全 文 ：核 农 学 报 2010，24(6):1286 ～ 1290
Journal of Nuclear Agricultural Sciences
收稿日期:2010-04-12 接受日期:2010-06-21
基金项目:国家自然基金重点项目(30830079)，国家自然科学基金(No. 30671419，30700541)，国家高技术研究发展计划 863 专项经费
(2008AA10Z150，2006AA10Z1A8，2006AA100108)
作者简介:魏 跃(1970-)，男，湖北黄石人，博士，副教授，研究方向为园艺植物遗传育种与分子生物学。E-mail:wyue12170059@ yahoo. cn
通讯作者:陈劲枫(1960-)，重庆人，男，教授，博士生导师，研究方向为园艺蔬菜遗传与育种。E-mail:jfchen@ njau. edu. cn
文章编号:1000-8551(2010)06-1286-05
甜瓜属野生种铝胁迫诱导基因 ChAI的克隆及序列分析
魏 跃1，2 王永平1 王全智1 史红林1 薄凯亮2 陈劲枫2
(1. 江苏农林职业技术学院，江苏 镇江 212400;2. 南京农业大学，南方蔬菜遗传改良重点开放实验室，江苏 南京 210095)
摘 要:应用同源序列克隆策略从铝盐胁迫处理的甜瓜属野生种(Cucumis hystrix Chakr.)叶片中获得了
612bp 的片段，通过在 EST 数据库进行同源检索，发现一条甜瓜 EST 序列 (GenBank 登录号:
AM724963. 2)与之高度同源，据此设计引物并经 RT-PCR 扩增和序列拼接，最后获得了铝诱导基因
cDNA 序列全长，命名为 ChAI (GenBank 登录号:FJ968438 )。序列分析表明该基因全长 967bp，其中开
放读码框(ORF)长 711bp 编码 236 个氨基酸组成的多肽，5′ 和 3′ 端非编码区长度各为 15bp 和 241bp。
DNAMAN 同源性分析表明该基因与葡萄、棉花、羊乳(轮叶党参)、白骨壤(真红树植物)、拟南芥等植物
的铝诱导蛋白的氨基酸序列具有 78. 6%以上的同源性。运用半定量 RT-PCR 技术对 ChAI 基因的转录
水平进行分析，根据该基因在铝胁迫下大量表达推测 ChAI 与耐铝盐胁迫响应相关，但具体耐铝胁迫机
制还有待深入研究。
关键词:甜瓜属野生种;表达序列标签;克隆;铝诱导
CLONING AND SEQUENCE ANALYSIS OF ALUMINUM-INDUCED GENE
ChAI FROM THE WILD CUCUMIS SPECIES (Cucumis hystrix Chakr.)
WEI Yue1，2 WANG Yong-ping1 WANG Quan-zhi1 SHI Hong-lin1
BO Kai-liang2 CHEN Jin-feng2
(1. Jiangsu Polytechnic College of Agriculture and Forestry，Zhenjian，Jiangsu 212400;
2. Key Laboratory of Southern Vegetable Crop Genetics Improvement，Nanjing Agricultural University，Nanjing，Jiangsu 210095)
Abstract:Degenerated primers were designed based on conserved amino acids region of aluminum-induced protein from
other plants，and a 612bp special fragment was amplified from the wild Cucumis species(Cucumis hystrix Chakr.)leaves
under aluminum stress through homologous strategy. Using this fragment sequence data as a querying probe，one highly
homologous melon EST sequence (Accession:AM724963. 2) was detected. Primers designed based on this EST
sequence，the full-length of aluminum-induced gene，designated as ChAI (GenBank Accession no:FJ968438 )，was
obtained by RT-PCR method and sequence assembling. Sequence analysis showed that ChAI was 967bp in length，which
encompassed an 711bp open reading frame (ORF)encoding 236 amino acid residues，and adjacent non-translation
15bp of 5′-terminal region and 241bp of 3′-terminal region，respectively. The results of DNAMAN homologous analysis
demonstrated that ChAI had more than 78. 6% identity of the amino acids residue with Vitis vinifera，Gossypium
hirsutum，Codonopsis lanceolata，Avicennia marina and Arabidopsis thaliana. The transcription analysis of ChAI by semi-
quantitative-PCR revealed the high expression under Al stress，the expression of ChAI was predicted to be related to anti-
Al stress responsive mechanism，but its accurate function and anti-Al stress mechanism were still elusive and needed to
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6 期 甜瓜属野生种铝胁迫诱导基因 ChAI 的克隆及序列分析
be further investigated.
Key words:Cucumis hystrix Chakr.;expressed sequence tags;clone;aluminum-induced
铝是地壳中的丰富金属元素，通常土壤中的铝以
硅酸盐或其他沉淀物形式存在，对植物无毒性。然而
在酸性土壤条件下(pH < 5)，铝的溶解度会大大增加，
主要以 Al3 +的形式对大多数植物产生毒害。生理学
研究表明，植物在受到铝毒胁迫时表现出多方面的应
对机制，如通过诱导有机酸的分泌、根际 pH 的提高、
磷酸盐的分泌、酚类物质的分泌和黏胶的分泌将大量
的铝拒于根表之外而免遭毒害［1 ～ 3］;通过细胞质中有
机酸、蛋白质及其他有机化合物对铝的螯合、液泡的区
室化［4］将已吸收的铝转化为无毒性或毒性很小的结
合形态，从而缓解乃至消除体内铝的毒害作用。
近年来植物在铝胁迫下的分子机制研究日益受到
重视，迄今为止，在大田作物如小麦、玉米中已有多个
铝胁迫诱导基因被克隆鉴定［5 ～ 9］，且多采用抑制差减
杂交 (suppression subtractive hybridization， SSH)技
术［10］，而在园艺蔬菜中有关耐铝胁迫基因的研究少有
报道。本研究利用甜瓜属野生种 (Cucumis hystrix
Chakr.)耐铝盐胁迫特性(另文发表)，采用同源序列
克隆策略并结合 EST 数据库信息对铝胁迫诱导基因
进行了克隆，为深入研究耐铝胁迫响应分子机制和利
用基因工程提高作物耐铝盐胁迫能力奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
供试 材 料 为 甜 瓜 属 野 生 种 (Cucumis hystrix
Chakr.)，种子由南京农业大学园艺学院黄瓜课题组提
供。
M-MLV 反转录酶、PMD － 19T Vector 载体、Taq 酶
均为 TaKaRa 公司产品，DNA 纯化试剂盒、宿主菌大肠
杆菌 TOP10购自天根公司，TRIZOL 为美国 BIPEC 公司
生产。
1. 2 材料处理
将甜瓜属野生种种子播于装有营养土的塑料钵
中，在苗期分为对照组(CK)和处理组 2 组，对照组浇
灌 Hoagland 培养液，处理组则在浇灌的 Hoagland 培养
液中加入 0. 1mol /L AlCl3(pH4. 3)，每隔 1 ～ 2d 浇灌 1
次，连续浇灌 3 次［11］，处理后 12、24 和 36h 分别对植
株叶片随机进行取样，液氮速冻后于 － 80℃下贮存用
于总 RNA 的提取。
1. 3 方法
1. 3. 1 甜瓜属野生种耐铝盐基因 ChAI cDNA 克隆
采用 TRIZOL 试剂法提取经铝胁迫处理叶片的 RNA，
以 Oligo (dT)14: 5′-GACTCGAG TCGAC ATCGA-
TTTTTTTTTTTTTT-3′［12，13］为反转录引物，M-MLV 反转
录酶合成第一链 cDNA。根据葡萄、棉花、羊乳(轮叶
党参)、白骨壤(真红树植物)、拟南芥等植物铝盐胁迫
诱导蛋白的保守氨基酸序列(RDRAPYP)设计 1 条上
游简并引物 S1:5′-GIGAYMGIGCICCITAYCC-3′，以
cDNA 为模板，S1 和 Oligo(dT)14为上下游引物进行
PCR 扩增，反应程序为:94℃ 3min;94℃ 30S，50℃
30S，72℃ 1. 5min，35 个循环;72℃ 10min。PCR 反应
体系为 50μl，各组分最终浓度为 0. 5μmol /L 引物，
0. 1mmol /L dNTP，1 × Taq polymerase buffer (含
MgCl2)和 1. 5U 的 Taq 聚合酶。将第 1 次 PCR 扩增产
物稀释 10 倍，取 2μl 做第 2 次 PCR 反应模板，反应程
序、体系与第 1 次相同，将 PCR 产物以 1%的琼脂糖凝
胶电泳检测和分离，用 DNA 纯化试剂盒纯化后连接到
PMD-19T Vector 中，转化到 TOP10感受态细胞，挑取单
菌落放大培养，同上条件下进行 PCR 扩增检测，挑取
阳性克隆由上海生工进行测序。
以取得的序列为信息探针，运行 BLAST 程序搜索
GenBank 的 EST 数据库，发现甜瓜 EST 序列(GenBank
登陆号:AM724963. 2)核苷酸序列与之有高达 99%同
源一致性，根据该 EST 序列和已获得的序列设计一对
上下游引物 S2:5′-TTTGAAAGTGAAGCCATG-3′和 A2:
5′-CACCGACTTTATTAAACC-3′，进行 PCR 扩增获得
930bp 片断。经过测序运用 ContigExpress 软件将 2 个
片断序列进行拼接，最终获得甜瓜属野生种铝盐胁迫
诱导基因 ChAI cDNA 序列。
1. 3. 2 生物信息学分析 序列开放阅读框的查找、氨
基酸翻译通过 ORF Finder 在线分析工具和 Primer 5. 0
软件进行;氨基酸的分子结构、理化性质等预测在
http:/ /www. expasy. org / tools / ProtParam 进行;跨膜结
构域通过 TMHMM 在线分析，信号肽和剪切位点由
Signal P 3. 0 预测;蛋白的二级结构通过 PHD 软件分
析，运用 DNAMAN 软件进行氨基酸同源性比较分析。
1. 3. 3 ChAI 在铝盐胁迫后不同处理时期叶片中的表
达分析 根据 ChAI cDNA 序列设计一对上下游引物，
上游引物为 S3:5′-TTTCGCCTTCATCGTCTTT-3′，下游
引物 A3:5′-CCTCATTAGCAGGAACAGC-3，以 actin 为
内标调整 cDNA 模板浓度，对 ChAI 在分别经过铝盐胁
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核 农 学 报 24 卷
迫 12、24 和 36h 后叶片中的表达水平进行半定量分
析，同时设立没有经铝盐胁迫处理叶片为对照。
2 结果与分析
2. 1 ChAI 基因的克隆
图 1 ChAI 基因的 cDNA RT-PCR 扩增产物
Fig. 1 RT-PCR amplification production
of ChAI gene
A:ChAI 基因的 3′端扩增片断;B:ChAI 基因的 5′端上游延伸扩
增片断;1:RT-PCR 的扩增产物;2、3:阴性对照;M:DL2，000
DNA 标准分子量
A:3′ end fragment of ChAI gene; B:5′ upstream sustainable
sequence of ChAI gene. Lane 1:product of RT-PCR;2，3:negative
control of RT-PCR;M:DL2，000 marker
以经过铝胁迫处理后叶片 cDNA 第一链为模板，
S1、Oligo(dT)14为 1 对上下游引物，通过 2 次 PCR 扩
增得到长度为 612bp 的片段(图 1 － A)，测序后以该序
列信息为探针在 EST 数据库搜索，发现 1 条与之高度
同 源 的 甜 瓜 EST 序 列 (GenBank 登 陆 号:
AM724963. 2)，根据该 EST 序列和已知的 612bp 序列
设计另 1 对上下游引物 S2、A2，通过 PCR 扩增反应获
得了序列长度为 930bp 的条带(图 1 － B)，经测序和比
对，该条带序列 3′端与第 1 次获得的 612bp 长度序列
有 575bp 的重叠区域(图 2)，表明第 2 次扩增是第 1
次获得序列 5′端的成功延伸。运用 ContigExpress 软
件将 2 条序列进行拼接，最终获得了长度为 967bp 的
甜瓜属野生种铝胁迫诱导蛋白基因 cDNA 序列，命名
为 ChAI(登录号为 FJ968438)。
2. 2 ChAI 基因分析
2. 2. 1 序列分析 通过 ORF Finder 等分析工具对
ChAI 序列进行分析(图 2)，起始密码子 ATG 的上游有
15bp 的 5′ 端非编码区(5′UTR)，终止密码子 TGA 下
游有 241bp 的 3′ 端非编码区(3′UTR)，序列末端有一
个 polyA 多聚核苷酸结构，在 polyA 上游 16bp 处有
‘AATAAA’，该序列为典型的加尾信号，这些特征都表
明获得的 ChAI 基因含有完整的开放阅读框(ORF)和
3′UTR。ProtParam 软件在线分析显示，ChAI 编码区长
度为 711bp，编码一条 236 个氨基酸的多肽。推测蛋
白分子量 25. 31kD，总原子数目为 3551，分子式为
C1134H1768 N300 O341 S8，理论等电点为 6. 08，属酸性蛋白，
GRA-VY(Grand average of hydropathicity)值为 0. 017，
表明其为疏水蛋白，摩尔消光系数为 21680，不稳定参
数为 37. 24，属较稳定蛋白。
2. 2. 2 蛋白结构预测及同源性比对 TMHMM 软件
分析显示 ChAI 无跨膜螺旋区，SignalP 3. 0 分析显示
其不含有信号肽、无信号锚定，最大断裂在 A19 ～ G20
间，其概率为 0. 031。用 PHD 软件分析蛋白的二级结
构，236 个氨基酸中有 112 个氨基酸具有卷曲(coil)构
象，占全长比率为 47. 46%，为该蛋白的构象主体;59
个氨基酸具有螺旋(helix)构象，比率为 25%;其余 65
个氨基酸具有伸展构象(strand )，比率为 27. 54%。
应用 DNAMAN 软件进行同源性比较分析，显示 ChAI
与一些已知高等植物的铝诱导氨基酸有 67. 8% ～
84. 3%的同源一致性(表 2)，其中与葡萄同源性最高，
为 84. 3%，其次是棉花为 82. 2%，与羊乳、白骨壤、拟
南芥 的 同 源 性 依 次 为 80. 9%、79. 7%、78. 6% 和
78. 6%，而与油棕同源性较低，只有 67. 8%。
表 2 ChAI 与其他物种铝诱导蛋白的相似性比较
Table 2 Alignment of ChAI with other plants
Al-induced proteins
物种
species
GenBank 登陆号
accession number
in GenBank
相似性
similarity (%)
葡萄 Vitis vinifera XP 002280658 84. 3
棉花 Gossypium hirsutum AAQ74889 82. 2
羊乳 Codonopsis lanceolata AAW02789 80. 9
白骨壤 Avicennia marina AAK50814 79. 7
拟南芥 Arabidopsis thaliana AAK64050 78. 6
拟南芥 Arabidopsis thaliana AAM44947 78. 6
芜青 Brassica rapa ABV89631 76. 3
油菜 Brassica napus BAA25999 74. 6
油棕 Elaeis guineensis ACF06515 67. 8
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6 期 甜瓜属野生种铝胁迫诱导基因 ChAI 的克隆及序列分析
图 2 ChAI cDNA 序列及推导的氨基酸序列
Fig. 2 ChAI cDNA and its deduced amino acid sequences
核苷酸序列中小写字母代表非编码区，大写字母为编码区;上面为核苷酸序列，下面为氨基酸序列;* 为终
止密码子，加框序列为加尾信号，箭头分别为 S1、S2、S3、A2、A3、Oligo(dT)14引物，下划线为二次测序的重
叠区域。
Lowercase of nucleotides represented untranslation region， capital represented translation region; above:
nucleotide sequences;below:amino acid sequences;Termination codon was marked by asterisks，polydenylation
signal was framed，arrow indicated primers S1，S2，S3，A2，A3 and Oligo(dT)14，respectively，overlapped region
in two sequencing was underlined
2. 3 ChAI 基因的半定量表达分析
以组成型表达基因 actin 为内标，运用半定量 RT-
PCR 技术对 CK 和铝胁迫后 12、24 和 36h 的 ChAI 在
叶片中的表达水平进行分析，结果(见图 3)表明对照
中 ChAI 的表达很微弱，而经过铝胁迫，ChAI 的表达在
12h 后就明显增强，36h 仍然保持较高的表达水平，表
明该基因可能与耐铝盐胁迫响应有关。
3 讨论
为获得基因的完整编码区序列和 5′、3′端非编码区序
列，一般使用昂贵的 Race 试剂盒，但有时克隆效果并
不理想。本试验采取简单、廉价的方法克隆 3′非编码
区序列，根据 mRNA 3′末端的 PolyA 特点设计含有 14
个连续 T 的反转录引物，再用此引物作为下游引物连
续 2 次进行 PCR 扩增，获得片断经过测序、筛选，最终
确定含有目的基因完整的 3′端非编码区序列片断，这
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图 3 ChAI 基因的半定量 RT-PCR 表达分析 .
Fig. 3 Expression analysis of ChAI gene
by semi-QRT-PCR.
1、2、3 分别为铝胁迫后 12、24 和 36h ChAI 的表达量
Lane 1，2，3 the expression of ChAI in 12，24，
36h after Al stress treatment，respectively
为克隆 3′UTR 序列提供了新的方法。
表达序列标签(Expressed Sequence Tags，EST)数
据库信息可以帮助进行克隆，具有简单、快速、针对性
强等优点，已成为一种广泛使用的基因克隆技
术［14，15］。本研究中由于受到 EST 数据库丰富度的限
制，探针基因没有搜索到甜瓜属野生种的相关同源序
列，但获得了核苷酸序列同源性极高、来自亲缘关系较
近的甜瓜 EST 序列，根据该序列设计引物成功获得了
部分 5′ UTR 和完整的编码区序列。虽然 5′端非编码
区序列不完整，但对研究基因功能和转基因利用没有
影响。这表明充分利用亲源关系相近物种的 EST 数
据库信息资源，可以加速目标物种基因的克隆。
本试验在前人研究基础上，通过同源序列克隆结
合利用 EST 数据库信息，以具有耐铝胁迫特征的甜瓜
属野生种(Cucumis hystrix Chakr.)为材料获得了 ChAI
基因的完整序列，所推导的氨基酸序列与其他一些物
种的铝诱导蛋白具有较高的同源性，根据其在铝胁迫
环境下大量诱导表达的情况，推测该基因与抗铝盐胁
迫响应相关，但其具体性质与功能还不清楚。虽然通
过相关软件对 ChAI 基因及其蛋白质结构进行了分析，
但目前还无法判断该基因是启动后续基因表达的某个
特定的初级调控因子，还是某种可以解除铝毒的大量
表达后续响应基因，其作用机理和具体功能等还需要
进一步鉴定和验证。
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(责任编辑 邱爱枝)
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