全 文 ：文章编号 :100028551 (2009) 042621205
匍匐翦股颖匍匐茎愈伤组织的诱导
王培佳　贾玉芳　陈逸锋　陈　曙　柴明良
(浙江大学园艺系 , 浙江 杭州　310029)
摘 　要 :离体再生体系的建立是植物基因工程的重要前提。以匍匐翦股颖 ( Agrostis palustris Huds) 栽培品
种L293 细叶突变体的匍匐茎为外植体 ,比较了不同消毒方法对外植体进行消毒的效果 ,以及生长调节
剂配比、蔗糖浓度、固化物种类等因子对愈伤组织诱导的影响。结果表明 :外植体适宜的消毒方法为
75 %乙醇处理 60s 后 ,再用 011 % HgCl2 处理 6min ;与 011 %细胞分裂素配合使用时 ,2 ,42D 对愈伤组织诱
导的效果好于 NAA 和 IBA ; 2mgΠL 2 ,42D 和 011mgΠL 62BA 的组合最利于愈伤组织的诱导 ,诱导率为
7410 % ;蔗糖浓度为 40gΠL 时愈伤组织诱导率最高 ,为 6215 % ;与 Agar A、Agar B 和 Canageenen 相比 ,
Phytagel 作为固化物时 ,愈伤组织诱导率最高 ,可达 6719 %。
关键词 :匍匐翦股颖 ;匍匐茎 ;愈伤组织诱导 ;植物生长调节剂 ;固化物
CALLUS INDUCTION FROM STOLONS OF CREEPING BENTGRASS
WANG Pei2jia 　J IA Yu2fang 　CHEN Yi2feng 　CHEN Shu 　CHAI Ming2liang
( Department of Horticulture , Zhejiang University , Hangzhou , Zhejiang 　310029)
Abstract :Establishment of regeneration system in vitro is the important prerequisite for plant gene engineering. The stolons of
fine2leave variant of cv. L293 of creeping bentgrass (Agrostis palustris Huds) were used as explants for the experiment . The
effects of different sterilizing protocols on material sterilization were compared , and the effects of combinations of plant growth
regulators , sucrose concentrations , and gelling agents on callus induction from the explants were systematically studied. The
results showed that the optimum sterilizing protocol was in 75 % ethanol for 60s , then in 011 % HgCl2 for 6min. When
combination with 011 % cytokinin , the effect for callus induction of 2 ,42D was better than that of NAA or IBA. Among the 16
concentration combinations of 2 ,42D and 62BA , the combination of 2mgΠL 2 ,42D and 011mgΠL 62BA showed the best result
with 7410 % callus induction rate. Among the 6 concentrations of sucrose , 40gΠL showed the best , with 6215 % callus
induction rate. Compared with Agar A , Agar B and Canageenen , Phytagel had the best effect for callus induction , with
6719 % callus induction rate.
Key words :creeping bentgrass ; stolon ; callus induction ; plant growth regulator ; gelling agent
收稿日期 :2008212220 　接受日期 :2004204202
作者简介 :王培佳 (19842) ,女 ,山东临沂人 ,硕士 ,研究方向为园林植物与观赏园艺。
通讯作者 :柴明良 (19642) ,男 ,浙江安吉人 ,副教授 ,研究方向为园林植物与观赏园艺。Tel :0571286971036 ; E2mail :mlchai @zju. edu. cn　　离体再生体系的建立是开展植物基因工程的重要前提。草坪草大多是单子叶植物 ,较难建立离体再生系统 ,成熟和已分化的组织难以产生具有再生潜力的细胞团。故草坪草通常是用种子或偶尔用芽等无性器官诱导愈伤组织 ,作为遗传转化的受体材料。匍匐翦股颖是高尔夫球场果岭最常用的草坪草 , 以植株低矮和质地细密而著称。匍匐翦股颖以种子为外植体的离体再生体系已经比较完善[1 ,2 ] ,而以其他器官为外植体诱导愈伤组织的研究却没有系统的报道。本试验以匍匐翦股颖栽培品种 L293 细叶突变体的匍匐茎为外植体 ,研究了生长调节剂配比、蔗糖浓度、固化物种类等对匍匐茎诱导愈伤组织的影响 ,旨在建立
126　核 农 学 报　2009 ,23 (4) :621～625Journal of Nuclear Agricultural Sciences
和优化该细叶突变体的离体培养再生体系 ,为通过遗
传转化进一步改良该突变体打下基础。
1 　材料和方法
111 　试验材料
以匍匐翦股颖 ( Agrostis palustris Huds) 栽培品种 L2
93 细叶突变体的匍匐茎为材料。该突变体是以匍匐
翦股颖栽培品种L293 的种子诱导愈伤组织 ,经过长期
培养后从再生植株中筛选出的 ,经过 3 年多田间栽培
试验 ,性状稳定 ,叶片宽度仅为原品种的 2Π3。
112 　试验方法
11211 　不同消毒时间处理对葡匐茎段消毒效果的影
响 　从温室采集匍匐翦股颖细叶突变体匍匐茎的前 1
～3 节 ,经自来水洗净后 ,切成带节的茎段 ,每段含 1
个节位 ,节位于茎段的中部 ,茎段长约 015cm。外植体
置于烧杯中 ,先加 1～2 滴吐温 ,再用 75 %乙醇消毒 ,倒
掉乙醇后用 011 %HgCl2 消毒 ,然后用无菌水冲洗 3～5
次 ,在超净台上 ,用无菌滤纸吸干水分 ,转入含蔗糖
40gΠL 的愈伤组织诱导培养基 MS + 2mgΠL 2 ,42D 中。
培养基预先用 Agar Bacteriological Grade (简称 Agar B)
513gΠL 固化 ,调 pH值至 518 ,并 121 ℃灭菌 15min。
用 75 %乙醇消毒 ,设 30、60、90 和 120s 4 个处理时
间 ,011 % HgCl2 消毒设 4、6、8 和 10min 4 个处理时间。
将乙醇与 HgCl2 的各个消毒时间组合成 16 种处理 ,每
处理 3 次重复 ,每重复接种 16 条匍匐茎段。暗培养 7d
后统计外植体污染情况。
11212 　生长调节剂配比对愈伤组织诱导的影响 　以
MS + 40gΠL 蔗糖 + 513gΠL Agar B 为基本培养基 ,分别
添加 NAA、IBA、2 ,42D 和 62BA、KT、TDZ ,设 9 种生长调
节剂组合 (见结果中表 3) 。其中 IBA、KT、TDZ 高压灭
菌后添加。每组合处理 3 次重复 ,每重复接种 16 条匍
匐茎段。暗培养 30d 后统计愈伤组织诱导率 ,愈伤组
织诱导率 = 诱导出愈伤的匍匐茎段数Π接种的匍匐茎
段数。
11213 　2 ,42D 和 62BA 配比对愈伤组织诱导的影响 　
以 MS + 40gΠL 蔗糖 + 513gΠL Agar B 为基本培养基 ,设
2 ,42D 的浓度分别为 110、115、210 和 215mgΠL ,62BA 的
浓度分别为 010 、011、012 和 014mgΠL。将 2 ,42D 与 62
BA 各个浓度组合成 16 个处理 ,接种培养葡匐茎段。
每处理重复 3 次 ,每重复接种 16 条匍匐茎段。暗培养
30d 后统计愈伤组织诱导率。
11214 　蔗糖浓度对愈伤组织诱导的影响 　以 MS +
2mgΠL 2 ,42D + 513gΠL Agar B 为基本培养基。添加不同
蔗糖浓度 ,分别为 10、20、30、40、50 和 60gΠL ,接种培养
葡匐茎段 ,每处理 3 次重复 ,每重复接种 16 条匍匐茎
段。暗培养 30d 后统计愈伤组织诱导率。
11215 　固化物种类对愈伤组织诱导的影响 　以 MS +
2mgΠL 2 ,42D + 40gΠL 蔗糖为基本培养基。分别使用
Canageenen (卡拉胶) 、Agar A Bacteriological (简称 Agar
A) 、Agar Bacteriological Grade (简称 Agar B) 、Phytagel (表
1)等 4 种不同的固化物接种培养葡匐茎段 ,每处理 3
次重复 ,每重复接种 16 条匍匐茎段。暗培养 30d 后统
计愈伤组织诱导率。
表 1 　固化物的理化性质
Table 1 　Physical properties of four gelling agents
固化物种类
kinds of gelling agents
生产厂家
manufacturer
凝胶强度
gel intension
灰分
ash degree
干燥失重
weight2lessness 凝固温度solidifying temperature ( ℃)
Canageenen 上海众伟生化有限公司 — ≤20 % ≤14 % —
Agar A Bacteriological Bio Basic ,Canada 600～650gΠcm2 ≤410 % ≤212 % —
Phytagel Sigma ,USA — 915 % 27～31
Agar Bacteriological Grade Sanland International 900gΠcm2 615 % ≤10 % —
注 : —处表示生产厂家未提供数据。
Note : —mean no data provided by manufacturer.
113 　数据差异显著性分析
试验数据分析采用 DPS 分析软件 ,Duncan 多重比
较法 ,5 %水平差异。
2 　结果与分析
211 　消毒处理对匍匐茎段灭菌效果的影响
用乙醇和 HgCl2 对外植体进行消毒的时间要控制
恰当 (表 2) ,消毒时间过短 ,达不到良好的消毒效果 ,
在接种 3～4d 后大部分外植体表面及周边迅速形成真
菌、细菌菌落 ;消毒时间过长 ,外植体易死亡。由表 2
可以看出 ,在 16 种组合处理中 ,75 %乙醇消毒 60s 后
用 011 % HgCl2 消毒 6min 的组合效果最佳 ; 其次是
75 %乙醇消毒 90s 后用 011 %HgCl2 消毒 8min。
212 　生长调节剂配比对愈伤组织诱导的影响
226 核　农　学　报 23 卷
表 2 　不同消毒处理组合对匍匐茎段灭菌效果的影响
Table 2 　Effect of different sterilizing protocols
on sterilization of stolons
处理编号
No. of
treatment
75 %乙醇
灭菌时间
sterilizing times
of 75 % ethanol (s)
011 %HgCl2
灭菌时间
sterilizing times
of 011 %HgCl2 (min) 无菌外植体比例percentage ofasepsis explants( %)
1 30 4 2415h
2 30 6 6618bc
3 30 8 4416efg
4 30 10 3317gh
5 60 4 5210def
6 60 6 8915a
7 60 8 4414efg
8 60 10 4013fg
9 90 4 3918fg
10 90 6 6010bcd
11 90 8 7112b
12 90 10 2614h
13 120 4 3215gh
14 120 6 6713bc
15 120 8 5617cde
16 120 10 5011def
　　如表 3 所示 ,在不同生长调节剂配比的 9 种处理
中 , 2mgΠL 2 ,42D 和 011mgΠL 62BA 组合处理的愈伤组
织诱导率最高 , 为 3412 % ; 其次是 2mgΠL NAA 和
011mgΠL 62BA 的组合与 2mgΠL IBA 与 011mgΠL 62BA 的
组合 ,且 2 个组合处理的诱导率间无显著差异。与
NAA、IBA 相比 , 2 ,42D 对愈伤组织诱导的效果显著要
好 ;相比 KT 和 TDZ , 62BA 可有效促进愈伤组织的诱
导。3 种细胞分裂素中 , TDZ 对愈伤组织诱导的效果
最差。茎段诱导后 ,通常在节位形成愈伤组织 ,部分节
上的芽同时也会萌发伸长 (图 1) ,及时剪除萌发的嫩
梢有利于愈伤组织的生长。
表 3 　生长调节剂配比对匍匐茎段愈伤组织诱导的影响
Table 3 　Effect of combination of plant growth regulators
on callus induction from stolons
处理编号
No. of
treatment
生长调节剂配比
combination of plant growth regulators(mgΠL)
NAA IBA 2 ,42D 62BA KT TDZ 愈伤组织诱导率cllus inductionrate( %)
1 2 — — 011 — — 2112b
2 2 — — — 011 — 614d
3 2 — — — — 011 413de
4 — 2 — 011 — — 2010b
5 — 2 — — 011 — 713d
6 — 2 — — — 011 112e
7 — — 2 011 — — 3412a
8 — — 2 — 011 — 1210c
9 — — 2 — — 011 418de
　　注 :“ - ”表示未添加。
Note :“ - ”means no added.
图 1 　匍匐翦股颖匍匐茎愈伤组织的诱导
Fig. 1 　Callus induction from the stolon
segments of creeping bentgrass
213 　2 ,42D 和 62BA 配比对愈伤组织诱导的影响
由 2 ,42D 和 62BA 配成的 16 种浓度组合中 (表 4) ,
2mgΠL 2 ,42D 和 011mgΠL 62BA 组合处理后愈伤组织诱
导率最高 ,为 7410 % ;其次是 2mgΠL 2 ,42D 和 012mgΠL
62BA 组合 ,该处理下的愈伤组织诱导率为 5419 % ;再
次是 1mgΠL 2 ,42D 和 011mgΠL 62BA 组合 ,愈伤组织诱
导率为 4812 % ,说明愈伤组织诱导率除与 2 ,42D 和 62
BA 的浓度之比有关外 ,这两种植物生长调节剂各自对
愈伤组织诱导也有影响。从表 4 中还可看出 2 ,42D 和
62BA 的浓度较高时均不利于愈伤组织诱导。
表 4 　2 ,42D 和 62BA配比对匍匐茎段愈伤组织诱导的影响
Table 4 　Effect of combinations of 2 ,42D and
62BA on callus induction from stolons
处理编号
No. of
treatment
2 ,42D 和 62BA 配比
combinations of 2 ,42D and 62BA(mgΠL)
2 ,42D 62BA 愈伤组织诱导率callus inductionrate( %)
1 1 0 415g
2 1 011 4812c
3 1 012 3318d
4 1 014 1916f
5 115 0 1819f
6 115 011 2919de
7 115 012 817g
8 115 014 3110d
9 2 0 2314ef
10 2 011 7410a
11 2 012 5419b
12 2 014 1712f
13 215 0 718g
14 215 011 317g
15 215 012 1815f
16 215 014 719g
214 　蔗糖浓度对匍匐茎段愈伤组织诱导的影响
由表 5 可见 ,随着蔗糖浓度的升高 ,愈伤组织的诱
导率也逐渐升高 ,当蔗糖浓度为 40gΠL 时 ,愈伤组织诱
导率达到最高 (6215 %) ,之后随着浓度的升高 ,诱导率
反而下降。蔗糖除了提供愈伤生长的碳源外 ,还影响
326　4 期 匍匐翦股颖匍匐茎愈伤组织的诱导
了培养基的渗透压 ,从而对培养物的生长产生影响。
表 5 　蔗糖浓度对匍匐茎段愈伤组织诱导的影响
Table 5 　Effect of sucrose concentrations on
callus induction from stolons
处理编号
No. of treatment
蔗糖浓度
sucrose concentration
(gΠL) 愈伤组织诱导callus inductionrate( %)
1 10 1210d
2 20 2911c
3 30 4517b
4 40 6215a
5 50 4416b
6 60 2417c
215 　固化物种类对愈伤组织诱导的影响
不同固化物的物理性质、灰分含量、水中不溶物含
量不同 (表 1) ,使得匍匐茎段在含不同固化物培养基上
的愈伤组织诱导率和愈伤组织生长也有差异 (表 6) 。
表 6 　固化物种类对匍匐茎段愈伤组织诱导的影响
Table 6 　Effect of gelling agents on
callus induction from stolons
固化物种类
kinds of gelling agents
愈伤组织诱导率
callus induction rate ( %)
Canageenen 5913b
Agar A 3711c
Phytagel 6719a
Agar B 6215ab
　　由表 6 可见 ,不同固化物对匍匐茎段愈伤组织诱
导有明显的影响 ,诱导率最高的是 Phytagel ,其次是
Agar B ,再次是 Canageenen ,最差是 Agar A。试验中还
发现 ,在 Phytagel、Agar B、Agar A 培养基上诱导出的愈
伤组织比较大 ,个体比较均匀 ,继代培养后生长速度中
等 ;而在 Canageenen 培养基上形成的愈伤组织较小 ,但
继代生长很快。
不论是何种固化物培养基上获得的愈伤组织 ,继
代培养后均能获得良好的胚性愈伤组织 ,在 1Π2MS 培
养基上均可以再生成正常植株 (图 2) 。
3 　讨论
建立高效的离体再生体系是植物遗传转化成功与
否的关键。匍匐翦股颖商品品种一般采用种子繁殖 ,
但因具有发达的匍匐茎 ,在生产中也可采用无性繁殖。
以种子为外植体诱导愈伤组织、分离高效再生的胚性
愈伤组织的技术在匍匐翦股颖上已有大量的报道 ,并
成功地用于转基因试验[3～6 ] 。有个别报道还采用匍匐
茎为外植体直接进行转基因试验[7 ] ,但转基因植株存
在嵌合体的概率较大。目前还未有以匍匐翦股颖匍匐
茎为外植体 ,系统地研究愈伤组织诱导的报道。本试
验的结果 ,对改良少量无性繁殖的材料 ,尤其是对通过
体细胞无性系变异获得的少量株系的进一步改良提供
了重要的技术参考。
图 2 　匍匐翦股颖匍匐茎愈伤组织的再生
Fig. 2 　Plant regeneration from the callus induced from
the stolon segments of creeping bentgrass
包括草坪草在内的单子叶禾本科植物 ,在诱导愈
伤组织时最常用的生长素为 2 ,42D ,如结缕草、沟叶结
缕草均用 2 ,42D 从匍匐茎诱导愈伤组织[8～10 ] 。本试验
也表明 ,当 2 ,42D 浓度固定为 2mgΠL 时 ,与适量的细胞
分裂素配合 ,愈伤组织的诱导效果明显优于 NAA 和
IBA。
为获得较高的愈伤组织诱导率及获得再生能力较
好的胚性愈伤组织 ,通常是在添加 2 ,42D 的基础上 ,加
适量的细胞分裂素 , 如 62BA。本试验发现 , 2mgΠL
2 ,42D和 011mgΠL 62BA 组合的培养基愈伤组织诱导率
最高 ,表明生长素与细胞分素的绝对浓度及其比例影
响着愈伤组织的诱导。先前的报道[10 ] 及我们在沟叶
结缕草匍匐茎诱导愈伤组织的试验中 (待发表)也证实
了这一点。
糖类不仅为外植体提供能量 ,而且是外植体渗透
环境的主要调节者。蔗糖是组织培养中最常用的糖
类。本试验发现 ,蔗糖浓度为 40gΠL 时匍匐茎诱导愈
伤组织效果最好。高于或低于该浓度 ,诱导效果明显
下降。在组织培养中建议的蔗糖浓度一般为 30gΠL。
说明不同的植物材料、甚至在不同的培养时期进行蔗
糖浓度的比较仍然是必要的。
琼脂是最常用的固化物 ,但近些年来细菌多糖
Gelrite 和 Phytagel 以及从海洋红藻提取的多糖化合物
Canageenen (卡拉胶)也逐渐被使用。有研究表明 ,不论
在 Gelrite 还是琼脂固化的培养基上 ,都有 75 %的草地
426 核　农　学　报 23 卷
早熟禾种子形成了愈伤组织 ,说明固化物种类对愈伤
组织的诱导率没有影响 ;但用 Gelrite 固化的培养基上 ,
愈伤组织的鲜重和干重均为琼脂固化培养基的 2
倍[11 ] 。谢海燕等[12 ] 发现 ,只有在 Phytagel 作固化物的
培养基上 ,普通狗牙根种子形成了胚性愈伤组织。本
实验室在对 4 种草坪草种子愈伤组织的诱导试验中也
发现不同固化物的效果存在差异[13 ] 。本试验发现 ,愈
伤组织诱导率最高的是 Phytagel。Phytagel 对胚性愈伤
组织的发生和维持胚性能力正效应的原因并不清楚。
但是对其同类固化剂 Gelrite 的研究发现 , Gelrite 比琼
脂所含的生长抑制物质要少[14 ] ; Gelrite 可以防止香蕉
愈伤组织变色 ,而琼脂却不能 [15 ] 。还有研究表明 ,
Gelrite 比琼脂含有更多的无机成分 ,同时对某些阳离
子具有束缚作用[16 ] 。因此 ,对于离体培养比较困难的
草坪草 ,进行固化物种类及其浓度的筛选 ,以提高愈伤
组织的数量和质量是有重要意义的。
由于本试验采用的是匍匐茎 ,材料制备和灭菌等
过程耗时较长 ,难度较大 ,故未进行多因子的正交设计
来探讨各因子的最优配比 ,需在今后的试验中加强。
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