全 文 ：核 农 学 报 2011，25(3):0443 ～ 0447
Journal of Nuclear Agricultural Sciences
收稿日期:2010-09-02 接受日期:2010-12-20
基金项目:浙江省自然科学基金项目(Y3080081)，台州市科技计划项目(08XH02)
作者简介:蒋 明(1973-)，男，浙江嵊州人，博士，副教授，研究方向为植物发育生物学及其分子调控。E-mail:jiangming1973@ 139. com
文章编号:1000-8551(2011)03-0443-05
青花菜 BoCHS2 基因的克隆、表达和反义载体的构建
蒋 明1 苗立祥2 钱宝英1 魏冬梅1
(1. 台州学院生命科学学院，浙江 临海 317000;2. 浙江省农业科学院园艺研究所，浙江 杭州 310021)
摘 要:根据前期的研究结果设计 PCR 引物，从青花菜(Brassica oleracea var． italica)叶片基因组 DNA 和
cDNA 中克隆到了查尔酮合成酶基因，定名为 BoCHS2。BoCHS2 的基因组 DNA 全长为 1267bp，具一个
长度为 85bp 的内含子，基因编码区全长为 1182bp，编码 393 个氨基酸。基因序列已提交至 NCBI，登录
号为 HQ189776。与 BoCHS 相比，在核苷酸和氨基酸组成上的差异分别为 27bp 和 8 个氨基酸。RT-PCR
结果表明，在霜霉菌诱导下，叶片和子叶中 BoCHS2 的表达量增加。将 BoCHS2 片段反向插入到带有绿
色荧光蛋白基因的 pCAMBIA1300 载体中，成功构建了植物反义表达载体。
关键词:青花菜;查尔酮合成酶;BoCHS2;克隆;表达
CLONING，EXPRESSION AND ANTISENSE VECTOR CONSTRUCTION OF A CHALCONE
SYNTHASE GENE BoCHS2 FROM Brassica oleracea var． italica
JIANG Ming1 MIAO Li-xiang2 QIAN Bao-ying1 WEI Dong-mei1
(1. College of Life Science，Taizhou University，Linhai，Zhejiang 317000;
2. Institute of Horticulture，Zhejiang Academy of Agricultural Science，Hangzhou，zhejiang 310021)
Abstract:PCR primers were designed according to our previous research results． A chalcone synthase gene，designated
BoCHS2，was isolated from leaf genomic DNA and cDNA． Genomic DNA of BoCHS2 was 1267bp in length with an
intron of 85bp． The complete coding sequence was 1182bp in length encoding 393 amino acids． The gene sequence was
submitted to NCBI with an accession number of HQ189776. There were 27bp and 8 amino acids differences between
BoCHS2 and BoCHS at nucleotide and protein level，respectively． Expression analysis results showed an increase of
BoCHS2 transcription both in leaves and cotyledons while infected with Hyaloperonospora parasitica． Antisense segment
of BoCHS2 was inserted into a pCAMBIA1300 vector with green fluorescent protein gene and plant expression vectors
were successfully constructed．
Key words:Brassica oleracea var． italica;chalcone synthase;BoCHS2;cloning;expression
青花菜(Brassica oleracea var． italica)为十字花科
(Brassicaceae)芸薹属蔬菜，又叫西兰花、绿菜花、意大
利芥蓝和木立花椰菜等。青花菜的花梗和花球中富含
类黄酮物质、芥子油苷、多酚化合物、维生素、矿物质和
膳食纤维，具有抗病毒、抗氧化、抗衰老和助消化等作
用，营养价值丰富，深受人们的喜爱［1 ～ 4］。霜霉病是青
花菜 生 产 过 程 中 的 重 要 病 害，由 寄 生 霜 霉 菌
(Hyaloperonospora parasitica)引起，危害叶柄、叶片、花
梗和花球，导致品质和产量下降，严重影响青花菜的生
产和销售［5，6］。化学杀菌剂的使用增加了花球农药残
留的风险，最终影响出口创汇，而借助分子生物学技
术，通过抗病基因挖掘、遗传转化和品种选育等手段进
行种质创新是提高青花菜霜霉病抗性的重要途径，可
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有效解决抗病资源缺乏和育种周期长等问题［7］。
为抵御病原菌的侵染，植物在进化过程中形成了
一套复杂的防御机制［8］。在植物与病原菌互作过程
中，一系列的防卫反应被激活，类黄酮、酚类、萜类和生
物碱类物质大量产生，以阻碍或减缓病原菌在植物体
内生长和繁殖，与这些物质合成途径相关的基因在抗
病反应中起着重要的调控作用［9，10］。查尔酮合成酶
(Chalcone synthase，CHS)是类黄酮物质合成的关键
酶，它催化合成途径的第一步反应，在植物抗病反应中
起着至关重要的作用，近年来在查尔酮合成酶基因的
克隆、功能分析等方面进行了大量研究［11］。本实验室
已从青花菜子叶中克隆到了一个查尔酮合成酶基因
BoCHS［12］，本研究拟在此基础上，从青花菜中分离新
的 CHS 基因，并开展表达分析和载体构建工作，为进
一步研究其功能奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 植物材料
本试验采用的青花菜品种为“绿雄 90”，在 1 叶 1
心期通过喷雾方式接种霜霉菌，对照喷无菌水。接种
后 72h 时采集子叶、叶片、胚轴和根，其中子叶、叶片和
胚轴用 75%酒精擦拭，根用无菌水冲洗，液氮冷冻后
保存于 － 70℃冰箱备用。
1. 2 DNA 制备、RNA 提取和 cDNA 的合成
称取约 1g 叶片用于 DNA 提取，DNA 的制备采用
SDS 法;各取约 0. 1g 的子叶、叶片、胚轴和根用于 RNA
的提取，总 RNA 提取采用 TRIzol 法，TRIzol 试剂购
自 Invitrogen 公司;cDNA 合成试剂盒购自 TaKaRa 公
司，第一链和第二链的合成根据说明书进行。
1. 3 BoCHS2 基因的克隆
根据实验室前期克隆到的青花菜查尔酮合成酶
BoCHS 基因(登录号:GU266209)设计引物，P1:5’-
ATGGGCACGCCGTCTTC-3 ’ 和 P2: 5 ’-TCAAAGA
GGAACGCTGTGCAA-3’，在基因组 DNA 和 cDNA 中预
期获得的条带大小约 1250bp 和 1150bp。分别以叶片
DNA 和 cDNA 为模板进行 PCR 扩增，反应总体积为
20μl，含 1 × PCR Buffer，1U 的 Taq 酶(北京鼎国)，
0. 2μmol /L 的 dNTPs(上海生工)，各 0. 2μmol /L 引物
(北京鼎国)，模板 50ng。PCR 扩增程序为:95℃预变
性 4min;95℃变性 30s，58. 8℃退火 45s，72℃延伸 90s，
30 个循环后，72℃继续延伸 7min。PCR 产物经 1. 2%
琼脂糖凝胶电泳检测后割胶，用洁净刀片割取目的条
带所在胶块，置于 1. 5ml 离心管中备用。
1. 4 PCR 产物的回收、纯化和测序
PCR 产物回收纯化试剂盒购自 V-gene 公司，取
3μl PCR 回 收 产 物，克 隆 到 p-GEM T-easy 载 体
(Promega)，室温下连接 2h，将连接产物转入 DH5α 大
肠杆菌感受态细胞，恢复生长后涂布于 LB 固体培养
基，37℃培养 12h，挑取白色单菌落于 LB 液体培养基
中，37℃振荡培养 10h，菌液经 PCR 验证后各取 3 个阳
性克隆测序。
1. 5 基因的表达分析
根据测序结果，设计 RT-PCR 引物，分别为 P3:5’-
GAGAAGGCCATCAAAGAA-3 ’ 和 P4: 5 ’-
TCCGCTGACTTCCTCCT-3’。采用 1. 3 中的反应体系，
分别以 40ng 的处理和对照 cDNA 为模板进行 PCR 检
测，PCR 扩增程序为:95℃预变性 4min;95℃变性 30s，
50. 5℃退火 45s，72℃延伸 45s，32 个循环后，72℃继续
延伸 7min。PCR 产物经 1. 2%琼脂糖凝胶电泳检测，
重复 3 次。
1. 6 反义载体的构建
根据测序结果，设计两端带有酶切位点的上、下游
引物，P5:5’-CACGAGCTCACCTCAGGAG-3’和 P6:5’-
CAGTGCACAGCTGGCG -3’，分别带有 Sal I 和 Sam I
酶切位点。以 50ng 叶片 cDNA 为模板进行 PCR 扩增，
PCR 程序为:95℃预变性 4min;95℃变性 30s，55. 2℃
退火 45s，72℃延伸 60s，32 个循环后，72℃继续延伸
7min。PCR 产物经电泳、割胶后回收，经 Sal I 和 Sam I
双酶切 2h 备用。植物表达载体采用实验室保存的
pCAMBIA1300-GFP，该质粒的 35S 启动子与绿色荧光
蛋白基因之间带有 Sal I 和 Sam I 酶切位点，经双酶切
后，用 T4 DNA 连接酶将开环的 pCAMBIA1300-GFP 与
BoCHS2 片段反向连接。连接产物经转化 DH5α、涂
布、培养后挑单菌落，在 37℃振荡培养 10h，经 PCR 检
测后取 3 个阳性克隆测序鉴定。
2 结果与分析
2. 1 BoCHS2 基因的克隆与序列分析
以 P1 和 P2 为上、下游引物，分别以叶片 DNA 和
cDNA 为模板进行 PCR 扩增，获得了与预期大小一致
的条带。测序结果表明，基因组 DNA 和 cDNA 编码区
全长分别为 1267bp 和 1182bp，编码 393 个氨基酸(图
1)。基因定名为 BoCHS2，序列已提交 NCBI 数据库，
登录号为 HQ189776。BoCHS2 含一个长度为 85bp 的
内含子，位于 + 188 和 + 272 之间，内含子序列为
GTATGTCTTAACAAACCCTA CATTCTATTTCTGCATCT
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3 期 青花菜 BoCHS2 基因的克隆、表达和反义载体的构建
GTATTTTTGGCATATATATTTG CGCATATTTATTTAA-
CAGCTAACAG。序列比对表明，BoCHS 和 BoCHS2 在
核苷酸水平上存在 27bp 的差异，而在氨基酸水平上仅
8 个残基的差别，分别位于第 8、19、81、143、233、257、
281 和 301 位(图 2)。
图 1 青花菜 BoCHS2 基因的编码区全长序列及其推导的氨基酸序列
Fig． 1 Complete coding sequence and deduced amino acid sequence
of BoCHS2 gene from Brassica oleracea var． italica
2. 2 BoCHS2 的表达分析
以 P3 和 P4 为引物，分别用等量子叶、叶片、胚轴
和根的 cDNA 为模板进行 PCR 扩增，扩增结果如图 3
所示。BoCHS2 在对照和处理材料中均有表达，在霜
霉菌诱导下，子叶和叶片中 BoCHS2 的表达量均显著
增加，而根和胚轴中的表达量未见明显变化。
2. 3 反义载体的构建
目的 片 段 经 Sal I 和 Sam I 双 酶 切 后，与
pCAMBIA1300-GFP 载体连接，将反义片段插入到 35S
启动子与 GFP 之间(图 4)。重组载体经菌液 PCR 检
测，在 600bp 处有一条单一的亮带，产物的大小与预期
一致(图 5)，测序结果表明，BoCHS2 片段插入方向正
确、序列吻合，反义表达载体成功构建。
3 讨论
CHS 是类黄酮物质生物合成途径的关键基因，调
控着防御反应、色素合成和植物育性等生理生化过程，
在抗病、抗虫和花色形成等方面起着重要作用，是近年
的 研 究 热 点 之 一［11，13］。 已 从 棉 花 (Gossypium
hirsutum)、葡萄 (Vitis vinifera)、金荞麦 (Fagopyrum
cymosum)、银杏(Ginkgo biloba)和黄蜀葵(Abelmoschus
manihot)等植物中克隆到了 CHS 基因［14 ～ 18］;在十字花
科作物如甘蓝(B． oleracea var． capitata)、盘菜(B．
rapa ssp． rapa)、芥蓝(B． albograbra)、甘蓝型油菜(B．
napus)和青花菜(B． oleracea var． italica)中也有 CHS
基因克隆的报道［12］。
CHS 以多基因家族的形式存在，植物中往往存在
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图 2 BoCHS2 与 BoCHS 的氨基酸序列比较
Fig． 2 Amino acid sequence comparison between BoCHS2 and BoCHS
图 3 BoCHS2 基因在青花菜不同部位的表达
Fig． 3 Expression of BoCHS2 in different parts
of Brassica oleracea var． italica
A 和 C:人工接种和对照处理的表达模式;B 和 D:肌动蛋白内标;
RT:根;CN:子叶;LF:叶片;HL:胚轴
A and C:expression patterns of artificial inoculations and CK;
B and D:internal control of actin;RT:root;
CN:cotyledon;LF:leaf;HL:hypocotyl
多个序列上相近的 CHS 基因，在大豆(Glycine max)和
豌豆 (Pisum sativum)中，已 知 各 有 8 个 CHS 成
员［19，20］，三叶草(Trifolium subterraneum)中至少有 4 个
图 4 BoCHS2 基因反义表达载体的构建
Fig． 4 Construction of BoCHS2 antisense
expression vector
成员［21］，而堇菜属(Viola)植物中有 3 个成员［22］。
BoCHS2 是第 2 个从青花菜中克隆到的 CHS 基因，与
前期实验室克隆到的 BoCHS 有很高的同源性，两者在
核苷酸和蛋白质上仅存在个别碱基和氨基酸残基的差
别，基因序列已上传至 NCBI，登录号为 HQ189776。
CHS 的表达受病菌、紫外线、机械损伤和化学物质的诱
导［23 ～ 25］，在抗病反应中，CHS 是重要的防卫基因，它的
表达引起次生代谢物质的积累，甚至使细胞壁结构发
生变化以阻止病原菌的入侵［26］。本研究中，BoCHS2
的表达受到霜霉菌的诱导，但各部位的响应程度不同，
其中叶片和子叶的表达量增加，而根和胚轴中的表达
没有明显变化。BoCHS2 的克隆、表达和反义载体的
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图 5 反义表达载体的 RT-PCR 检测
Fig． 5 Detection of antisense
expression vector by RT-PCR
M:标准分子量;A:PCR 产物
M:Marker;A:PCR product
构建，为进一步研究该基因的特性、进化和功能奠定了
基础。
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(责任编辑 王媛媛)
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