全 文 ：核 农 学 报摇 圆园员源袁圆愿渊圆冤院园圆园园 耀 园圆园苑
允燥怎则灶葬造 燥枣 晕怎糟造藻葬则 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 杂糟蚤藻灶糟藻泽
收稿日期院圆园员圆鄄员圆鄄员怨摇 接受日期院圆园员猿鄄园远鄄园猿
基金项目院教育部博士学科点专项渊圆园园怨远缘员愿员员园园园员冤袁十二五科技支撑计划项目渊圆园员员月粤阅猿缘月园缘冤袁国家转基因重大专项渊圆园员员在载园愿园园缘冤
作者简介院孙宏伟袁男袁主要从事棉花分子育种研究遥 耘鄄皂葬蚤造院泽澡憎泽澡扎岳 员远猿援 糟燥皂
通讯作者院李艳军袁女袁副教授袁主要从事棉花分子育种研究遥 耘鄄皂葬蚤造院造赠躁圆园园圆圆园园圆岳 泽蚤灶葬援 糟燥皂援 糟灶
文章编号院员园园园鄄愿缘缘员渊圆园员源冤园圆鄄园圆园园鄄园愿
棕色棉 郧澡粤晕杂基因的克隆与表达分析
孙宏伟员 摇 李艳军员 摇 王雅琴圆 摇 刘永昌员 摇 薛摇 飞员 摇 孙摇 杰员
渊员石河子大学农学院 辕新疆兵团绿洲生态农业重点实验室袁新疆 石河子摇 愿猿圆园园猿曰
圆石河子大学生命科学学院袁新疆 石河子摇 愿猿圆园园猿冤
摘摇 要院本研究以 员缘阅孕粤棕色棉及其白色近等基因系为材料袁蛋白质双向凝胶电泳结合质谱分析袁鉴定
出其中一个差异表达的蛋白为花色素合成酶渊粤晕杂冤遥 以 员缘阅孕粤棕色棉纤维细胞 糟阅晕粤为模板袁电子克
隆获得了编码该蛋白基因的全长 糟阅晕粤序列袁序列分析发现袁该基因的开放阅读框为 员园远圆 遭责袁编码 猿缘源
个氨基酸袁属于花色素还原酶 圆 原酮戊二酸加氧酶亚家族袁将该基因命名为 郧澡粤晕杂遥 构建 郧澡粤晕杂 基因
郧云孕融合植物表达载体转化烟草袁荧光共聚焦显微镜观察发现 郧澡粤晕杂基因定位于烟草细胞质内遥 实时
荧光定量 孕悦砸分析表明袁郧澡粤晕杂基因在棉花中组成型表达袁该基因在纤维细胞发育的各个时期在棕色
棉中表达量均高于其白色近等基因系袁推测 郧澡粤晕杂基因在棕色棉纤维色素合成过程中起重要作用遥
关键词院郧澡粤晕杂曰陆地棉曰彩色棉曰棉纤维
阅韵陨院员园援 员员愿远怨 辕 躁援 蚤泽泽灶援 员园园鄄愿缘缘员援 圆园员源援 园圆援 园圆园园
摇 摇 彩色棉是一种成熟吐絮时袁棉纤维自身具有天然
色彩的棉花咱员暂 遥 近年来随着人们健康和环保理念的
增强袁彩色棉得到了广泛关注袁其纺织品的开发与应用
具有广阔的市场前景遥 目前袁天然彩色棉仅有棕色和
绿色两种颜色袁远远不能满足人们对于多彩服饰的需
求遥 由于缺乏其它颜色的种质资源袁用传统的育种方
法无法对彩色棉纤维的色泽品质进行改良遥 彩色棉纤
维颜色的形成与色素合成酶基因在纤维细胞中的特异
性表达有关咱圆 原 猿暂 袁克隆与鉴定彩色棉色素物质生物合
成途径中的相关基因袁可为解析色素形成机制和利用
基因工程手段改良彩色棉纤维色泽品质提供目标基因
和理论基础遥
目前人们对彩色棉纤维中的色素组成和形成机制
仍不明确袁但多数研究认为棕色棉纤维中的色素物质
是类黄酮化合物咱源 原 苑暂 遥 花色素合成酶渊粤灶贼澡燥糟赠葬灶蚤凿蚤灶
泽赠灶贼澡葬泽藻袁 粤晕杂冤是类黄酮化合物合成途径中的关键限
速酶之一袁它能够催化无色花色素生成有色花青素袁进
一步转化为花色素苷袁在植物的颜色形成中起重要作
用遥 砸燥泽葬贼蚤等咱愿暂克隆了美国金钟连翘中的 粤晕杂 基因及
其启动子袁发现抑制 粤晕杂 基因表达使连翘花瓣中无花
色素苷形成遥 晕葬噪葬贼泽怎噪葬 等咱怨暂发现袁粤晕杂 基因突变导致
龙胆花变为白色遥 粤澡葬则燥灶蚤 等咱员园暂抑制 粤晕杂 基因的表
达袁使草莓中花青素的积累明显减少袁花冠由粉红色变
为白色遥
本研究以棕色棉及其白色近等基因系为材料袁采
用 双 向 凝 胶 电 泳 技 术 渊 栽憎燥鄄阅蚤皂藻灶泽蚤燥灶葬造
耘造藻糟贼则燥责澡燥则藻泽蚤泽袁圆 原 阅耘冤分离差异蛋白点袁发现其中一
个蛋白点在棕色棉纤维中的表达明显上调袁质谱鉴定
为花色素合成酶渊粤灶贼澡燥糟赠葬灶蚤凿蚤灶 泽赠灶贼澡葬泽藻袁 粤晕杂冤遥 采
用 砸栽鄄孕悦砸 方法从棕色棉纤维细胞中克隆了 郧澡粤晕杂
基因袁并对该基因的组织表达模式及其编码蛋白的亚
细胞定位进行分析袁为深入研究该基因的功能奠定了
工作基础遥
员摇 材料与方法
员郾 员摇 试验材料
员郾 员郾 员摇 植物材料摇 本试验所用棕色棉品种新彩棉 缘
号渊棕色纤维冤与其白色近等基因系 晕陨蕴 原 缘渊白色纤
维冤袁由石河子大学棉花所提供遥 棉花开花当天挂牌
园园圆
摇 圆 期 棕色棉 郧澡粤晕杂基因的克隆与表达分析
标记棉铃袁采集 远尧怨尧员圆尧员缘尧员愿尧圆员尧圆源尧圆苑 阅孕粤渊阅葬赠
孕葬泽贼 粤灶贼澡藻泽蚤泽袁开花后天数冤的棉铃袁用无菌的镊子从胚
珠上剥取纤维细胞袁经液氮速冻后保存于 原 愿园益冰箱
备用遥 取新彩棉 缘 号与其白色近等基因系种子袁剥去
种皮袁园郾 员豫 匀早悦造圆 灭菌 员园 皂蚤灶袁灭菌水冲洗 猿 次袁播种
于 酝杂固体培养基上袁待幼苗长出真叶时袁分别取幼苗
的根尧茎和叶袁液氮速冻后置于 原 愿园益冰箱备用遥
员郾 员郾 圆摇 试剂摇 本试验所用 圆 原 阅 匝怎葬灶贼 运蚤贼 试剂盒购于
郧耘 医疗集团袁反转录酶 砸藻增藻则泽藻 贼则葬灶泽糟则蚤责贼葬泽藻 酝鄄酝蕴灾
渊砸晕葬泽藻 匀 原 冤 和 杂再月砸 孕则藻皂蚤曾 耘曾 栽葬择 均购于大连宝生
物有限公司袁责郧耘酝鄄栽 藻葬泽赠 增藻糟贼燥则购于 孕则燥皂藻早葬 公司袁入
门载体 责阅韵晕砸圆圆员袁郧葬贼藻憎葬赠誖 月孕 悦造燥灶葬泽藻栽酝域耘灶扎赠皂藻 皂蚤曾
和 郧葬贼藻憎葬赠 誖 蕴砸 悦造燥灶葬泽藻栽酝 域 耘灶扎赠皂藻 酝蚤曾 均 购 于
陨灶增蚤贼则燥早藻灶 公司遥 大肠杆菌 渊 耘泽糟澡藻则蚤糟澡蚤葬 糟燥造蚤 冤 菌株
栽燥责员园袁根癌农杆菌 渊 粤早则燥遭葬糟贼藻则蚤怎皂 贼怎皂藻枣葬糟蚤藻灶泽冤 菌株
蕴月粤源源园源和双元表达载体 责郧宰月缘均为本实验室保存遥
员郾 圆摇 蛋白 圆 原 阅耘与酝粤蕴阅陨鄄栽韵云 辕 栽韵云分析
按照姚远等人的方法咱员员暂提取 员缘 阅孕粤棕色棉与白
色棉纤维总蛋白遥 将提取的蛋白质溶解于蛋白溶解液
中渊 苑 皂燥造窑蕴 原员 尿素袁 圆 皂燥造窑蕴 原员 硫脲袁 源豫 渊宰 辕 灾冤
悦匀粤孕杂袁源园 皂皂燥造窑蕴 原员 阅栽栽冤袁用 圆 原 阅 匝怎葬灶贼 运蚤贼 试剂盒
进行蛋白定量遥 取 源缘园 怎造渊含 员 皂早 总蛋白冤蛋白溶解
液放入胶条槽中袁再放入 责匀 值 源 原 苑袁圆源 糟皂 的非线性
胶条渊购自 郧耘医疗集团冤袁等电聚焦和二相电泳参考
在澡葬燥等咱员圆暂人的方法进行遥 电泳结束后袁将凝胶放入固
定液 渊 源园豫 甲醇袁 员园豫 冰醋酸 冤 中固定 员澡袁参考
悦葬灶凿蚤葬灶燥等咱员猿暂的方法进行 野月造怎藻 泽蚤造增藻则冶染色遥 脱色后
用 陨皂葬早藻杂糟葬灶灶藻则 芋 渊 郧耘 医疗集团冤 扫描凝胶袁用
陨皂葬早藻酝葬泽贼藻则 圆阅 孕造葬贼蚤灶怎皂 缘郾 园 软件渊郧耘医疗集团冤对凝
胶图像进行数据分析袁以蛋白点的豫 增燥造怎皂藻 值为标准
进行定量袁选定差异变化为 员郾 缘 倍以上的蛋白点袁运用
栽测验选取 孕值 约园郾 园缘 的蛋白点送 粤月 杂悦陨耘载 公司进
行 酝粤蕴阅陨鄄栽韵云 辕 栽韵云 分 析遥 用 酝葬泽糟燥贼 在 线 软 件
渊 澡贼贼责院 辕 辕 憎憎憎援 皂葬贼则蚤曾泽糟蚤藻灶糟藻援 糟燥皂冤分析 酝杂 和 酝杂 辕 酝杂
质谱数据遥
员郾 猿摇 基因的克隆与序列分析
根﹑茎﹑叶以及纤维总 砸晕粤 的提取采用 悦栽粤月
法咱员源暂 袁利用 砸藻增藻则泽藻 栽则葬灶泽糟则蚤责贼葬泽藻 酝鄄酝蕴灾 反转录制备
糟阅晕粤遥 根据棉纤维 粤晕杂基因的 皂砸晕粤序列渊郧藻灶月葬灶噪
登录号为 阅匝员圆圆员愿圆冤设计扩增 韵砸云 的引物 孕员院缘忆 原
粤栽郧 郧郧粤 悦悦栽 悦粤郧 栽郧悦 栽粤 原猿忆和 孕圆院缘忆 原 郧栽栽 郧郧粤
悦粤郧 粤栽栽 粤栽悦 悦栽郧 郧 原 猿忆遥 以 员缘 阅孕粤 棕色棉纤维
糟阅晕粤为模板进行 孕悦砸扩增袁反应程序为院怨缘益变性 缘
皂蚤灶曰怨缘益 员 皂蚤灶袁缘圆益 源缘杂袁苑圆益 员 皂蚤灶袁猿园 个循环曰苑圆益
延伸 员园 皂蚤灶遥 孕悦砸 产物经 园郾 愿豫的琼脂糖凝胶检测袁
回收后连接至 责郧耘酝鄄栽 藻葬泽赠载体遥 连接产物通过热激
法转入大肠杆菌 栽燥责员园袁挑选白斑袁摇菌后提取质粒遥
经 孕悦砸和酶切鉴定正确的阳性克隆送北京六合华大
基因科技股份有限公司测序遥
员郾 源摇 生物信息学分析
采用 耘曾孕粤杂再 网站的 悦燥皂责怎贼藻则 孕陨 辕 酝憎 程序计算
郧澡粤晕杂编码蛋白的分子量及等电点遥 通过 悦造怎泽贼葬造 载
软件对不同物种中的 粤晕杂 蛋白序列进行比对袁用
酝耘郧粤 缘郾 园 软件构建进化树袁孕则燥贼杂糟葬造藻 分析亲水性 辕疏
水性袁用 杂韵孕酝粤在线工具预测蛋白的二级结构遥
员郾 缘摇 实时荧光定量 孕悦砸分析
根据 郧澡粤晕杂 序列设计 择孕悦砸 引物 粤晕杂渊云冤 缘忆 原
粤粤郧 粤栽悦 粤栽悦 悦栽栽 粤粤郧 悦悦粤 悦栽悦 悦 原 猿忆和 粤晕杂渊砸冤
缘忆 原 郧粤粤 粤栽粤 郧郧栽 栽粤栽 悦郧悦 郧粤悦 粤粤粤 栽 原 猿忆遥 以棉
花 耘云员葬 作为内参基因袁引物为 耘云员葬 渊 云冤 缘忆 原 粤郧粤
悦悦粤 悦悦粤 粤粤栽 粤悦栽 栽郧悦 粤悦 原 猿忆和 耘云员琢渊砸冤 缘忆 原
悦悦粤 悦悦粤 粤栽悦 栽栽郧 栽粤悦 粤悦粤 栽悦悦 原 猿忆遥 分别以根尧
茎尧叶及不同发育时期的棉纤维 糟阅晕粤 为模板进行
孕悦砸扩增袁分析 郧澡粤晕杂基因在白色棉和棕色棉各器官
中的表达模式遥 择孕悦砸 反应程序院怨缘益预变性 员皂蚤灶曰
怨缘益变性 员缘 泽袁远园益退火 圆园 泽曰苑圆益 猿园 泽袁源缘 个循环袁反
应在 酝曾猿园园园责 系统上完成渊粤早蚤造藻灶贼冤遥 检测 郧澡粤晕杂 和
耘云员葬基因在每个样品中的 悦栽 值袁每份样品 猿 次技术
重复袁取其平均值袁按照 圆 原 驻驻悦贼 法进行分析袁使用
酝蚤糟则燥泽燥枣贼 耘曾糟藻造处理数据遥
员郾 远摇 植物表达载体的构建与亚细胞定位
在 孕员尧孕圆 引物中分别加入定向克隆的识别序列
渊划线部分冤袁以保证序列以正确的方向重组至入门载
体袁如 孕员院缘忆 原 郧郧郧 郧粤悦 粤粤郧 栽栽栽 郧栽粤 悦粤粤 粤粤粤
粤郧悦 粤郧郧 悦栽粤 悦粤栽 郧郧郧 粤悦悦 栽悦粤 郧栽郧 悦栽粤 原猿忆袁孕圆院
缘忆 原 郧郧郧 郧粤悦 悦粤悦 栽栽栽 郧栽粤 悦粤粤 郧粤粤 粤郧悦 栽郧郧
郧栽粤 郧栽栽 郧郧粤 悦粤郧 粤栽栽 粤栽悦 悦栽郧 郧 原猿忆遥 以 员缘 阅孕粤
棕色棉纤维 糟阅晕粤为模版进行 孕悦砸 扩增袁孕悦砸 产物用
于 月孕 重组反应袁具体操作按照 陨灶增蚤贼则燥早藻灶 公司
郧葬贼藻憎葬赠誖 月孕 悦造燥灶葬泽藻栽酝 域 耘灶扎赠皂藻 皂蚤曾 说明书进行遥
月孕反应后 郧澡粤晕杂基因以正确的方向重组到入门载体
责阅韵晕砸圆圆员袁然 后 按 照 郧葬贼藻憎葬赠 誖 蕴砸 悦造燥灶葬泽藻栽酝 域
耘灶扎赠皂藻 酝蚤曾说明书通过 蕴砸重组反应将 郧澡粤晕杂整合到
双元表达载体 责郧宰月缘 上渊携带 郧云孕基因冤遥 通过热激
法将重组质粒转入大肠杆菌中袁将转化后的大肠杆菌
均匀涂布在含 匀赠早渊缘园 皂早窑蕴 原员冤和 运葬灶渊缘园 皂早窑蕴 原员冤的
蕴月培养基上袁猿苑益培养过夜遥 挑取单菌落袁提取质粒袁
经 孕悦砸和酶切鉴定袁将正确的 责郧宰月鄄郧澡粤晕杂 转入农
员园圆
核摇 农摇 学摇 报 圆愿 卷
杆菌 蕴月粤源源园源 中袁然后注射烟草叶片遥 注射 圆 耀 猿凿
后袁剪取小部分叶片在荧光共聚焦扫描显微镜渊蕴藻蚤糟葬袁
德国冤下观察目的蛋白亚细胞定位遥
圆摇 结果与分析
圆郾 员摇 圆 原 阅耘结果与蛋白测序
提取 员缘 阅孕粤棕色纤维与白色纤维总蛋白进行 圆
原 阅耘 电泳袁每个样品包括 猿 个生物学重复袁共获得 远
张 圆 原 阅耘凝胶遥 利用 陨皂葬早藻酝葬泽贼藻则 圆阅 孕造葬贼蚤灶怎皂软件分
析比较两个样品的 圆 原 阅耘 凝胶袁找出差异蛋白点袁酶
解后进行 酝粤陨阅陨 栽韵云 辕 栽韵云 酝杂分析袁用 酝葬泽糟燥贼 在线软
件将获得的质谱数据与 郧藻灶月葬灶噪 中的蛋白进行匹配遥
在多个差异蛋白点中袁有 员 个点被鉴定为 粤晕杂袁该蛋白
点在棕色纤维中的丰度明显高于白色纤维渊图 员冤袁豫
增燥造怎皂藻比值约为 圆郾 园袁表明 粤晕杂 在棕色纤维色素合成
过程中可能起到重要作用遥 该蛋白点的 郧藻灶月葬灶噪 序
列号为 粤月粤园员源愿猿袁相应的 皂砸晕粤序列为 阅匝员圆圆员愿圆遥
注院粤援 棕色棉曰月援 白色棉曰方框区域为放大区域曰椭圆所示为 粤晕杂相应的蛋白点遥
晕燥贼藻院 粤援 遭则燥憎灶 糟燥造燥则 枣蚤遭藻则曰 月援 憎澡蚤贼藻 糟燥造燥则 枣蚤遭藻则曰 贼澡藻 枣则葬皂藻凿 则藻早蚤燥灶泽 葬则藻 藻灶造葬则早藻凿 贼燥 糟造藻葬则造赠 泽澡燥憎 贼澡藻 责则燥贼藻蚤灶 泽责燥贼泽 燥枣 粤晕杂曰
韵增葬造鄄泽澡葬责藻凿 泽澡燥憎泽 贼澡藻 责则燥贼藻蚤灶 泽责燥贼 燥枣 粤晕杂援
图 员摇 员缘阅孕粤棕色棉和白色棉纤维 圆 原 阅耘凝胶图谱
云蚤早援 员摇 圆 原 阅耘 皂葬责 燥枣 遭则燥憎灶 糟燥造燥则 枣蚤遭藻则 葬灶凿 憎澡蚤贼藻 糟燥造燥则 枣蚤遭藻则 枣则燥皂 员缘阅孕粤
圆郾 圆摇 郧澡粤晕杂基因的克隆与序列分析
根据 郧澡粤晕杂的 皂砸晕粤序列渊阅匝员圆圆员愿圆冤设计扩增
韵砸云的引物袁以 员缘 阅孕粤 棕色棉纤维的 糟阅晕粤 为模板
扩增出一条约 员园远圆 遭责的片段遥 测序结果表明克隆序
列与数据库中已有的基因序列完全一致袁该基因的开
放阅读框 员园远圆遭责袁编码 猿缘源 个氨基酸渊图 圆冤遥 月造葬泽贼 载
分析发现 郧澡粤晕杂中含有典型 粤晕杂蛋白的保守结构域院
圆韵郧鄄云藻陨陨鄄韵曾赠氧化酶结构域渊从 郧造怎圆员圆到 蕴赠泽猿园怨 冤袁这一
结构域是 圆 原酮戊二酸和 云藻渊陨陨冤 原依赖的氧化酶超家
族的保守域袁将编码该蛋白的基因命名为 郧澡粤晕杂遥
圆郾 猿摇 生物信息学分析
用 耘曾责葬泽赠程序对 郧澡粤晕杂的氨基酸序列进行了一级
结构的预测袁其理论等电点 责陨 越 缘郾 园远袁分子量 酝憎 越
愿远郾 怨猿噪阅曰原子组成为 悦猿员苑猿 匀缘圆愿猿 晕员园远缘 韵员猿员猿 杂圆猿远袁不稳定系
数 源源郾 员园袁说明该蛋白属于不稳定蛋白曰脂溶性预测分析
表明袁脂溶指数为圆怨郾 猿怨袁平均疏水性为园郾 愿圆园袁即 郧澡粤晕杂
蛋白属于水溶性蛋白曰利用 杂韵孕酝粤在线工具对 郧澡粤晕杂
编码蛋白的二级结构进行预测遥 其二级结构如下渊图
猿冤袁其中随机卷曲由 猿怨郾 缘缘豫的氨基酸残基构成袁琢 原螺
旋由 猿远郾 苑圆豫的氨基酸残基构成袁同时由 员苑郾 缘员豫和
远郾 圆员豫的氨基酸残基分别构成伸展序列和转角遥
圆郾 源摇 郧澡粤晕杂同源性比对与进化树分析
用 悦造怎泽贼葬造 载软件将 郧澡粤晕杂 编码蛋白的氨基酸序
列与 郧藻灶月葬灶噪上公布的其它物种 粤晕杂 的氨基酸序列
进行同源性比较渊图 源冤遥 为明确 郧澡粤晕杂 与其它植物
粤晕杂 的进化关 系袁 将 郧澡粤晕杂 的 氨 基 酸 序 列 用
酝耘郧粤缘郾 园 软件构建进化树遥 结果表明袁棉花 郧澡粤晕杂
与可可树尧龙眼植物的 粤晕杂 蛋白的同源性较高袁分别
为 怨园豫和 愿苑豫 袁在进化关系上与可可树最为接近袁其
次是龙眼袁与西洋梨尧苹果的关系较远渊图 缘冤遥
圆园圆
摇 圆 期 棕色棉 郧澡粤晕杂基因的克隆与表达分析
注院下划线 粤栽郧为起始密码子曰栽郧粤为终止密码子曰方框为保守的 郧澡粤晕杂 结构域遥
晕燥贼藻院 粤栽郧 渊杂贼葬则贼 糟燥凿燥灶冤 葬灶凿 栽郧粤 渊泽贼燥责 糟燥凿燥灶冤 葬则藻 泽澡燥憎灶 蚤灶 怎灶凿藻则造蚤灶藻曰 遭燥曾藻泽 凿藻造蚤灶藻葬贼藻 贼澡藻 糟燥灶泽藻则增藻凿 凿燥皂葬蚤灶 燥枣 郧澡粤晕杂援
图 圆摇 郧澡粤晕杂基因 韵砸云与推定的氨基酸序列
云蚤早援 圆摇 晕怎糟造藻燥贼蚤凿藻 泽藻择怎藻灶糟藻 燥枣 郧澡粤晕杂 韵砸云 葬灶凿 凿藻凿怎糟藻凿 葬皂蚤灶燥 葬糟蚤凿 泽藻择怎藻灶糟藻泽
注院上图 澡袁 藻袁 糟分别代表 琢 原螺旋袁伸展序列袁随机卷曲曰下图
蓝色袁红色袁紫色分别代表 琢 原螺旋袁伸展序列袁随机卷曲遥
晕燥贼藻院 陨灶 贼澡藻 怎责责藻则 责葬灶藻造 贼澡藻 造藻贼贼藻则泽 澡袁 藻袁 葬灶凿 糟 则藻责则藻泽藻灶贼 贼澡藻 琢 原
澡藻造蚤曾袁 藻曾贼藻灶凿藻凿 泽贼则葬灶凿 葬灶凿 则葬灶凿燥皂 糟燥蚤造 则藻泽责藻糟贼蚤增藻造赠袁 憎澡蚤造藻 蚤灶 贼澡藻 摇
造燥憎藻则 责葬灶藻造 贼澡藻赠 葬则藻 凿藻灶燥贼藻凿 葬泽 贼澡藻 月造怎藻袁 则藻凿袁 责怎则责造藻 则藻泽责藻糟贼蚤增藻造赠援
图 猿摇 郧澡粤晕杂编码蛋白的二级结构预测
云蚤早援 猿摇 杂藻糟燥灶凿葬则赠 泽贼则怎糟贼怎则藻 责则藻凿蚤糟贼蚤燥灶 燥枣 责则藻凿蚤糟贼藻凿
责则燥贼藻蚤灶 藻灶糟燥凿藻凿 遭赠 郧澡粤晕杂
圆郾 缘摇 郧澡粤晕杂的组织表达模式分析
为了研究 郧澡粤晕杂的表达模式袁提取棉花不同器官
总 砸晕粤袁反转录合成 糟阅晕粤遥 设计基因特异引物袁采用
择孕悦砸技术对 郧澡粤晕杂基因在白色棉和棕色棉根尧茎尧叶
及不同发育时期纤维中的表达模式进行分析袁结果
渊图 远冤表明院郧澡粤晕杂在棉花中组成型表达袁但在棉纤维
中优势表达曰郧澡粤晕杂在不同发育时期的白色纤维和棕
色纤维中的表达模式相似袁即在 员圆阅孕粤 达到高峰袁随
后表达量逐渐降低曰在纤维发育各个时期袁郧澡粤晕杂 在
棕色纤维中的表达量均高于白色纤维袁如在 员圆 阅孕粤
棕色纤维中的表达量相对值为 园郾 圆远袁比同时期白色纤
维表达量高 猿 倍以上袁差异极显著曰在 圆苑 阅孕粤 棕色纤
维中基因仍有微量表达袁而在白色纤维中几乎检测不
到遥 以上结果表明 郧澡粤晕杂 基因在棕色棉纤维色素形
成过程中发挥作用遥
圆郾 远摇 郧云孕鄄郧澡粤晕杂表达载体的构建及亚细胞定位
利用 郧葬贼藻憎葬赠技术将 郧澡粤晕杂 基因 韵砸云 构建到双
元表达载体 责郧宰月缘 上渊含 郧云孕 基因冤袁电激转化农杆
菌 蕴月粤源源园源遥 利用农杆菌介导的烟草注射技术袁瞬时
猿园圆
核摇 农摇 学摇 报 圆愿 卷
注院所用植物 粤晕杂 包括院葡萄渊粤月灾愿圆怨远苑冤尧龙眼渊粤悦运苑远圆猿员冤尧桑渊粤耘晕缘缘远员猿冤尧芍药渊粤云陨苑员怨园园冤尧西洋梨渊 粤月月苑园员员怨冤尧
摇 摇 摇 甘薯渊月粤粤苑缘猿园缘冤尧栽培苹果渊粤粤在苑怨猿苑源冤尧草原龙胆渊月粤允园愿怨圆苑冤尧可可树渊粤阅阅缘员猿缘远冤遥
晕燥贼藻院 栽澡藻 责造葬灶贼 粤晕杂 燥枣 贼澡藻 皂怎造贼蚤责造藻 葬造蚤早灶皂藻灶贼 糟燥灶贼葬蚤灶泽院 灾蚤贼蚤泽 增蚤灶蚤枣藻则葬 渊粤月灾愿圆怨远苑冤袁 阅蚤皂燥糟葬则责怎泽 造燥灶早葬灶 渊粤悦运苑远圆猿员冤袁 酝燥则怎泽 葬造遭
渊粤耘晕缘缘远员猿 冤袁 孕葬藻燥灶蚤葬 造葬糟贼蚤枣造燥则葬 渊 粤云陨苑员怨园园 冤袁 孕赠则怎泽 糟燥皂皂怎灶蚤泽 渊 粤月月苑园员员怨 冤袁 陨责燥皂燥藻葬 遭葬贼葬贼葬泽 渊 月粤粤苑缘猿园缘 冤袁 酝葬造怎泽
摇 摇 摇 摇 摇 凿燥皂藻泽贼蚤糟葬 渊粤粤在苑怨猿苑源冤袁 耘怎泽贼燥皂葬 早则葬灶凿蚤枣造燥则怎皂 渊月粤允园愿怨圆苑 冤袁 栽澡藻燥遭则燥皂葬 糟葬糟葬燥 渊粤阅阅缘员猿缘远冤援
图 源摇 棉花 郧澡粤晕杂与不同植物 粤晕杂氨基酸序列同源性比对
云蚤早援 源摇 杂藻择怎藻灶糟藻 葬造蚤早灶皂藻灶贼 燥枣 凿藻凿怎糟藻凿 葬皂蚤灶燥 葬糟蚤凿 泽藻择怎藻灶糟藻泽 燥枣 郧澡粤晕杂 憎蚤贼澡 燥贼澡藻则 责造葬灶贼 粤晕杂
注院图中黑色三角表示 郧澡粤晕杂遥
晕燥贼藻院 栽澡藻 遭造葬糟噪 贼则蚤葬灶早造藻 则藻责则藻泽藻灶贼泽 贼澡藻 郧澡粤晕杂援
图 缘摇 棉花 郧澡粤晕杂与其他植物 粤晕杂蛋白的进化树分析
云蚤早援 缘摇 孕澡赠造燥早藻灶贼蚤糟 则藻造葬贼蚤燥灶泽澡蚤责 燥枣 郧澡粤晕杂 葬灶凿
燥贼澡藻则 责造葬灶贼 粤晕杂 责则燥贼藻蚤灶泽
表达 郧澡粤晕杂鄄郧云孕融合蛋白遥 注射 猿凿 后袁剪取烟草叶
片袁用荧光共聚焦显微镜观察蛋白表达及蛋白亚细胞
定位情况遥 结果如图 苑 所示袁绿色荧光信号明显分布
在细胞边缘及细胞内遥 为了更加清楚的观察蛋白的亚
细胞定位情况袁把经过注射的烟草叶片消化成原生质
注院砸院 根曰杂院 茎曰蕴院 叶曰远 耀 圆苑 分别为 远尧怨尧员圆尧
员缘尧员愿尧圆员尧圆源尧圆苑 阅孕粤的纤维细胞遥
晕燥贼藻院 砸院 砸燥燥贼曰 杂院 杂贼藻皂曰 蕴院 悦燥贼赠造藻凿燥灶泽曰 远 耀 圆苑 则藻责则藻泽藻灶贼 枣蚤遭藻则
糟藻造造泽 葬贼 远袁 怨袁 员圆袁 员缘袁 员愿袁 圆员袁 圆源 葬灶凿 圆苑 阅孕粤袁 则藻泽责藻糟贼蚤增藻造赠援
图 远摇 郧澡粤晕杂基因在棉花不同器官中的表达分析
云蚤早援 远摇 栽澡藻 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 责葬贼贼藻则灶 燥枣 郧澡粤晕杂 早藻灶藻 蚤灶 凿蚤枣枣藻则藻灶贼
糟燥贼贼燥灶 燥则早葬灶泽 遭赠 砸藻葬造鄄贼蚤皂藻 择怎葬灶贼蚤贼葬贼蚤增藻 砸栽鄄孕悦砸 葬灶葬造赠泽藻泽
体袁然后用荧光共聚焦显微镜进行观察袁进一步明确了
绿色荧光信号分布于烟草叶片的细胞边缘遥
源园圆
摇 圆 期 棕色棉 郧澡粤晕杂基因的克隆与表达分析
注院粤袁 阅院可见光显微图曰月袁 耘院绿色荧光显微图曰悦袁 云院可见光与绿色荧光叠加图遥
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图 苑摇 郧澡粤晕杂的亚细胞定位
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猿摇 讨论
近年来袁随着彩色棉产业的发展袁彩色棉纤维中的
色素组成尧种类和形成机制成为研究热点遥 赵向前
等咱源暂用甲醇提取了棕色棉纤维中的色素物质袁经化学
显色反应和紫外光谱吸收分析袁认为棕色棉纤维中的
色素物质可能是类黄酮化合物遥 詹少华等咱员缘 原 员远暂在纯
化棕色纤维色素的基础上袁通过化学性质鉴定袁认为棕
色棉纤维中的色素是由单宁物质氧化形成的醌类化合
物遥 匀怎葬等咱远暂对棕色棉和白色棉纤维成熟过程中色素
沉积和纤维素合成的特点进行了比较研究袁指出类黄
酮可能是棕色棉纤维中合成的主要色素类型遥 西南农
业大学从彩色棉纤维中分离到 源 个类黄酮合成相关基
因袁并推测棕色棉纤维中的色素物质是类黄酮化合物
中的原花青素咱缘暂 遥 可见袁不同研究者持有不同观点袁
因此棕色棉纤维中的色素成分袁种类以及形成机理仍
有待深入研究遥
虽然对彩色棉色素物质的成分存在争议袁但是多
数学者认为棕色棉的纤维色素是类黄酮渊云造葬增燥灶燥蚤凿泽冤
物质咱源 原 苑暂 遥 类黄酮化合物是自然界中存在的最大的一
类次生代谢产物袁广泛存在于植物中袁在植物的生长尧
发育尧开花尧结果及色素形成等方面起着重要的作用袁
也是植物色素的主要成分咱员苑 原 员怨暂 遥 花色素合成酶是类
黄酮化合物合成途径中的关键酶袁它能够催化无色花
色素生成有色花青素袁再进一步转化为花色素苷袁在植
物的颜色形成中起重要作用遥 本研究以 员缘阅孕粤 棕色
棉与其白色近等基因系纤维为材料袁利用 圆 原 阅耘 比较
两者的蛋白质组差异袁通过质谱分析将其中的一个差
异蛋白点鉴定为花色素合成酶袁择孕悦砸 分析表明该基
因在棉纤维中优势表达袁且在纤维整个发育过程中袁棕
色纤维中的表达量均高于白色纤维袁结合比较蛋白质
组分析结果袁推测 郧澡粤晕杂基因在棕色棉纤维色素合成
过程中可能起着重要作用袁为进一步深入研究彩色棉
色素成分尧形成机理及通过转基因方法改良彩色棉纤
维色泽奠定了基础遥
源摇 结论
通过蛋白质双向凝胶电泳结合质谱分析鉴定出一
个棕色纤维中高丰度的蛋白点要要要花色素合成酶
渊粤晕杂冤遥 利用 砸栽鄄孕悦砸 技术从棕色纤维中克隆了
郧澡粤晕杂基因袁开放阅读框为 员园远圆遭责袁编码 猿缘源 个氨基
酸袁属于花色素还原酶 圆 原酮戊二酸加氧酶亚家族成
员遥 实时荧光定量技术分析发现该基因在棉花中组成
型表达袁在纤维细胞发育的各个时期该基因在棕色棉
中表达量均高于其白色棉近等基因系袁推测 郧澡粤晕杂 基
因在棕色棉纤维色素合成过程中起重要作用遥
缘园圆
核摇 农摇 学摇 报 圆愿 卷
参考文献院
咱 员 暂 摇 杜雄明袁 张天真袁 袁有禄援 有色棉的研究利用现状及展望咱 允暂 援
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咱员远暂摇 詹少华袁林毅袁蔡永萍袁李正鹏援 天然棕色棉纤维色素光谱学特
性及其化学结构初步推断咱 允暂 援 植物学通报袁 圆园园苑袁 圆源渊员冤院 怨怨
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