全 文 ：核 农 学 报 2011，25(3):0461 ～ 0468
Journal of Nuclear Agricultural Sciences
收稿日期:2010-10-08 接受日期:2010-12-24
基金项目:国家自然基金(31070244)，植物生理学与生物化学国家重点实验室开放课题(SKLPPBKF09011)
作者简介:李立芹(1974-)，女，山东东阿县人，博士，讲师，研究方向为植物逆境的分子生物学。E-mail:liliqin@ sicau． edu． cn
文章编号:1000-8551(2011)03-0461-08
烟草 WRKY12 基因的分离、表达与多克隆抗体的制备
李立芹1，2
(1. 四川农业大学农学院，四川 雅安 625014;2. 中国农业大学植物生理学与生物化学国家重点实验室，北京 100193)
摘 要:在高等植物中，WRKY 转录因子家族成员广泛参与植物的生长发育、代谢、生物胁迫和非生物胁
迫等生理过程的调控。本研究采用同源序列克隆的方法获得烟草 WRKY12 基因，序列分析表明，该蛋白
属于 WRKY 家族第 2 类成员，只有一个 WRKY 结构域，锌指结构为 C-X4-C-X23 -H-X1-H。构建系统发育
树结果表明，它与大豆中 GmWRKY6 和 GmWRKY12 亲缘关系较近，相似性分别达 50% 和 45%。
Northern Blot 试验证明该基因表达受 4℃低温胁迫诱导。将其完整编码区构建到大肠杆菌表达载体，在
培养温度 18℃条件下添加 0. 2mmol /L IPTG 诱导表达融合蛋白。进一步试验获得特异性和纯度非常高
的纯化蛋白和抗体。
关键词:烟草;WRKY;分离;序列分析;原核表达
ISOLATION，EXPRESSION AND ANTIBODY PREPARATION
OF WRKY12 FROM Nicotiana Tabacum K326 LINE
LI Li-qin1，2
(1. Agronomy Department，Sichuan Agricultural University，Ya’an，Sichuan 625014;
2. State Key Laboratory of Plant Physiololgy and Biochemistry，China Agricultural University，Beijing 100193)
Abstract:In higher plants，WRKY gene family plays significant role in transcriptional regulation． They are widely
involved in biotic stress，abiotic stress，growth，development and metabolism regulation． In this study WRKY12 from
tobacco was cloned by homology cloning． The deduced protein sequence showed that this protein belonged to the second
group of WRKY family and the zinc-finger structure is C-X4-C-X23 -H-X1-H． Phylogeny results showed WRKY12 was
much closer to GmWRKY6 and GmWRKY12 from bean，generated 50% and 45% amino acids similarity． Northern Blot
experiment showed that the gene expression was induced at 4℃ treatment． By SDS-PAGE analysis，the best expression
condition of WRKY12 was obtained when the host bacteria- E． coli Rosetta-gami B (DE3) was grown for 8h at
temperature 18℃ added 0. 2mmol /L IPTG． Further experiment generated the purified protein and antibody with high
specificity．
Key words:Nicotiana tabacum;WRKY gene;seperating;，sequence analysis;prokaryotic expression
WRKY 蛋白是近年来发现植物特有的一类重要
转录因子，该蛋白最初从甘薯中发现，当时命名为
SPF1［1］。后来从许多其他植物中也发现了这种蛋白。
迄今为止，已从拟南芥、野生马铃薯、棉花、水稻、烟草、
大麦、辣椒、油菜等分离出许多的 WRKY 蛋白［2 ～ 9］，这
类蛋白共同特点是在其 N 端含有高度保守的 60 个氨
基酸的 WRKY 结构域和 C-X4-5 - C-Xn-H-X-H /C(X 为
任一氨基酸)结构，属于锌指型(Zinc-finger type)转录
调控因子［10，11］。这类蛋白的 WRKY 结构域通过结合
靶基因启动子区域的 W 盒(T)TGACC(A /T)核苷酸
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核 农 学 报 25 卷
序列而调控相应基因的表达，发挥其重要的生物学功
能［11，12］。研究表明，WRKY 蛋白参与植物病菌信号转
导［13］、植物衰老［14］、生长发育［15］和非生物逆境等众多
生理过程［16，17］。
温度是自然界中影响植物生长与分布的限制因
子，而低温更是影响农作物产量和品质的重要因
素［18］。已有报道表明，一些 WRKY 蛋白参与低温胁
迫反应。大麦 WRKY38 基因在冷害和干旱胁迫中诱导
表达，表明其在这两种非生物胁迫信号转导过程中起
调控作用［19］;而从茄属植物(bittersweet nightshade)中
克隆的 67kDa WRKY 抗冻蛋白，在 11 和 12 月植物叶
中高表达，表明寒冷环境能诱导其表达并可能在植物
适应 寒 冷 环 境 中 起 作 用［20］。仇 玉 萍 等［21］ 采 用
Northern Blot 证 明，水 稻 中 有 7 个 WRKY 基 因
(OsWRKY8，12，13，14，17，23 和 45)的表达受低温
(4℃)逆境环境胁迫的诱导。拟南芥 WRKY34 在植物
成熟花粉细胞中特异表达，其表达量受低温胁迫诱导。
进一步研究表明，WRKY34 作为一个负转录调控因子
参与了成熟花粉粒对低温冷胁迫的响应［22］。
我国是一个烟草大国，烟草和卷烟产量均居世界
首位，烟草业在我国国民经济中占有重要的地位。
K326 品种 1985 年从美国引进，1989 年经全国烟草品
种审定委员会审定为推广品种。K326 是目前世界范
围内的主要栽培品种，它的优点是在香气质和量上优
于其他品种［23］。烟草属于喜温作物，温度低于 10℃
即不能正常生长［24］，利用基因工程等生物技术有目的
寻找其参与低温胁迫的优良基因，用于烟草遗传育种
研究，具有重要的研究意义。本研究首次报道从该品
种中 克 隆 出 与 低 温 胁 迫 相 关 的 WRKY12 基 因。
Northern Blot 试验证明，该基因表达受 4℃低温胁迫诱
导。在大肠杆菌中成功表达该蛋白的基础上，进一步
试验获得了特异性高的融合蛋白和相应抗体，为下一
步在体外研究该蛋白功能奠定重要基础。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
供试烟草 K326 种子由四川农业大学农学院提
供;以生长 30d 的烟草实生苗幼嫩叶片为材料进行
RNA 提取，大肠杆菌 DH5α 和 DE3、DNA 凝胶回收纯
化试剂盒购于天根生化科技(北京)有限公司;pMD19-
T 克隆载体、ExTaq DNA 聚合酶、T4 DNA 连接酶、反转
录酶购于大连宝生物工程公司。
1. 2 方法
1. 2. 1 提取烟草总 RNA 和反转录 采用 Trizol 法提
取总 RNA，然后反转录为 cDNA。反转录的反应体系
为 20μl，在 DEPC 水处理过的小管中依次加入下列组
分:Oligo dT 1μl;dNTPs(40mmol /L)1μl;RNA 5μg;补
水至 13μl，65℃变性 5min，迅速在冰上冷却至少 1min，
稍微 离 心，然 后 加 入:5 × First-Strand buffer 4μl;
0. 1mol /L DTT 1μl;SuperScriptTM II 反转录酶 1μl。反
应条件是 42℃反应 60min，70℃处理 15min。反转录产
物在 － 20℃保存备用。
1. 2. 2 扩增目的基因 根据 GenBank 公布的烟草
WRKY12 基因编码序列(登陆号 DQ460475)，利用
Primer Premier 5. 0 设计同源引物，WRKY12-F(5-
GGATCATGTTTGGCTCTTCCACTTT -3下划线处表示
酶切位点，以下同)和 WRKY12-R 引物(5-CCCGGG
TCACCACAAA GAATCTGCTA ATT-3)，该对引物可扩
增该基因的完整编码区。PCR 反应体系以 1μl cDNA
为模板，加入 10 × ExTaq 缓冲液 5μl(含 Mg2 + )，
WRKY12-F 和 WRKY12-R 各 1μl (10μmol /L )，
40mmol /L dNTP 0. 5μl，ExTaq DNA 聚合酶 0. 25μl(5
U /μl)，加水至 50μl。 PCR 反应条件:94℃ 预变性
5min;94℃变性 30s，55℃退火 30s，72℃延伸 1min，共
35 个循环;最后 72℃延伸 10min。PCR 产物于 1%琼
脂糖凝胶电泳检测。
1. 2. 3 基因克隆及测序 扩增产物经电泳检测后回
收目的片段，然后与 pMD19-T 载体 16℃连接过夜，连
接产物转化大肠杆菌 DH5α 感受态，然后在涂有氨苄
青霉素及 X-gal / IPTG 的 LB 平板上进行蓝白斑筛选，
挑取白色单克隆，进行菌落 PCR 检测。然后随机选取
3 个独立的阳性克隆进行测序(上海 Invitrogen 生物工
程技术服务有限公司)。
1. 2. 4 序列分析 基因的编码框用 NCBI 提供的在
线 ORF Finder 寻找(http:/ /www． ncbi． nlm． nih． gov /
gorf / gorf． html);核苷酸及氨基酸序列的同源序列搜索
由 NCBI 提供的在线 BLAST 进行(http:/ / blast． ncbi．
nlm． nih． gov);DNA 序列翻译、比对及系统演化树用
DNAMAN(6. 0 DEMO)进行。
1. 2. 5 在 4℃低温下的诱导表达 把烟草 K326 种子
播于 MS 培养基上，放入 28℃光照培养箱培养，光照强
度 1600lx，光周期 16h(光)/8h。生长 10d 的幼苗放入
4℃光照培养箱处理 1、3、6、12 和 24h，每个处理 3 个
重复，每个重复 10 棵幼苗，总共 30 棵。未进行低温处
理的幼苗作为对照，然后提取正常生长和低温处理材
料的 RNA，取 25μg 不同处理烟草总 RNA 于 65℃变性
10min，冰浴 5min，经甲醛变性胶 70V 电泳 2h 后转膜，
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3 期 烟草 WRKY12 基因的分离、表达与多克隆抗体的制备
探针采用该基因 CDS(编码区)，并采用同位素32 P 进
行标记，杂交过程参照分子克隆第二版。
1. 2. 6 原核表达载体的构建与鉴定 利用引物
WRKY12F 和 WRKY12R 对 1. 2. 3 中测序正确的质粒
进行 PCR 扩增并回收目的基因。纯化的 PCR 产物及
pGEX-4T-2 质粒分别用 BamHⅠ和 SmaⅠ进行双酶
切，回收纯化酶切片段，用 T4 DNA 连接酶 16℃连接过
夜，转化宿主菌 E． coli DH5α，蓝白斑筛选阳性克隆，进
行菌落 PCR 检测;用碱裂解法提取质粒，然后进行双
酶切和测序鉴定。
1. 2. 7 原核表达蛋白的诱导 经鉴定阅读框正确的
阳性重组质粒转化 BL21 感受态细胞，涂板挑菌，筛选
出阳性重组菌。在含氨苄青霉素的 LB 培养基中 37℃
振摇培养过夜后，取重组菌按 1 ∶ 100 体积比转接到含
氨苄青霉素的 LB 培养基中，37℃振摇培养至 OD 值达
0. 6 ～ 0. 8，菌液中加入终浓度为 0. 2 和 0. 5mmol /L
IPTG，分别在 37℃和 18℃下诱导表达，收集 1ml 菌液
分装于 1. 5ml 的离心管中，离心 5min，沉淀用 PBS(pH
7. 4)悬浮，再加入 5 × 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-
PAGE)上样缓冲液，水浴煮沸 5min，12000r /min 离心
5min，取上清进行 SDS-PAGE 电泳。聚丙烯酰胺胶采
用考马斯亮蓝法进行染色。
1. 2. 8 原核表达蛋白纯化 将诱导成功的 GST-
WRKY12 菌液按 1 ∶ 100 体积比转接于 5ml LB 液体培
养基中，37℃振摇培养过夜。将活化的菌液按 1∶ 50 的
接种量转接到 200ml 含氨苄青霉素的 LB 培养基中，
37℃培养至 OD 值达 0. 6 ～ 0. 8，加入诱导剂 IPTG 至终
浓度为 0. 2mmol /L，18℃继续诱导培养 8h。将诱导的
菌液离心收集于 50ml 离心管中，弃上清，加入含适量
溶菌酶的裂解液，吹匀后转到 50ml 离心管中。超声破
碎菌体，离心收集上清，然后加入适量已平衡好的谷胱
甘肽-Sepharose 4B 小颗粒，4℃结合 4h 左右，离心收集
结合有目的蛋白的谷胱甘肽-Sepharose 4B 珠子。用不
含溶菌酶的裂解液清洗非特异结合在谷胱甘肽-
Sepharose 4B 珠子上的杂蛋白，还原型谷胱甘肽洗脱
液洗脱 GST-WRKY12 融合蛋白。最后用 SDS-PAGE
分析 GST-WRKY12 融合蛋白纯度。纯化后蛋白冷冻
干燥保存于冰箱待用。
1. 2. 9 目的蛋白抗体制备和效价检测 纯化后的融
合蛋白免疫一只日本大耳白兔，1ml 蛋白溶液(约
500ug)与等量弗氏完全佐剂超声混匀制成乳化抗原，
在兔子脊柱两侧进行多点皮内注射。分别在免疫 2 和
4 周后用 500l(约 200μg)蛋白质加等量弗氏不完全佐
剂通过超声混匀，在脊柱两侧皮内注射加强免疫。免
疫 6 周后，颈动脉取血，分离抗血清。纯化的 GST-
WRKY12 融合蛋白常规方法进行 SDS-PAGE 电泳，电
压 100V，电泳时间 40min。然后用 ST-I 型半干式移电
泳仪将目的蛋白转到 NC 膜上。电压 15V，转移电泳
时间 20min。NC 膜用 5%脱脂奶封闭 1h 后，用 0. 5%
的奶粉洗 3 次，每次 10min，加入稀释 2000 倍的抗血
清 37℃孵育 1h，0. 5%的奶粉洗 3 次后，用辣根过氧化
物酶(HRP)标记的山羊抗 IgG (1 ∶ 10000)37℃孵育
1h，0. 5%的奶粉洗 3 次后进行显影。
2 结果
2. 1 目的基因的 PCR 扩增及克隆
用引物 WRKY12F 和 WRKY12R 对烟草 cDNA 进
行扩增，PCR 扩增产物用 1%琼脂糖凝胶电泳检测后，
可见 1 条约为 663bp 的条带(图 1)，采用切胶回收的
方法对该条带进行纯化后，与 pMD19-T 载体在 16℃进
行连接，随后对获得的阳性克隆随机挑选 3 个进行测
序。
图 1 烟草 WRKY12 基因扩增结果
Fig． 1 PCR production of WRKY12
from Nicotiana tabacum
2. 2 序列分析
核酸序列分析结果表明，该基因的开发阅读框为
663bp，编码 221 个氨基酸(图 2)。将 WRKY12 的氨
基酸序列在 NCBI 网站中的 Blast 进行在线比对，从中
选出同源性较高的 19 条氨基酸序列进行保守域分析，
通过比对从中选择同源性较高的 WRKY 结构域进行
作图，结果表明克隆的 WRKY12 含有 1 个保守 WRKY
结构域，即 WRKYGKK。在拟南芥 WRKY 基因家族
之中，除 了 大 部 分 WRKY 蛋 白 质 具 有 典 型 的
WRKYGQK 结构域外，尚有 3 个蛋白质的 WRKY 结构
域的氨基酸序列有别于其典型的结构域序列，即
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核 农 学 报 25 卷
WRKYGKK［25］;其锌指结构模式为 C-X4-C-X23 -H-X1-
C，属于 WRKY 家族的第 2 组(图 3)。20 个蛋白的氨
基酸序列(包括 WRKY12)构建系统发育树(图 4)表
明，该蛋白与来自大豆的 GmWRKY6(ABC26912. 1)和
GmWRKY21 (ABC26913. 1)聚为紧密一支，说明亲缘
关系较近，其相似性分别为 50%和 45%。
图 2 烟草 WRKY12 基因 CDS 序列及推导氨基酸序列
Fig． 2 CDS sequence and deduced amino sequence of tobacco WRKY12 gene
2. 3 WRKY12 受低温胁迫的诱导表达
根据系统进化树分析，WRKY12 与来自大豆
GmWRKY6 和 GmWRKY21 亲缘关系较近，聚为紧密一
个分支。采用 Northern Blot 验证 WRKY12 受低温诱导
表达情况，结果表明，WRKY12 的表达量在 4℃低温处
理 1 和 2h 没有明显变化;但在处理 3h 时表达量明显
增加，在处理 6、12 和 24h 后，表达量略高于 3h(图 5)，
但这 3 个时间点之间基因的表达量没有明显变化。说
明 WRKY12 能够在低温胁迫的早期响应这一生理过
程。
2. 4 原核表达载体的构建和重组子鉴定
利用 BamHⅠ和 SmaⅠ对 WRKY12-pMD19T 载体
和原核表达载体 pGEX-4T-2 进行双酶切，然后纯化酶
切产物并连接，构建重组表达载体。单克隆经菌落
PCR 检测，可扩增出 1 条 663bp 左右插入片段，与目的
片段(663bp)分子量相符;重组质粒经测序表明，与克
隆序列完全一致，开放阅读框正确。表明 WRKY12 的
原核表达载体构建成功。
2. 5 目的蛋白表达的 SDS-PAGE 分析和纯化
在 18℃下，添加 0. 2mmol /L IPTG 对含有重组质
粒的 E． coli(DE3)大肠杆菌进行诱导目的蛋白的表
达，结果表明添加 IPTG 诱导 8h，可获得大量的目的蛋
白。因此确定 WRKY12 蛋白诱导条件是 18℃下添加
0. 2mmol /L IPTG。WRKY12 蛋白分子量为 26. 5kD，加
上 GST-tag 标签蛋白 26kD，融合蛋白分子量应为
52. 5kD 左右，含有目的质粒的大肠杆菌经过诱导表达
出的蛋白分子量约 52. 5kD 左右，与理论值相符，而含
有空载体和未加 IPTG 的菌株未见表达蛋白(图 6)。
纯化的目的蛋白 SDS-PAGE 表明，纯化后融合蛋白约
为 52. 5kD(图 6)，条带特异性好，纯度高。
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3 期 烟草 WRKY12 基因的分离、表达与多克隆抗体的制备
图 3 WRKY12 蛋白与不同物种 WRKY 蛋白保守结构域比较
Fig． 3 Conserved protein domain between WRKY12 and WRKY protein from other species
2. 6 目的抗体效价检测
将得到的抗血清采用 Western 印迹法检测其效
价，用 PBS 缓冲液稀释 2000 倍的抗血清在与纯化的
蛋白免疫时能看到清晰的 1 条带(图 7)。根据蛋白
Marker 推算，该条带的分子量 52. 5kD，与理论值相符。
证明该条带是目的蛋白与抗血清免疫结果，而未加纯
化蛋白的泳道则无相应条带。由此证明得到的抗血清
特异性和效价比较高。
3 讨论
植物中 WRKY 蛋白结构的共同特点是含有 1 ～ 2
个 WRKY 结构域，结构域 C 端具有 1 个 C2H2 或 C2HC
的锌指结构。根据 WRKY 结构域的数目和锌指结构
的类型，WRKY 蛋白可分成 3 类:第 1 类含 2 个 WRKY
结构域，锌指结构模式为 C-X4-5 -C- X22-23 H-X-H，第 2
和 3 类均含 1 个 WRKY 结构域，第 2 类锌指结构模式
与第 1 组相同;第 3 类仅在组成锌指的氨基酸有变化，
C-X7-C-X22-23 -H-X-C
［10］。目前发现的 WRKY 蛋白大
多数都属于第 2 类，推测是第 1 类通过 WRKY 结构域
的丢失或分裂过渡到第 2 类，第 3 类可能是通过锌指
结构中的 H(组氨酸)转变成 C 残基产生的，因此在
WRKY 家族进化史中，第 1 类最为保守，第 2 类较为保
守，第 3 类最活跃［26］。目前在烟草中已报道的一些
WRKY 蛋白主要参与生物胁迫反应，NtWRKY11 被命
名 为 WIZZ (Wound-induced Leucine Zipper Zinc
finger)。WIZZ 基因产物在受到创伤 10min 内在原伤
害处积累，30min 达到高峰。WIZZ 基因定位在细胞核
中，表明该蛋白是一个参与创伤早期响应的 WRKY 转
录调控因子［27］。烟草 TIZZ 基因在烟草遭受烟草花叶
病毒侵染后诱发过敏反应启动时即刻表达。该基因编
码 1 条 258 个氨基酸的多肽。由于该基因的结构与
WIZZ 相似，因此命名为 TIZZ。通过 GFP 观察该蛋白
定位在洋葱表皮细胞的细胞核中。细菌性诱导表达的
TIZZ 蛋白能够与 W 盒元件结合，表明该 WRKY 蛋白
可能在防御体系激活中起着重要作用［28］。Nishiuchi
等研究表明，NtWRKY1、NtWRKY2 和 NtWRKY9 都包含
2 个 WRKY 结构，属于 WRKY 基因家族中的第 1
类［10］。在受创伤以后，3 个基因的表达形式不同，
NtWRKY1 和 NtWRKY2 表达量在受伤 10min 开始增加，
30min 达到高峰，而 NtWRKY9 表达量则一直维持在低
水平上［29］。NtWRKY3 和 NtWRKY9 受到 TMV 侵染和
SA 的诱导表达［6］，说明它们在抗病性和 SA 信号传导
途径中起作用。
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图 4 WRKY12 与不同物种 WRKY 蛋白的系统演化分析
Fig． 4 Phylogenetic analysis of WRKY12 and other WRKY protein from different species
At:拟南芥;Os:水稻;Ta:小麦;Bn:油菜;Nt:烟草;Hv:大麦;Zm:玉米;Lp:番茄;Gm:大豆
At:Arabidopsis thaliana;Os:Oryza sativa;Ta:Triticum aestivum;Bn :Brassica napus;Nt:Nicotiana tabacum;
Hv:Hordeum vulgare;Zm:Zea mays ;Lp:Lycopersicum esculentum;Gm:Glycine max
图 5 WRKY12 基因受 4℃低温诱导表达
Fig． 5 WRKY12 gene expression
induced by 4℃ treatment
目前关于烟草 WRKY 蛋白参与非生物逆境的研
究不多，Rizhsky 等报道 1 个烟草 WRKY 转录调控因
子在干旱和热激的协同作用下被特异地激活，但不被
单一逆境因子(干旱或热激)所诱导表达［30］，这预示着
该烟草 WRKY 基因在建立干旱和热激协同诱导(而不
是单一逆境因子诱导)的信号转导之中发挥重要作
用。通过保守氨基酸序列分析比对，本研究所克隆的
WRKY12 蛋白属于第 2 类，根据系统进化树分析，
WRKY12 与大豆 GmWRKY6 和 GmWRKY21 亲缘关系
较近，聚为紧密 1 个分支。GmWRKY6 的功能至今未
见报道，GmWRKY21 被报道参与低温胁迫反应［31］。
因此推测与其同源性高的 WRKY12 可能参与低温胁迫
生理过程，Northern Blot 试验证明在低温处理 3h 该基
图 6 GST-WRKY12 融合蛋白的 SDS-PAGE
Fig． 6 SDS-PAGE of expression of
GST-WRKY12 in BL21
M:marker;1:未诱导的空载体;2:未诱导的重组质粒;
3:用 0. 2mmol / L IPTG 诱导的空载体;4:用 0. 2mmol / L
IPTG 诱导的重组质粒;5:纯化目的蛋白
1:pGEX-4T-2 plasmid before induction;
2:recombinant plasmid before induction;3:pGEX-4T-2
plasmid induced by 0. 2mmol / L IPTG;4:recombinant
plasmid induced by 0. 2mmol / L IPTG;5:purified target protein
因的表达量明显上升，说明该基因与低温胁迫过程相
关。Marcel 等通过 EMSA 试验证明 WRKY12 可以结合
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3 期 烟草 WRKY12 基因的分离、表达与多克隆抗体的制备
图 7 WRKY12 抗血清的效价检测
Fig． 7 Check of antiserum
quality of WRKY12
1:纯化的 GST-WRKY12 蛋白用稀释 2000 倍
的抗血清免疫结果;2:未加蛋白只用稀释 2000 倍
的抗血清免疫结果;M:Marker
1:Western Blot with purified GST-WRKY12 diluted
2000 times with antiserum;2:Western Blot only
with antiserum diluted 2000 times
烟草中 PR-1a 启动子上的 WK 盒(TTTTCCAC)［32］，同
时这 2 个基因都是受 SA 诱导表达，通过二者共同转
化拟南芥原生质体，证明 WRKY12 可正向调控 PR-1a
的表达，说明 WRKY12 参与由 PR-1a 介导的防卫反应。
由此推测 WRKY12 可同时调控生物和非生物逆境等生
理过程。由于目前烟草基因组未公布，还不清楚该物
种有多少 WRKY 蛋白，但是随着基因组学和生物技术
的发展，将来会有更多的 WRKY 转录因子的信息被注
释。逆境胁迫下植物基因表达调控是一个复杂的网络
过程。目前对于烟草中 WRKY 转录因子参与的逆境
基因调控网络还不清楚，特别是在该网络中，调控
WRKY 基因表达的其他转录因子，WRKY 转录因子调
控的下游靶标，以及 WRKY 转录因子之间的互作等方
面的研究还较少，WRKY 蛋白中保守的 WRKY 结构域
可以结合启动子区域的 W 盒，因此所有启动子区域含
有 W 盒的基因都有可能是其靶基因。这其中包括
WRKY 基因本身。随着烟草基因组信息的日益完善和
转录组学、染色质免疫共沉淀等新实验技术的广泛应
用，寻找 WRKY 转录因子靶基因和全面阐明该家族转
录因子的功能将成为可能，这对于 WRKY 转录因子应
用于植物抗逆工程具有重要的意义。
4 结论
本研究首次报道从烟草 K326 品种中克隆出与低
温胁迫相关 WRKY12 基因，生物信息学分析表明，该基
因属于 WRKY 家族第 2 类成员，只含有 1 个 WRKY 结
构域，锌指结构 C-X4-C-X23 -H-X1-C。Northern Blot 试
验证明该基因的表达量在 4℃低温胁迫 3h 后明显增
加。说明该基因能够在早期响应低温胁迫。为进一步
研究该基因的功能，获得了高浓度的纯化蛋白和相应
抗体，这些为今后研究该蛋白生理生化功能奠定重要
基础。
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(责任编辑 王媛媛)
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