全 文 ：摇 核 农 学 报摇 圆园员员袁圆缘渊远冤院员员圆猿 耀 员员圆愿允燥怎则灶葬造 燥枣 晕怎糟造藻葬则 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 杂糟蚤藻灶糟藻泽
收稿日期院圆园员员鄄园员鄄员怨摇 接受日期院圆园员员鄄园源鄄圆源
基金项目院国家自然科学基金渊猿园愿苑员缘源源冤袁山东省自然基金青年基金渊在砸圆园员员悦匝园圆远冤袁山东省中青年科学家奖励基金渊月杂圆园园怨晕再园圆愿冤袁青岛农业
大学博士启动基金渊远猿园苑员远冤
作者简介院刘摇 强渊员怨愿苑鄄冤袁男袁山东青岛人袁在读硕士研究生袁主要从事花生重要性状基因克隆遥 耘鄄皂葬蚤造院择蚤葬灶早造蚤怎园园员岳 员远猿郾 糟燥皂
通讯作者院隋炯明渊员怨苑愿鄄冤袁男袁山东潍坊人袁博士袁讲师袁主要从事花生分子育种遥 耘鄄皂葬蚤造院泽怎蚤躁蚤燥灶早皂蚤灶早岳 员远猿郾 糟燥皂
文章编号院员园园园鄄愿缘缘员渊圆园员员冤园远鄄员员圆猿鄄园远
花生 枣憎圆郾 圆基因的克隆及遗传转化
刘摇 强摇 王晶珊摇 乔利仙摇 赵春梅摇 隋炯明
渊青岛农业大学生命科学学院袁青岛市主要农作物创新与应用重点实验室袁山东 青岛摇 圆远远员园怨冤
摘摇 要院枣憎圆郾 圆 基因是影响番茄果重的一个重要数量性状基因袁在心皮的细胞分裂中起负调控作用遥 本
研究以番茄 枣憎圆郾 圆 基因的序列为探针袁从花生 耘杂栽数据库中筛选同源序列遥 根据花生的 耘杂栽 拼接序列
设计引物对花生进行扩增袁目标产物测序后袁将推测的氨基酸序列与其他植物 枣憎圆郾 圆 基因编码的氨基酸
序列进行比对袁同源性为 猿源郾 苑愿豫 耀远远郾 愿缘豫 遥 半定量 砸栽鄄孕悦砸结果表明袁该基因在野生种和栽培种中的
表达存在差异遥 将 枣憎圆郾 圆 基因连接到植物表达载体袁通过农杆菌介导法转化花生品种花育 圆猿 号袁获得
了 员圆 个 孕悦砸阳性的独立转化子遥
关键词院花生曰枣憎圆郾 圆 基因曰克隆曰转化
悦蕴韵晕陨晕郧 粤晕阅 郧耘晕耘栽陨悦 栽砸粤晕杂云韵砸酝粤栽陨韵晕 韵云 枣憎圆郾 圆 郧耘晕耘 陨晕 孕耘粤晕哉栽
蕴陨哉 匝蚤葬灶早摇 宰粤晕郧 允蚤灶早鄄泽澡葬灶摇 匝陨粤韵 蕴蚤鄄曾蚤葬灶摇 在匀粤韵 悦澡怎灶鄄皂藻蚤摇 杂哉陨 允蚤燥灶早鄄皂蚤灶早
渊匝蚤灶早凿葬燥 运藻赠 蕴葬遭 燥枣 郧藻则皂责造葬泽皂 陨灶灶燥增葬贼蚤燥灶 葬灶凿 粤责责造蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣 酝葬躁燥则 悦则燥责泽袁 悦燥造造藻早藻 燥枣 蕴蚤枣藻 杂糟蚤藻灶糟藻袁
匝蚤灶早凿葬燥 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 哉灶蚤增藻则泽蚤贼赠袁 匝蚤灶早凿葬燥袁 杂澡葬灶凿燥灶早摇 圆远远员园怨冤
粤遭泽贼则葬糟贼院枣憎圆郾 圆 早藻灶藻 蚤泽 葬灶 蚤皂责燥则贼葬灶贼 择怎葬灶贼葬贼蚤增藻 贼则葬蚤贼 造燥糟怎泽 渊匝栽蕴冤 葬枣枣藻糟贼蚤灶早 枣则怎蚤贼 憎藻蚤早澡贼 蚤灶 贼燥皂葬贼燥袁 葬灶凿 糟葬灶 则藻凿怎糟藻 糟藻造造
凿蚤增蚤泽蚤燥灶 蚤灶 糟葬则责藻造泽 葬泽 葬 灶藻早葬贼蚤增藻 则藻早怎造葬贼燥则援 陨灶 贼澡蚤泽 藻曾责藻则蚤皂藻灶贼袁 枣憎圆郾 圆 早藻灶藻 蚤灶 贼燥皂葬贼燥 憎葬泽 责则藻责葬则藻凿 葬泽 责则燥遭藻 贼燥 泽糟则藻藻灶
澡燥皂燥造燥早燥怎泽 泽藻择怎藻灶糟藻 枣则燥皂 责藻葬灶怎贼 耘杂栽 凿葬贼葬遭葬泽藻援 栽澡藻灶袁 葬糟糟燥则凿蚤灶早 贼燥 贼澡藻 躁燥蚤灶贼 耘杂栽 泽藻择怎藻灶糟藻袁 葬 责葬蚤则 燥枣 责则蚤皂藻则 憎葬泽
凿藻泽蚤早灶藻凿 贼燥 葬皂责造蚤枣蚤藻凿 贼澡藻 枣憎圆郾 圆 早藻灶藻 燥枣 责藻葬灶怎贼援 悦燥皂责葬则藻凿 憎蚤贼澡 燥贼澡藻则 责造葬灶贼泽袁 贼澡藻 泽蚤皂蚤造葬则蚤贼赠 则葬灶早藻 燥枣 葬皂蚤灶燥 葬糟蚤凿 泽藻择怎藻灶糟藻
憎葬泽 遭藻贼憎藻藻灶 猿源郾 苑愿豫 葬灶凿 远远郾 愿缘豫 援 耘曾责则藻泽泽蚤燥灶 凿蚤枣枣藻则藻灶糟藻 憎葬泽 凿藻贼藻糟贼藻凿 遭藻贼憎藻藻灶 憎蚤造凿 葬灶凿 糟怎造贼蚤增葬贼藻凿 皂葬贼藻则蚤葬造泽 遭赠 泽藻皂蚤鄄
择怎葬灶贼蚤贼葬贼蚤增藻 砸栽鄄孕悦砸援 粤枣贼藻则 贼则葬灶泽枣燥则皂葬贼蚤燥灶 皂藻凿蚤葬贼藻凿 遭赠 粤早则燥遭葬糟贼藻则蚤怎皂 贼怎皂藻枣葬糟蚤藻灶泽袁 员圆 蚤灶凿藻责藻灶凿藻灶贼 贼则葬灶泽枣燥则皂葬灶贼泽 燥枣
责藻葬灶怎贼 糟怎造贼蚤增葬则 匀怎葬赠怎 圆猿 憎藻则藻 蚤凿藻灶贼蚤枣蚤糟葬贼藻凿 遭赠 孕悦砸 葬皂责造蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶援
运藻赠 憎燥则凿泽院责藻葬灶怎贼曰 枣憎圆郾 圆 早藻灶藻曰 糟造燥灶蚤灶早曰 贼则葬灶泽枣燥则皂葬贼蚤燥灶
摇 摇 分子生物学的快速发展和高密度遗传图谱的构建
使数量性状基因的克隆成为可能遥 目前袁在植物中已
克隆了多个数量性状基因袁它们有些编码转录因子袁有
些参与新陈代谢或信号转导遥 如在番茄中已克隆了 猿
个数量性状基因袁分别是控制果实形状的 韵增葬贼藻尧控制
果实含糖量的 蕴蚤灶缘 和控制果实大小的 枣憎圆郾 圆咱员 耀 猿暂 遥
枣憎圆郾 圆 能抑制心皮的细胞分裂袁是细胞分裂的负调控
基因袁在野生种中能使番茄果实变小袁而在栽培种中的
等位基因能使果实增大袁这个基因对番茄果重的影响
占整个果重变异的 猿园豫 袁是番茄果重进化中的一个关
键性基因咱源 耀 远暂 遥
花生是主要的油料作物之一袁但其产量相对较低袁
要提高花生的产量主要靠 圆 个途径院一是提高单株结
果数袁二是提高果重遥 花生品种资源遗传基础狭窄袁利
用常规育种方法难以大幅度提高花生的产量遥 而且栽
培花生是异源四倍体袁基因组庞大尧结构复杂袁基因组
猿圆员员
核摇 农摇 学摇 报 圆缘 卷
尚未测序袁利用图位克隆方法不能满足分离基因的需
求遥 近年来袁大量花生 耘杂栽 的测序袁为通过同源克隆
技术从花生中克隆基因提供了可能遥 本研究利用同源
克隆法在花生及其野生种中克隆了 枣憎圆郾 圆 基因袁并将
野生种中克隆的 枣憎圆郾 圆 基因转入花生栽培种袁为利用
基因工程手段调控花生荚果大小及其产量奠定基础遥
员摇 材料与方法
员郾 员摇 材料
供试花生栽培种鲁花 员员 号尧鲁花 员圆 号尧花育 圆猿
号和野生种 粤援 泽贼藻灶葬泽责藻则皂葬 均来自于青岛农业大学试
验田遥
责酝阅员愿鄄栽 载体尧 栽葬择 阅晕粤 聚合酶尧提取植物总
砸晕粤的 栽则蚤扎燥造试剂盒和反转录的 孕则蚤皂藻杂糟则蚤责贼 员泽贼 杂贼则葬灶凿
糟阅晕粤 杂赠灶贼澡藻泽蚤泽 运蚤贼试剂盒均购自大连 栽葬运葬砸葬公司遥
员郾 圆摇 方法
员郾 圆郾 员摇 阅晕粤和 砸晕粤 的提取摇 分别取花生叶片尧花器
和幼胚各 园郾 园缘早袁液氮速冻并研磨成粉末状袁分别用
悦栽粤月法和 栽则蚤扎燥造试剂盒提取 阅晕粤和 砸晕粤遥
员郾 圆郾 圆摇 枣憎圆郾 圆 基因的扩增 摇 以番茄 枣憎圆郾 圆 基因的
糟阅晕粤序列渊郧藻灶月葬灶噪 登录号院粤云圆远员苑苑源冤为信息探针袁
运用 月蕴粤杂栽 程序搜索花生 耘杂栽 数据库袁并对部分重叠
的 耘杂栽 进行拼接遥 根据花生品种汕油 缘圆猿 的拼接序
列 渊 郧藻灶月葬灶噪 登 录 号院 耘郧园圆愿苑员苑尧 耘杂苑缘愿圆员怨 和
耘杂苑远苑猿苑猿冤设计下列引物院
孕员院缘忆鄄郧郧粤栽悦悦栽粤栽郧栽粤栽悦粤粤郧悦粤郧粤粤郧粤粤栽悦鄄猿忆曰
孕圆院缘忆鄄悦栽郧悦粤郧郧粤栽粤粤粤栽郧粤粤郧栽悦粤粤悦郧郧郧粤悦鄄猿忆
取花生总 砸晕粤 员滋早袁采用 栽葬运葬砸葬 孕则蚤皂藻杂糟则蚤责贼 员泽贼
杂贼则葬灶凿 糟阅晕粤 杂赠灶贼澡藻泽蚤泽 运蚤贼反转录试剂盒合成 糟阅晕粤第
一链袁以 糟阅晕粤第一链产物为模板进行 砸栽鄄孕悦砸遥 反应
体系 圆缘滋造 包含 员园皂皂燥造 辕 蕴 栽则蚤泽鄄匀悦造 渊责匀愿郾 猿冤尧缘园皂皂燥造 辕
蕴 运悦造尧 员郾 缘皂皂燥造 辕 蕴 酝早悦造圆尧 员哉 的 栽葬择 酶尧 源灶皂燥造 辕 蕴凿晕栽孕尧园郾 源滋皂燥造 辕 蕴引物尧圆园灶早模板 糟阅晕粤或 阅晕粤遥 孕悦砸
扩增程序院 怨缘益 缘皂蚤灶曰怨缘益 猿园泽袁远员益 源园泽袁苑圆益 缘园泽袁猿缘
个循环曰苑圆益 员园皂蚤灶遥 孕悦砸产物经 员豫琼脂糖凝胶电泳
检测袁凝胶成像仪观察结果遥
员郾 圆郾 猿摇 序列测定及生物信息学分析摇 将获得的 孕悦砸
产物回收纯化后袁用 栽源 阅晕粤 连接酶与 责酝阅员愿鄄栽 载体
连接袁转化 耘援 糟燥造蚤 菌株 阅匀缘琢 感受态细胞袁涂布于含
陨孕栽郧尧载鄄早葬造 和氨苄青霉素的 蕴月 固体培养基上培养尧
筛选袁挑取白色单菌落于含 员园园皂早 辕 蕴 氨苄青霉素的
蕴月液体培养基中培养袁提取质粒袁经 孕悦砸 和双酶切鉴
定为阳性后袁送上海生物工程公司进行序列测定遥 利
用 晕悦月陨 渊 澡贼贼责院 辕 辕 憎憎憎援 灶糟遭蚤援 灶造皂援 灶蚤澡援 早燥增冤 的 月蕴粤杂栽
软件对测序结果进行分析袁氨基酸序列多重比对和进
化树分析采用 悦造怎泽贼葬造 宰和 阅晕粤酝粤晕软件遥
员郾 圆郾 源摇 植物表达载体的构建摇 用 月葬皂 匀玉和 孕泽贼玉双
酶切测序正确的阳性质粒和表达载体 责悦粤酝月陨粤圆猿粤袁
经 员豫琼脂糖凝胶电泳袁回收纯化目的基因片段和载
体片段遥 用 栽源 阅晕粤 连接酶连接 圆 个片段袁构成责悦粤酝月陨粤圆猿粤鄄枣憎圆郾 圆 重组质粒袁转化 耘援 糟燥造蚤 菌株
阅匀缘琢感受态细胞袁涂布于含 陨孕栽郧尧载鄄早葬造 和卡那霉素
的 蕴月固体培养基上培养尧筛选袁挑取白色单菌落于含
缘园皂早 辕 蕴卡那霉素的 蕴月 液体培养基中培养袁对获得的
重组 质 粒 进 行 孕悦砸 和 双 酶 切 鉴 定遥 然 后 将
责悦粤酝月陨粤圆猿粤鄄枣憎圆郾 圆 重组质粒经冻融法转化农杆菌菌
株 耘匀粤员园缘 感受态细胞遥
员郾 圆郾 缘摇 转化花生摇 挑取转入 责悦粤酝月陨粤圆猿粤鄄枣憎圆郾 圆 质
粒的农杆菌单菌落袁转接于 猿园皂造 再耘月渊缘园皂早 辕 蕴卡那霉
素袁缘园皂早 辕 蕴利福平冤液体培养基中袁圆愿益袁圆园园则 辕 皂蚤灶 培
养至 韵阅远园园抑园郾 缘 耀 园郾 愿遥 以花育 圆猿 号成熟种子的子叶
为外植体进行遗传转化袁利用 员园园 耀 员缘园皂早 辕 蕴 卡那霉
素作为筛选压遥
员郾 圆郾 远摇 转基因植株的 孕悦砸 鉴定 摇 参考单世华等方
法咱圆怨暂采用 悦栽粤月法分别提取花育 圆猿 号野生型和转基
因苗幼叶的 阅晕粤袁以其为模板袁以 猿缘杂启动子和 枣憎圆郾 圆
基因序列为上下游引物进行 孕悦砸反应遥
员郾 圆郾 苑摇 半定量 砸栽鄄孕悦砸 分析 摇 以 糟阅晕粤 第一链产物
为模板袁以花生 粤糟贼蚤灶为内标袁扩增引物序列为院
孕猿院缘忆鄄悦栽郧粤郧悦郧栽郧粤粤粤栽栽郧栽粤粤郧郧郧鄄猿忆曰
孕源院缘忆鄄栽郧悦栽粤粤粤粤栽粤郧粤粤悦悦栽悦悦粤粤栽悦悦鄄猿忆
粤糟贼蚤灶 基因 孕悦砸 扩增程序院 怨缘益 缘皂蚤灶曰怨缘益 猿园泽袁
缘圆益 源园泽袁苑圆益 缘园泽袁圆愿 个循环曰苑圆益 员园皂蚤灶遥 枣憎圆郾 圆 基
因扩增程序同 员郾 圆郾 圆袁孕悦砸循环数 猿圆 个遥
圆摇 结果与分析
圆郾 员摇 阅晕粤和 砸晕粤的提取
提取花生幼胚的 阅晕粤 和 砸晕粤袁电泳检测结果见
图 员遥 由图 员 可知院所提 阅晕粤可以满足 孕悦砸扩增的需
求曰所提 砸晕粤 经凝胶电泳后可见 圆愿杂尧员愿杂 和 缘杂 猿 条
清晰条带袁完整性较好袁可以用于下一步的反转录和
砸栽鄄孕悦砸扩增遥
圆郾 圆摇 花生 枣憎圆郾 圆 基因的克隆
根据在汕油 缘圆猿 中拼接好的序列袁在两端设计
孕悦砸引物袁分别以栽培种鲁花 员员 号尧鲁花 员圆 号和野生
种 粤援 泽贼藻灶葬泽责藻则皂葬的花生幼胚总 阅晕粤和 糟阅晕粤第一链
源圆员员
摇 远 期 花生 枣憎圆郾 圆 基因的克隆及遗传转化
图 员摇 花生 阅晕粤和 砸晕粤的检测
云蚤早援 员摇 阅晕粤 葬灶凿 砸晕粤 贼藻泽贼 燥枣 责藻葬灶怎贼
摇 摇 摇
为模板袁在花生中分别扩增出了大小约为 苑缘园遭责 渊图
圆鄄粤冤和 远园园遭责的片段渊图 圆鄄月冤遥
回收扩增的目的片段袁连接到 责酝阅员愿鄄栽 载体上袁
将连接产物通过热激法转化 耘援 糟燥造蚤 菌株 阅匀缘琢 感受
态细胞袁挑取白斑菌落进行 孕悦砸 鉴定渊图 猿鄄粤冤遥 由图
猿鄄粤可知袁从白斑菌落能够扩增出 远园园遭责 的目的片段遥
从白斑菌落提取重组质粒袁用 耘糟燥砸玉和 匀蚤灶凿芋进行双
酶切鉴定渊图 猿鄄月冤袁由图 猿鄄月可知袁重组质粒能够切出
载体和 远园园遭责 的目的片段遥 上述结果表明袁 枣憎圆郾 圆 基
因已经连接到克隆载体 责酝阅员愿鄄栽上遥
图 圆摇 花生 枣憎圆郾 圆 基因的 孕悦砸和 砸栽鄄孕悦砸扩增
云蚤早援 圆摇 孕悦砸 葬灶凿 砸栽鄄孕悦砸 葬皂责造蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣 枣憎圆郾 圆 早藻灶藻 蚤灶 责藻葬灶怎贼
粤院 孕悦砸扩增产物曰 月院砸栽鄄孕悦砸扩增产物曰 酝院 酝葬则噪藻则 阅蕴圆园园园曰 员院鲁花 员员 号曰
圆院鲁花 员圆 号曰 猿院粤援 泽贼藻灶葬泽责藻则皂葬曰 源院 对照
粤院责则燥凿怎糟贼 燥枣 孕悦砸曰 月院责则燥凿怎糟贼 燥枣 砸栽鄄孕悦砸曰 酝院 酝葬则噪藻则 阅蕴圆园园园曰
员院 蕴怎澡怎葬 员员曰 圆院蕴怎澡怎葬 员圆曰 猿院粤援 泽贼藻灶葬泽责藻则皂葬曰 源院 糟燥灶贼则燥造
图 猿摇 重组质粒的鉴定
云蚤早援 猿摇 陨凿藻灶贼蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣 则藻糟燥皂遭蚤灶葬灶贼 责造葬泽皂蚤凿泽
粤院 孕悦砸鉴定曰 酝院 酝葬则噪藻则 阅蕴圆园园园曰 员院 对照曰 圆 耀 缘院 菌落曰 月院 酶切鉴定曰
酝院 酝葬则噪藻则 阅蕴圆园园园曰 酝员 院 酝葬则噪藻则 阅蕴员缘园园园曰 员 耀 源院 重组质粒
粤院 孕悦砸 蚤凿藻灶贼蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶曰 酝院酝葬则噪藻则 阅蕴圆园园园曰 员院 糟燥灶贼则燥造曰 圆 耀 缘院 糟燥造燥灶蚤藻泽曰
月院 凿蚤早藻泽贼藻凿 蚤凿藻灶贼蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶曰 酝院 酝葬则噪藻则 阅蕴圆园园园曰
酝员院 酝葬则噪藻则 阅蕴员缘园园园曰 员 耀 源袁 则藻糟燥皂遭蚤灶葬灶贼 责造葬泽皂蚤凿泽
圆郾 猿摇 花生 枣憎圆郾 圆 基因的测序及分析
将野生种 粤援 泽贼藻灶葬泽责藻则皂葬 和栽培种鲁花 员员 号尧鲁
花 员圆 号 枣憎圆郾 圆 基因片段的重组质粒进行测序袁所克隆
的 阅晕粤 片段长分别为 苑圆圆尧苑圆愿 和 苑圆苑遭责袁与对应的
糟阅晕粤序列相比袁都有 圆 个内含子袁编码区长都为
缘缘缘遭责袁编码 员愿源 个氨基酸渊图 源冤袁其中从野生种 粤援
泽贼藻灶葬泽责藻则皂葬 中扩增出的 糟阅晕粤 序列为 缘苑怨遭责遥 从图 源
可以看出袁栽培种鲁花 员员 号尧鲁花 员圆 号与野生种
枣憎圆郾 圆 基因相比袁在外显子处都有碱基突变袁鲁花 员员
号尧鲁花 员圆 号分别有 员 个和 缘 个氨基酸发生改变遥 另
外袁野生种 粤援 泽贼藻灶葬泽责藻则皂葬 与栽培种渊汕油 缘圆猿 未进行
阅晕粤测序冤的 阅晕粤序列相比袁第 圆 个内含子缺少 远 个
碱基渊源员猿 耀 源员愿遭责袁注册号院允云源怨怨愿猿员冤遥
参照魏兆军咱苑暂 尧周生茂咱愿暂的方法对 枣憎圆郾 圆 基因进
行生物学分析遥 将花生野生种 粤援 泽贼藻灶葬泽责藻则皂葬 枣憎圆郾 圆 基
因编码的氨基酸序列与大豆渊粤悦哉员源源员缘冤尧葡萄渊载孕赃
园园圆圆愿源愿员怨郾 员冤尧拟南芥 渊 晕孕 赃员苑圆怨源园郾 员 冤尧蓖麻 渊 载孕 赃
园园圆缘圆苑苑苑愿郾 员冤尧杨树 渊 载孕 赃园园圆猿员缘怨缘园郾 员冤尧水稻 渊 晕孕 赃
园园员员苑猿远怨怨郾 员 冤尧 番 茄 渊 粤云圆远员苑苑源 赃 员 冤尧 玉 米
渊粤阅陨源愿源圆源郾 员 冤尧 高 粱 渊 载孕 赃 园园圆源缘源园远猿郾 员 冤尧 鳄 梨
缘圆员员
核摇 农摇 学摇 报 圆缘 卷
渊粤阅粤苑园猿远园郾 员冤尧小立碗藓渊载孕赃园园员苑愿圆员远员郾 员冤等植物 枣憎 圆郾 圆基因编码的氨基酸序列进行多重序列比对渊图
图 源摇 枣憎圆郾 圆 基因在不同花生材料的核苷酸差异比较
云蚤早援 源摇 杂怎皂皂葬则赠 燥枣 灶怎糟造藻燥贼蚤凿藻 凿蚤枣枣藻则藻灶糟藻 蚤灶 葬造蚤早灶藻凿 泽藻择怎藻灶糟藻泽 燥枣 枣憎圆郾 圆 早藻灶藻 蚤灶 责藻葬灶怎贼
短扛表示缺失遥
凿藻造藻贼蚤燥灶泽 葬则藻 蚤灶凿蚤糟葬贼藻凿 遭赠 泽澡燥则贼 凿葬泽澡藻泽
图 缘摇 花生与其他植物 枣憎圆郾 圆 氨基酸序列的同源比较
云蚤早援 缘摇 悦燥皂责葬则蚤泽燥灶 燥枣 枣憎圆郾 圆 葬皂蚤灶燥 葬糟蚤凿 泽藻择怎藻灶糟藻 葬皂燥灶早 责藻葬灶怎贼 葬灶凿 燥贼澡藻则 责造葬灶贼泽
粤澡院 花生曰 郧皂院 大豆曰 灾增院 葡萄曰 粤贼院 拟南芥曰 砸糟院 蓖麻曰 孕贼院 杨树曰 韵泽院 水稻曰 杂造院 番茄曰
在皂院 玉米曰 杂遭院 高粱曰 孕葬院 鳄梨曰 孕责院 小立碗藓遥 下图同遥
粤澡院 粤则葬糟澡蚤泽 澡赠责燥早葬藻葬曰 郧皂院 郧造赠糟蚤灶藻 皂葬曾曰 灾增院 灾蚤贼蚤泽 增蚤灶蚤枣藻则葬曰 粤贼院 粤则葬遭蚤凿燥责泽蚤泽 贼澡葬造蚤葬灶葬曰 砸糟院 砸蚤糟蚤灶怎泽 糟燥皂皂怎灶蚤泽曰
孕贼院 孕燥责怎造怎泽 贼则蚤糟澡燥糟葬则责葬曰 韵泽院 韵则赠扎葬 泽葬贼蚤增葬曰 杂造院 杂燥造葬灶怎皂 造赠糟燥责藻则泽蚤糟怎皂曰 在皂院 在藻葬 皂葬赠泽曰 杂遭院 杂燥则早澡怎皂 遭蚤糟燥造燥则曰
孕葬院 孕藻则泽藻葬 粤皂藻则蚤糟葬灶葬曰 孕责院 孕澡赠泽糟燥皂蚤贼则藻造造葬 责葬贼藻灶泽援 栽澡藻 泽葬皂藻 葬泽 枣燥造造燥憎蚤灶早 贼葬遭造藻援
远圆员员
摇 远 期 花生 枣憎圆郾 圆 基因的克隆及遗传转化
缘冤袁并用 灶藻蚤早澡遭燥怎则鄄躁燥蚤灶蚤灶早渊晕允冤法构建系统发生进化树
渊图 远冤袁结果表明在进化上花生与大豆的 枣憎圆郾 圆 基因
亲缘关系最近袁一致性达到 远远郾 愿缘豫 袁与其他物种的一
致性也在 缘园豫左右遥
图 远摇 不同生物 枣憎圆郾 圆 基因的进化树分析
云蚤早援 远摇 粤灶葬造赠泽蚤泽 枣燥则 贼澡藻 责澡赠造燥早藻灶藻贼蚤糟
则藻造葬贼蚤燥灶泽澡蚤责 燥枣 枣憎圆郾 圆 早藻灶藻
圆郾 源摇 植物表达载体的构建和鉴定
用 月葬皂 匀玉和 孕泽贼玉分别酶切带有野生种 粤援
泽贼藻灶葬泽责藻则皂葬 枣憎圆郾 圆 基因 糟阅晕粤 片段的克隆载体和植物
表达载体 责悦粤酝月陨粤圆猿粤袁酶切产物纯化后用 栽源阅晕粤连
接酶连接袁转化 耘援 糟燥造蚤 阅匀缘琢 感受态细胞袁挑取单克
隆袁提取质粒进行 孕悦砸和双酶切鉴定遥 由图 苑 可以看
出袁重组质粒扩增出了 缘苑怨遭责的基因片段袁用 月葬皂 匀玉
和 孕泽贼玉进行双酶切后袁获得了目的条带和大约 员园噪遭
的载体条带袁说明 枣憎圆郾 圆 基因已经连接到表达载体
责悦粤酝月陨粤圆猿粤 中袁 该 植 物 表 达 载 体 命 名 为
责悦粤酝月陨粤圆猿粤鄄枣憎圆郾 圆遥
圆郾 缘摇 枣憎圆郾 圆 基因的遗传转化尧再生及鉴定
选取花育 圆猿 号成熟种子袁经表面消毒后袁去种皮
和胚轴袁将每片子叶切成 圆 半袁在转入 责悦粤酝月陨粤圆猿粤鄄
枣憎圆郾 圆 表达载体的农杆菌中侵染 员园皂蚤灶 后袁置于添加
圆袁源鄄阅和苄氨基嘌呤渊月粤孕冤的 酝杂 诱导培养中共培养
猿凿遥 然后将外植体转移到添加 圆缘园皂早 辕 蕴 头孢霉素的
诱导培养基上培养袁诱导丛生芽遥 将形成丛生芽的外
植体转移到添加 月粤孕尧圆缘园皂早 辕 蕴头孢霉素尧员园园皂早 辕 蕴卡
那霉素的培养基上培养 圆 周左右后袁将卡那霉素浓度
增加至 员缘园皂早 辕 蕴袁进行抗性芽的筛选及诱导芽伸长渊图
愿冤袁最终共得到 猿源 个抗性苗遥 提取抗性植株的总
阅晕粤进行 孕悦砸检测袁从中鉴定出 员圆 个独立的阳性转
化子袁初步表明带有 枣憎圆郾 圆 基因的片段已转入花生基
因组中遥
图 苑摇 责悦粤酝月陨粤圆猿粤鄄 枣憎圆郾 圆 植物表达载体的鉴定
云蚤早援 苑摇 陨凿藻灶贼蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣 责造葬灶贼 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 增藻糟贼燥则
责悦粤酝月陨粤圆猿粤鄄 枣憎圆郾 圆
酝院 酝葬则噪藻则 阅蕴圆园园园曰 员院 对照曰 圆 耀 缘院 重组质粒援
酝员 院 酝葬则噪藻则 阅蕴员缘园园园曰 员 耀 源院 重组质粒
酝院 酝葬则噪藻则 阅蕴圆园园园曰 员院 糟燥灶贼则燥造曰 圆 耀 缘院 则藻糟燥皂遭蚤灶葬灶贼 责造葬泽皂蚤凿泽曰
酝员 院 酝葬则噪藻则 阅蕴员缘园园园曰 员 耀 源院 则藻糟燥皂遭蚤灶葬灶贼 责造葬泽皂蚤凿泽
图 愿摇 花生遗传转化
云蚤早援 愿摇 孕则燥糟藻泽泽 燥枣 责藻葬灶怎贼 贼则葬灶泽枣燥则皂葬贼蚤燥灶
粤院 共培养 猿凿的子叶外植体曰 月院 培养 圆 周的子叶外植体曰
悦院 添加 员园园皂早 辕 蕴卡那霉素培养基上筛选的抗性芽渊培养 源 周冤曰
阅院 员缘园皂早 辕 蕴卡那霉素培养基上筛选的抗性苗渊培养 远 周冤
粤院 责藻葬灶怎贼 藻曾责造葬灶贼泽 燥枣 糟燥贼赠造藻凿燥灶 糟燥蚤灶糟怎遭葬贼藻凿 枣燥则 猿凿 曰 月院 糟燥贼赠造藻凿燥灶泽
蚤灶糟怎遭葬贼藻凿 枣燥则 圆憎藻藻噪泽曰 悦院 则藻泽蚤泽贼葬灶贼 泽澡燥燥贼泽 泽藻造藻糟贼藻凿 怎灶凿藻则 员园园皂早 辕 蕴
运葬灶葬皂赠糟蚤灶 渊源憎藻藻噪泽冤曰 阅院 则藻泽蚤泽贼葬灶贼 泽藻藻凿造蚤灶早泽 泽藻造藻糟贼藻凿
怎灶凿藻则 员缘园皂早 辕 蕴 运葬灶葬皂赠糟蚤灶渊远憎藻藻噪泽冤
圆郾 远摇 枣憎圆郾 圆 基因的半定量 砸栽鄄孕悦砸分析
选取花生野生种 粤援 泽贼藻灶葬泽责藻则皂葬 和栽培种鲁花 员员
号袁分别提取叶片尧花和开花后 猿园凿 的幼胚 砸晕粤袁各取
圆滋早进行反转录遥 取反转录得到的 糟阅晕粤 员滋造袁分别用
扩增 粤糟贼蚤灶 和 枣憎圆郾 圆 基因的引物进行半定量 砸栽鄄孕悦砸
分析袁扩增产物用 员豫的琼脂糖凝胶电泳进行检测渊图
怨冤遥 由图 怨 可以看出袁枣憎圆郾 圆 基因在花和叶片中的表
达量较低袁而在幼胚中的表达量较高袁且在野生种 粤援
泽贼藻灶葬泽责藻则皂葬的表达量明显高于在栽培种鲁花 员员 号的
苑圆员员
允燥怎则灶葬造 燥枣 晕怎糟造藻葬则 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 杂糟蚤藻灶糟藻泽
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图 怨摇 枣憎圆郾 圆 基因在野生种 粤援 泽贼藻灶葬泽责藻则皂和栽培种鲁花 员员 号
的半定量 砸栽鄄孕悦砸分析结果
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员院 叶片曰 圆院 花曰 猿院 幼胚
员院 造藻葬枣曰 圆院 枣造燥憎藻则曰 猿院 蚤皂皂葬贼怎则藻 藻皂遭则赠燥
表达量遥
猿摇 讨论
本研究以番茄 枣憎圆郾 圆 基因的序列为探针袁利用花
生 耘杂栽数据库筛选同源序列并进行拼接遥 根据花生
的 耘杂栽拼接序列设计引物进行 孕悦砸和 砸栽鄄孕悦砸 扩增袁
在野生种中分别获得大小为 苑圆圆遭责 和 缘苑怨遭责 的条带遥
与其他物种的氨基酸序列进行比对袁同源性为
猿源郾 苑愿豫 耀远远郾 愿缘豫 遥 半定量 砸栽鄄孕悦砸 结果表明袁枣憎圆郾 圆
基因在野生种的表达量高于栽培种袁初步表明它在花
生的荚果形成中可能是一个负调控因子遥 近年来在水
稻中克隆了多个和产量性状有关的数量性状基因袁如
郧宰圆尧郧杂猿 和 郧宰缘咱员园 耀 员圆暂 袁它们都对产量性状起负调控
作用遥 根据本研究对野生种和栽培种中该基因的测序
结果分析看袁这种表达差异可能是由于编码区的突变袁
也有可能是由基因上游启动子的调控区造成的袁在番
茄 枣憎圆郾 圆 基因和玉米的 贼藻燥泽蚤灶贼藻 遭则葬灶糟澡藻凿员 基因中也曾
发现这种现象咱猿袁员猿暂 遥 为了研究花生 枣憎圆郾 圆 基因的功
能袁本研究构建了带有 枣憎圆郾 圆 基因的植物表达载体
责悦粤酝月陨粤圆猿粤鄄枣憎圆郾 圆袁对花生进行了遗传转化袁并获得
了阳性再生植株袁该基因对花生荚果大小的影响还有
待继续研究遥
花生遗传转化所选择的外植体有子叶尧成熟胚和
胚小叶等遥 杂澡葬则皂葬 等以成熟花生种子的子叶为外植
体袁通过根癌农杆菌介导进行转化袁转化率达到 缘缘豫
以上咱员源暂 曰粤灶怎则葬凿澡葬等以子叶节为外植体袁通过根癌农
杆菌介导对花生进行转化袁郧哉杂 检测 猿员豫再生植株表
现为阳性咱员缘暂 遥 本研究中选择了花育 圆猿 号成熟种子的
子叶作外植体袁并在 杂澡葬则皂葬 等的研究基础上袁将侵染
时间由几秒钟延长至 员园皂蚤灶遥 共接种 缘园 个外植体袁在
未添加卡那霉素的诱导培养基上袁丛生芽诱导率达到
怨园豫以上袁经卡那霉素筛选获得 猿源 个抗性苗袁孕悦砸 检
测确定 员圆 个阳性的独立转化子遥
参考文献院
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基因的克隆尧序列及系统学分析咱允暂 援 核农学报袁 圆园园远袁 圆园 渊猿冤院
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咱 愿 暂摇 周生茂袁 王玲平袁 向摇 珣袁 韦本辉袁 李杨瑞袁 方锋学袁 韦威旭袁
曹家树援 山药 孕粤蕴 基因全长 糟阅晕粤 序列的克隆尧表达与分析
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咱圆园暂摇 王摇 瑛袁 王维国袁 李凤梅袁 谢立青袁 狄少杰袁 兰李桥援 杏仁辐射
杀虫卫生标准研究咱 允暂 援 辐射研究与辐射工艺学报袁 员怨怨圆袁 员园
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咱圆员暂摇 程新胜袁 王方晓袁 魏重生援 从 悦韵砸耘杂栽粤指南谈我国烟草仓库熏
蒸灭虫实践咱悦暂 援 武汉院 中国烟草学会 圆园园源 年学术年会论文
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渊上接第 员员圆愿 页冤
咱 怨 暂摇 刘摇 峰袁 单世华袁 闫彩霞袁 毕玉平袁 李光敏袁 伦伟志援 花生子叶
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圆猿缘 原 圆源远
渊责任编辑摇 王媛媛冤
园员圆员