＝ ２ ＋ ＧＣ３ｓ ＋
２９ / (ＧＣ３ｓ２ ＋ (１ － ＧＣ３ｓ) ２)进行计算[２０ － ２１]ꎮ 如果密
码子使用偏好性受基因组碱基组成影响较大ꎬ那么基
因分布在期望曲线上或其附近ꎬ否则离期望曲线较远ꎮ
１􀆰 ４　 对应分析和相关分析
采用 ＣｏｄｏｎＷ １􀆰 ４􀆰 ２ 软件对各基因的 ＲＳＣＵ 值进
行对应分析(Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓꎬＣＯＡ)ꎬ获得各基
因在 ５９ 维向量空间的分布情况ꎮ 采用 ＳＰＳＳ １３􀆰 ０ 软
件对各基因在对应分析结果第 １ 轴上的坐标值与
ＥＮＣ、ＣＡＩ、ＧＣ３ｓ、ＧＣ含量和基因长度进行 ｓｐｅａｒｍａｎ 相
关分析ꎮ
１􀆰 ５　 最优密码子分析
按照 ＣＡＩ 值对基因进行排序ꎬ选取两端各 ５％的
基因分别建立高低表达基因数据库ꎮ 采用 ＳＰＳＳ １３􀆰 ０
软件对其密码子使用的差异显著性进行卡方检验以获
得最优密码子[２２]ꎮ
２　 结果与分析
对茎瘤固氮根瘤菌 ＯＲＳ５７１ 基因组中 ４４５２ 条长
度大于等于 ３００ ｂｐ 的基因进行分析ꎬ结果发现其 ＧＣ
含量变化范围为 ４０􀆰 ３％ ~ ７７􀆰 ３％ ꎬ平均 ６７􀆰 ７％ ꎻ基因
长度变化范围为 ３００ ~ １６７５８ ｂｐꎬ平均 １０７１􀆰 １ ｂｐꎮ 进
一步对其密码子使用特征进行分析ꎬ结果发现其 Ｔ３ｓ
变化范围为 ２􀆰 ０％ ~ ３６􀆰 ９％ ꎬ平均 １１􀆰 １％ ꎻＣ３ｓ 变化范
围为 ２１􀆰 ７％ ~ ８１􀆰 ５％ ꎬ平均 ５７􀆰 ３％ ꎻＡ３ｓ 变化范围为
０％ ~５０􀆰 ９％ ꎬ平均 ５􀆰 ４％ ꎻＧ３ｓ 变化范围为 １６􀆰 ４％ ~
７０􀆰 ２％ ꎬ平均 ４４􀆰 ９％ ꎻ ＧＣ３ｓ 变化范围为 ３３􀆰 ５％ ~
９６􀆰 ３％ ꎬ平均 ８５􀆰 ７％ ꎻ ＦＯＰ 变化范围为 ３５􀆰 ６％ ~
７１􀆰 ３％ ꎬ平均 ５４􀆰 ６％ ꎻＥＮＣ变化范围为 ２４􀆰 ８ ~ ６１􀆰 ０ꎬ平
均 ３５􀆰 ２ꎻＣＡＩ变化范围为 ０􀆰 １８ ~ ０􀆰 ９０ꎬ平均 ０􀆰 ６６ꎮ
注:白色方框指示固氮相关基因ꎮ
Ｎｏｔｅ:Ｗｈｉｔｅ ｓｑｕａｒｅ ｉｎｄｉｃａｔｅｓ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｆｉｘａｔｉｏｎ￣ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅｓ.
图 １　 茎瘤固氮根瘤菌 ＯＲＳ５７１ 基因组
密码子的 ＥＮＣ值散点图
Ｆｉｇ. １　 ＥＮＣ￣ｐｌｏｔ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ ｏｆ
Ａｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｃａｕｌｉｎｏｄａｎｓ ＯＲＳ５７１ｇｅｎｏｍｅ
以各基因的 ＧＣ３ｓ 为横坐标 ＥＮＣ 为纵坐标ꎬ绘制
ＥＮＣ￣ｐｌｏｔꎬ结果如图 １ 所示ꎮ 仅有一部分基因分布在
期望曲线附近ꎬ说明这些基因密码子使用特征受基因
组碱基组成影响较大ꎮ ｐｔｓＮ、 ｎｉｆＸ、 ｎｉｆＮ、 ｎｉｆＥ、 ｎｉｆＫ、
ｎｉｆＤ、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＡ、ｇｌｎＡ、ｇｌｎＢ、ｎｔｒＢ / ｎｔｒＹ、 ｒｐｏＦ、ｎｔｒＸ、ｎｔｒＹ、
ｎｔｒＣ、ｎｔｒＢ、ｎｉｆＲ３、ｎｉｆＳ、ｎｉｆＢ、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＱ、ｎｉｆＷ、 ｆｉｘＡ、 ｆｉｘＢ、
ｆｉｘＣ、 ｒｐｏＮ、 ｃｙｔＮ / ｆｉｘＮ、 ｃｙｔＯ / ｆｉｘＯ、 ｃｙｔＰ / ｆｉｘＰ、 ｆｉｘＧ、 ｆｉｘＨ、
ｆｉｘＫ、ｆｉｘＬ和 ｆｉｘＪ等 ３４ 个固氮相关基因以及其他大部
分基因均分布在期望曲线右下侧ꎬ偏离了期望曲线ꎮ
对各基因同义密码子的 ＲＳＣＵ 值进行对应分析ꎬ
９６７
核　 农　 学　 报 ２７ 卷
获得各基因在 ５９ 维向量空间的分布情况ꎮ 各基因在
前 ２ 个向量轴上的分布如图 ２ 所示ꎮ 前 ２ 个向量轴解
释变量总方差的 ２０􀆰 ５％ ꎬ其中第 １ 向量轴解释
１５􀆰 ３％ ꎬ第 ２ 向量轴解释 ５􀆰 ３％ ꎮ 即使综合前 ４ 个向量
轴也仅解释变量总方差的 ２４􀆰 ５％ ꎬ说明影响该基因组
密码子偏好性的因素较多ꎮ 对各基因在第 １ 向量轴上
的坐标值与 ＥＮＣ、ＣＡＩ、ＧＣ３ｓ、ＧＣ和基因长度进行相关
分析ꎬ结果如表 １ 所示ꎮ 全部基因在第 １ 向量轴上的
坐标值与 ＥＮＣ(Ｒ ＝ ０􀆰 ８９０)、ＣＡＩ(Ｒ ＝ － ０􀆰 ８７１)、ＧＣ３ｓ
(Ｒ ＝ － ０􀆰 ８０７)和基因长度(Ｒ ＝ － ０􀆰 １４８)均呈显著负
相关(Ｐ < ０􀆰 ０５)ꎮ 固氮相关基因在第 １ 向量轴上的坐
标值与 ＥＮＣ(Ｒ ＝ ０􀆰 ８６９)、ＣＡＩ(Ｒ ＝ － ０􀆰 ８６２)、ＧＣ３ｓ(Ｒ
＝ － ０􀆰 ７４１)和基因 ＧＣ 含量(Ｒ ＝ ０􀆰 ４８８)均显著相关
(Ｐ < ０􀆰 ０５)ꎮ
对高低表达基因密码子使用的差异显著性进行卡
方检验ꎬ结果如表 ２ 所示ꎮ ２２ 个密码子的使用频率在
高表达基因中显著增多(Ｐ < ０􀆰 ０５)ꎮ 对最优密码子第
３ 位碱基分析发现ꎬ以 Ｃ 结尾的密码子有 １４ 个ꎬ占全
部最优密码子的 ６３􀆰 ６％ ꎻ以 Ｇ 结尾的密码子有 ７ 个ꎬ
占全部最优密码子的 ３１􀆰 ８％ ꎻ以 Ａ结尾的密码子仅有
１ 个ꎬ占全部最优密码子的 ４􀆰 ５％ ꎻ未发现以 Ｕ 结尾的
密码子ꎮ
注:白色方框指示固氮相关基因
Ｎｏｔｅ:Ｗｈｉｔｅ ｓｑｕａｒｅ ｉｎｄｉｃａｔｅｓ ｎｉｔｒｏｇｅｎｆｉｘａｔｉｏｎ￣ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅｓ
图 ２　 茎瘤固氮根瘤菌 ＯＲＳ５７１ 基因在
ＲＳＣＵ对应分析前 ２ 个轴上的分布
Ｆｉｇ. ２　 Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ Ａｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｃａｕｌｉｎｏｄａｎｓ ＯＲＳ５７１ ｇｅｎｅｓ
ｏｎ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｔｗｏ ａｘｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ＲＳＣＵ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ
表 １　 茎瘤固氮根瘤菌 ＯＲＳ５７１ 基因组密码子使用各参数之间的 Ｓｐｅａｒｍａｎ相关系数
Ｔａｂｌｅ １　 Ｓｐｅａｒｍａｎ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ ｏｆ Ａｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｃａｕｌｉｎｏｄａｎｓ ＯＲＳ５７１
有效密码子数量
ＥＮＣ
密码子适应指数
ＣＡＩ
密码子第 ３ 位 ＧＣ含量
ＧＣ３ｓ
ＧＣ含量
ＧＣ ｃｏｎｔｅｎｔ
基因长度
Ｇｅｎｅ ｌｅｎｇｔｈ
全部基因在第 １ 向量轴上的坐标值
Ｔｈｅ ｌｏａｄｉｎｇ ｏｆ ａｌｌ ｇｅｎｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ａｘｉｓ １ ｏｆ ＣＯＡ
０􀆰 ８９０∗ － ０􀆰 ８７１∗ － ０􀆰 ８０７∗ － ０􀆰 ０１７ － ０􀆰 １４８∗
固氮相关基因在第 １ 向量轴上的坐标值
Ｔｈｅ ｌｏａｄｉｎｇ ｏｆ ｎｉｔｒｏｇｅｎｆｉｘａｔｉｏｎ￣ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅｓ
ｏｎ ｔｈｅ ａｘｉｓ １ ｏｆ ＣＯＡ
０􀆰 ８６９∗ － ０􀆰 ８６２∗ － ０􀆰 ７４１∗ ０􀆰 ４８８∗ － ０􀆰 ０５４
　 　 注:∗表示显著相关(Ｐ < ０􀆰 ０５)ꎮ
Ｎｏｔｅ: ∗ Ｄｅｎｏｔｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ (Ｐ < ０􀆰 ０５) .
３　 讨论
以各基因的 ＧＣ３ｓ 和 ＥＮＣ 分别为 ｘ、 ｙ 轴绘制
ＥＮＣ￣ｐｌｏｔꎬ是一种研究密码子偏好性的有效手段[２０]ꎮ
当密码子偏好性不受选择压力ꎬ仅受基因组碱基组成
压力的时候ꎬ各基因 ＥＮＣ和 ＧＣ３ｓ的关系可用 ＥＮＣ ＝２
＋ ＧＣ３ｓ ＋ ２９ / (ＧＣ３ｓ２ ＋ (１ － ＧＣ３ｓ) ２)的公式来描
述ꎬ即 ＥＮＣ￣ｐｌｏｔ中的“期望曲线”ꎮ 也就是说ꎬ当基因
位于期望曲线上的时候ꎬ该基因密码子偏好性主要受
基因组碱基组成压力ꎻ而当基因偏离期望曲线的时候ꎬ
该基因密码子偏好性主要受其他因素的影响ꎮ 通过绘
制茎瘤固氮根瘤菌 ＯＲＳ５７１ 基因组的 ＥＮＣ￣ｐｌｏｔꎬ结果
发现:一部分基因位于期望曲线上ꎮ 这说明这些基因
密码子偏好性主要受基因组碱基组成影响ꎬ进一步说
明该菌密码子偏好性受到了基因组碱基组成的影响ꎮ
此外ꎬ还有相当一部分基因位于期望曲线下方ꎬ偏离了
期望曲线ꎬ说明还有其他因素影响了该菌的密码子偏
好性ꎮ 这与前人的研究结果相类似[１０ꎬ ２３]ꎮ 然而ꎬ该菌
大部分基因均位于期望曲线右下侧ꎬ这与其他物种的
基因分布并不一致ꎮ 侯卓成等[２３]发现肺炎链球菌
(Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ)的大部分基因位于期望曲
线左下侧ꎮ Ｎａｙａｋ等[１５]发现清酒乳杆菌(Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓａｋｅｉ)等 １４ 种乳杆菌的大部分基因位于期望曲线的左
侧或 中 部ꎮ Ｍｏｎｄａｌ 等[２４] 发 现 ５ 种 沙 门 氏 菌
(Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ)的大部分基因均位于期望曲线的中下部ꎮ
０７７
　 ６ 期 茎瘤固氮根瘤菌 Ａｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｃａｕｌｉｎｏｄａｎｓ ＯＲＳ５７１ 基因组密码子使用偏好性分析
　 　 　 　 　 表 ２　 茎瘤固氮根瘤菌 ＯＲＳ５７１ 高表达和低表达基因的密码子使用特征比较
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ ｏｆ ｈｉｇｈｌｙ ａｎｄ ｌｏｗｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ ｏｆ Ａｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｃａｕｌｉｎｏｄａｎｓ ＯＲＳ５７１
氨基酸
Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ
密码子
Ｃｏｄｏｎ
高表达基因
Ｈｉｇｈｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｇｅｎｅｓ
低表达基因
Ｌｏｗｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｇｅｎｅｓ
同义密码子
相对使用度
ＲＳＣＵ
数量
Ｎｕｍｂｅｒ
同义密码子
相对使用度
ＲＳＣＵ
数量
Ｎｕｍｂｅｒ
氨基酸
Ａｍｉｎｏ
ａｃｉｄ
密码子
Ｃｏｄｏｎ
高表达基因
Ｈｉｇｈｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｇｅｎｅｓ
低表达基因
Ｌｏｗｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｇｅｎｅｓ
同义密码子
相对使用度
ＲＳＣＵ
数量
Ｎｕｍｂｅｒ
同义密码子
相对使用度
ＲＳＣＵ
数量
Ｎｕｍｂｅｒ
Ａｌａ ＧＣＵ ０. １３２ ３３２ ０. ４７７ ９５５ Ｌｅｕ ＣＵＡ ０. ００９ １９ ０. ２０６ ２８０
ＧＣＧ １. ２６３ ３１７９ １. ４４４ ２８９３ ＣＵＣ∗ １. ８８３ ３８３１ １. ４１１ １９２２
ＧＣＣ∗ ２. ５６４ ６４５５ １. ５４６ ３０９８ ＣＵＧ∗ １. ９６３ ３９９３ １. ６７２ ２２７８
ＧＣＡ ０. ０４２ １０５ ０. ５３３ １０６９ ＣＵＵ ０. １４４ ２９３ ０. ７１２ ９７０
Ａｒｇ ＡＧＡ ０. ６５１ １４ ０. ７７３ ２４８ ＵＵＡ ０. ０１７ １ ０. ３８９ １５７
ＡＧＧ １. ３４９ ２９ １. ２２７ ３９４ ＵＵＧ １. ９８３ １１８ １. ６１１ ６５０
ＣＧＡ ０. ０２６ ３３ ０. ４０１ ４９８ Ｌｙｓ ＡＡＡ ０. ０３４ ７４ ０. ６７５ ５６４
ＣＧＣ∗ ３. ２００ ４００８ １. ８０２ ２２３６ ＡＡＧ∗ １. ９６６ ４２８７ １. ３２５ １１０７
ＣＧＧ ０. ３７０ ４６４ １. ２２８ １５２３ Ｍｅｔ ＡＵＧ １. ０００ ２３４０ １. ０００ １３９１
ＣＧＵ ０. ４０３ ５０５ ０. ５６８ ７０５ Ｐｈｅ ＵＵＵ ０. ０４１ ７１ ０. ６２１ ６７０
Ａｓｎ ＡＡＣ∗ １. ６１７ ２２４５ １. ０６２ ７４５ ＵＵＣ∗ １. ９５９ ３３８７ １. ３７９ １４８９
ＡＡＵ ０. ３８３ ５３１ ０. ９３８ ６５８ Ｐｒｏ ＣＣＡ ０. ０３０ ３１ ０. ５０９ ４８１
Ａｓｐ ＧＡＵ ０. ３６７ ９２４ ０. ９４８ １６４８ ＣＣＣ∗ １. ６３０ １６９０ １. ２０１ １１３５
ＧＡＣ∗ １. ６３３ ４１１４ １. ０５２ １８２８ ＣＣＵ ０. ０７２ ７５ ０. ５７５ ５４３
Ｃｙｓ ＵＧＵ ０. ０６３ ２１ ０. ４９２ １７５ ＣＣＧ∗ ２. ２６８ ２３５１ １. ７１５ １６２０
ＵＧＣ∗ １. ９３７ ６４４ １. ５０８ ５３７ Ｓｅｒ ＡＧＣ １. ９４５ ９６１ １. ５５５ ９５３
Ｇｌｎ ＣＡＡ ０. ０４３ ６１ ０. ４６２ ４４４ ＡＧＵ ０. ０５５ ２７ ０. ４４５ ２７３
ＣＡＧ∗ １. ９５７ ２７９７ １. ５３８ １４７９ ＵＣＡ ０. ０２７ ２４ ０. ５７６ ３５５
Ｇｌｕ ＧＡＧ∗ １. ４９６ ４２１１ １. １６０ １９９７ ＵＣＣ∗ ２. ２８５ ２０５８ １. ４２４ ８７８
ＧＡＡ ０. ５０４ １４１９ ０. ８４０ １４４６ ＵＣＧ∗ １. ６１１ １４５１ １. ４０６ ８６７
Ｇｌｙ ＧＧＵ ０. ２５１ ４９５ ０. ６２７ ８３６ ＵＣＵ ０. ０７８ ７０ ０. ５９５ ３６７
ＧＧＧ ０. １３２ ２６０ ０. ８８５ １１８０ Ｔｈｒ ＡＣＣ∗ ２. ８４８ ３６８５ １. ５３２ １１０９
ＧＧＣ∗ ３. ５８１ ７０６０ １. ８２３ ２４３２ ＡＣＡ ０. ０１９ ２５ ０. ５６０ ４０５
ＧＧＡ ０. ０３７ ７２ ０. ６６５ ８８７ ＡＣＧ １. ０８９ １４０９ １. ５６１ １１３０
Ｈｉｓ ＣＡＣ∗ １. ４９４ １１７８ １. ０５０ ７９１ ＡＣＵ ０. ０４３ ５６ ０. ３４７ ２５１
ＣＡＵ ０. ５０６ ３９９ ０. ９５０ ７１５ Ｔｒｐ ＵＧＧ １. ０００ ９０５ １. ０００ ８６１
Ｉｌｅ ＡＵＵ ０. １１４ １９９ ０. ７４９ ７２８ Ｔｙｒ ＵＡＣ∗ １. ０７０ １１５２ ０. ８６７ ５４０
ＡＵＡ ０. ００４ ７ ０. ４１２ ４００ ＵＡＵ ０. ９３０ １００１ １. １３３ ７０６
ＡＵＣ∗ ２. ８８２ ５０１１ １. ８４０ １７８８ Ｖａｌ ＧＵＵ ０. １２７ ２４０ ０. ６７４ ７０５
ＴＥＲ ＵＧＡ∗ ２. ７８５ ２０７ ２. １１２ １５７ ＧＵＧ∗ ２. ４９６ ４７１５ １. ５５３ １６２５
ＵＡＧ ０. １０８ ８ ０. ４０４ ３０ ＧＵＣ １. ３６２ ２５７３ １. ４６８ １５３６
ＵＡＡ ０. １０８ ８ ０. ４８４ ３６ ＧＵＡ ０. ０１５ ２８ ０. ３０５ ３１９
　 　 注:∗指示最优密码子ꎮ
Ｎｏｔｅ: Ｔｈｅ ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ ｃｏｄｏｎｓ ｗｅｒｅ ｍａｒｋｅｄ ｗｉｔｈ ∗.
１７７
核　 农　 学　 报 ２７ 卷
而聚球蓝细菌(Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ)、弗兰克氏菌(Ｆｒａｎｋｉａ)、
大豆慢生根瘤菌(Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ)和棕色固
氮菌(Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ)的大部分基因均位于期望
曲线的右侧[９ － １１ꎬ２５]ꎮ 仅类鼻疽伯克氏菌(Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ
ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ)的大部分基因位于期望曲线的右下
侧[１６]ꎮ 由此可见ꎬ不同物种的基因在 ＥＮＣ￣ｐｌｏｔ上的分
布位置并不一致ꎮ 这暗示他们的密码子使用特征受基
因组碱基组成的影响并不相同ꎬ这也进一步暗示了影
响密码子使用特征因素的复杂性ꎮ
有效密码子数量可以很好地反映密码子使用的偏
好程度ꎬ取值范围在 ２０ ~ ６１ 之间ꎮ 有效密码子数量越
低偏好性越强ꎬ反之有效密码子数量越高偏好性越弱ꎮ
相关分析发现ꎬ包括固氮基因在内的全部基因在对应
分析第 １ 向量轴上的坐标值与有效密码子数量呈显著
正相关(Ｒ ＝ ０􀆰 ８９０ꎬＰ < ０􀆰 ０５ꎬ表 １)ꎮ 这说明第 １ 向量
轴上的坐标值可以有效地反映密码子使用的偏好程
度ꎬ坐标值越低偏性越强ꎮ 第 １ 向量轴上的坐标值与
ＣＡＩ呈显著负相关ꎮ 由于 ＣＡＩ常用于衡量基因表达水
平的高低ꎬ因此该菌密码子偏好性受基因表达水平的
影响较大ꎮ 第 １ 向量轴上的坐标值还与 ＧＣ３ｓ 呈显著
负相关ꎬ说明该菌密码子偏好性还受 ＧＣ３ｓ 的影响ꎮ
此外ꎬ第 １ 向量轴上的坐标值还与基因长度呈显著相
关ꎬ然而相关系数仅有 － ０􀆰 １４８ꎬ因此基因长度对该菌
密码子偏好性的影响较小ꎮ 固氮相关基因同样表现出
类似的特征ꎬ即该类基因同样受基因表达水平和 ＧＣ３ｓ
的影响ꎮ 固氮相关基因在第 １ 向量轴上的坐标值还与
基因 ＧＣ含量呈显著正相关ꎬ因此固氮相关基因还受
ＧＣ含量的影响ꎮ 然而从整体水平来看ꎬ包括固氮基因
在内的全部基因受基因表达水平和 ＧＣ３ｓ 的影响较
大ꎮ 这与大豆慢生根瘤菌的密码子使用特征相类
似[１０]ꎮ
通过对密码子使用差异性进行卡方检验ꎬ结果发
现 ２２ 个密码子的使用频率在高表达基因中显著增多ꎬ
确定为最优密码子(表 ２)ꎬ这一数量与前人的文献报
道相类似[１６]ꎮ 然而ꎬ这 ２２ 个最优密码子与同样具有
固氮功能的苜蓿中华根瘤菌的最优密码子并不一
致[１２]ꎮ 例如ꎬ编码 Ｇｌｕ 的 ＧＡＧ 最优密码子、编码 Ｐｒｏ
的 ＣＣＣ、编码 Ｖａｌ 的 ＧＵＧ 和终止密码子 ＵＧＡ 并不是
苜蓿中华根瘤菌的最优密码子ꎮ 这可能是由于两者较
远的遗传距离所致ꎮ 尽管两者均属于 Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ 目ꎬ
但是茎瘤固氮根瘤菌属于 Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ 科ꎬ而苜
蓿中华根瘤菌属于 Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ 科ꎮ 较远的遗传距离
导致了代谢的差异ꎬ从而进一步导致基因表达使用的
最优密码子的差异ꎮ ２２ 个最优密码子中有 ２１ 个以
Ｇ / Ｃ结尾ꎬ说明最优密码子有强烈的 ＧＣ３ｓ 偏好ꎮ 这
与 ＧＣ３ｓ明显影响该菌密码子使用特征的结论相一
致ꎮ 最优密码子对指导外源基因表达具有重要意义ꎮ
根据最优密码子对外源基因进行密码子优化ꎬ使之符
合宿主菌的密码子使用特征ꎬ可以提高异源基因的表
达水平ꎮ Ｗｉｅｄｅｍａｎｎ等[７]对酵母菌 Ｌ －阿拉伯糖 －乙
醇代谢途径中的 ４ 个酶进行了密码子优化ꎬ获得了高
效转化 Ｌ －阿拉伯糖的酵母菌ꎬ使该菌产乙醇速率提
高了 ２􀆰 ５ 倍ꎮ Ｌｏｒｉｍｅｒ 等[８]更是开发了一套数据库软
件通过优化密码子提高蛋白表达效率ꎮ 此外ꎬ通过比
较近缘物种的最优密码子可以深入了解他们的进化机
制[２６]ꎮ 因此ꎬ茎瘤固氮根瘤菌 ＯＲＳ５７１ 的 ２１ 个最优密
码子将对该菌的基因工程改造研究和进化机制研究提
供理论基础ꎮ
４　 结论
ＥＮＣ￣ｐｌｏｔ显示茎瘤固氮根瘤菌 ＯＲＳ５７１ 密码子偏
好性受基因组碱基组成影响ꎮ 相关分析表明该菌码子
偏好性还受基因表达水平和 ＧＣ３ｓ的影响ꎮ ２２ 个密码
子被确定为最优密码子ꎬ它们有强烈的 ＧＣ３ｓ偏好ꎮ
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２７７
　 ６ 期 茎瘤固氮根瘤菌 Ａｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｃａｕｌｉｎｏｄａｎｓ ＯＲＳ５７１ 基因组密码子使用偏好性分析
Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｉｎ ａ ｆｒｅｅ￣ｌｉｖｉｎｇ
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Ｋａｎｅｋｏ Ｔꎬ Ｙａｍａｄａ Ｍꎬ Ｔａｂａｔａ Ｓꎬ Ｋｕｐｆｅｒ Ｄ. Ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ ｏｆ ｔｈｅ
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ＷＡＮＧ Ｘｉｎ￣ｘｉｎ１ꎬ２ 　 ＷＵ Ｌｉａｎｇ２ 　 ＺＨＵ Ｓｈｅｎｇ￣ｆｅｎｇ３ 　 ＺＨＡＯ Ｌｉｎ１ 　 ＡＮ Ｗｅｉ２ 　 ＣＨＥＮ Ｙｕ１ꎬ２
( １Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇꎬ Ｔｉａｎｊｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｔｉａｎｊｉｎ　 ３０００７２ꎻ
２Ｃｈｉｎａ Ｏｆｆｓｈｏｒｅ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｃｏ. Ｌｔｄ. ꎬ Ｔｉａｎｊｉｎ　 ３００４５２ꎻ ３Ｃｈｉｎａ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｏｆｆｓｈｏｒｅ Ｏｉｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎꎬ Ｂｅｉｊｉｎｇ　 １０００１０)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｔｈｅ ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ ｏｆ ｔｈｅ ｆｒｅｅ￣ｌｉｖｉｎｇ ａｎｄ ｓｙｍｂｉｏｔｉｃ ｎｉｔｒｏｇｅｎ￣ｆｉｘｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａ ｈａｓ ｂｅｅｎ ｅｘｔｅｎｓｉｖｅｌｙ ｓｔｕｄｉｅｄ.
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ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｏｆ ＥＮＣ ａｎｄ ＧＣ３ｓ ｗｈｅｎ ｔｈｅ ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ ｗａｓ ｏｎｌｙ ｓｕｂｊｅｃｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｃｏｎｓｔｒａｉｎｔ. Ａ ｆｅｗ
ｇｅｎｅｓ ｌｉｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｐｅｃｔｅｄ ｃｕｒｖｅ ｉｎ ＥＮＣ￣ｐｌｏｔꎬ ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｃｏｎｓｔｒａｉｎｔ ｐｌａｙｅｄ ａ ｒｏｌｅ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｄｏｎ
ｕｓａｇｅ ｐａｔｔｅｒｎ. Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈｅ ｌｏａｄｉｎｇ ｏｆ ａｌｌ ｇｅｎｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ａｘｉｓ ｏｆ
ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ ａｎｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ( Ｐ < ０􀆰 ０５ ) ｗｉｔｈ ｃｏｄｏｎ ａｄａｐｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘ ａｎｄ ＧＣ３ｓ.
Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅꎬ ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ ｐａｔｔｅｒｎ ｗａｓ ａｌｓｏ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｄ ｂｙ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ＧＣ３ｓ. Ｍｏｒｅｏｖｅｒꎬ ２２ ｃｏｄｏｎｓ ｗｅｒｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ
ｔｏ ｂｅ ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ ｃｏｄｏｎｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｉｎ ｈｉｇｈｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｇｅｎｅｓ. Ａｍｏｎｇ ｔｈｅｍꎬ ２１ ｃｏｄｏｎｓ ｗｅｒｅ ｅｎｄｅｄ ｗｉｔｈ Ｇ / Ｃꎬ
ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ ｈｉｇｈ ＧＣ３ｓ ｂｉａｓ ｉｎ ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ ｃｏｄｏｎｓ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ:Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓꎻ Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓꎻ Ｃｈｉ ｓｑｕａｒｅ ｔｅｓｔｓꎻ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｆｉｘａｔｉｏｎꎻ Ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ ｃｏｄｏｎ
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