全 文 ：文章编号 :100028551 (2009) 022185208
黄淮麦区推广品种小偃 22 农杆菌遗传转化体系的建立
奚亚军1 　高海战2 　吕晓依1 　路　明3 　刘曙东1
(11 西北农林科技大学农学院 ,陕西 杨陵　712100 ; 21 咸阳市农业技术推广中心 ,陕西 咸阳　712000 ; 31 中国作物学会 ,北京　100081)
摘 　要 :小偃 22 小麦是目前陕西省生产上的主栽品种 ,在黄淮麦区和其他地区也大面积推广种植。本文
通过对小偃 22 小麦胚性愈伤组织的来源、生理状态和干燥时间 ,根癌农杆菌的接种浓度和侵染方式 ,AS
的添加浓度 ,胚性愈伤组织与根癌农杆菌的共培养温度和共培养时间 ,潮霉素的筛选浓度和筛选方式等
参数进行比较研究 ,建立了小偃 22 小麦农杆菌遗传转化体系。结果显示 ,以来源于幼穗的胚性愈伤组
织作为转化受体较为适宜 ,愈伤组织生理状态为从幼穗直接诱导 30d 后继代 1 次并培养 15d 的胚性愈
伤组织 ,农杆菌侵染前对胚性愈伤组织干燥处理 30min 较为适宜 ;农杆菌菌液浓度为 018OD ,采用抽真空
侵染 5min +非真空侵染 10min 的浸染方式 ,共培养温度为 22 ℃,共培养时间为 72h ,AS 的适宜添加浓度为
150μmolΠL ;筛选方式选用在抗性愈伤组织筛选阶段经 75mgΠL 潮霉素筛选后 ,在分化阶段不再进行筛选或
采用 25mgΠL 低浓度潮霉素筛选。通过重复转化验证试验和分子生物学鉴定 ,表明该遗传转化体系具有可
行性。
关键词 :小麦 ;小偃 22 ;农杆菌 ;遗传转化
GENETIC TRANSFORMATION SYSTEM OF WHEAT Xiaoyan 22 MEDIATED BY Agrobacterium tumefaciens
XI Ya2jun1 　GAO Hai2zhan2 　LV Xiao2yi1 　LU Ming3 　LIU Shu2dong1
(11 College of Agriculture , Northwest A &F University , Yangling , Shaanxi 　712100 ; 21 Center for Agrotechnology extension
of Xianyang , Xianyang , Shaanxi 　712000 ; 31 China Crop Associate , Beijing 　100081)
Abstract :The Xiaoyan 22 is the current main wheat variety in Shaanxi province and has been planted large2scale in other
Huanghuai wheat area also. Optimization of parameters , including embryonic callus in different resources , physiological status
and drying times , Agrobacterium tumef aciens in different concentrations and infection methods , AS in different concentrations ,
co2culture of embryonic callus and Agrobacterium tumef aciens in different times and temperatures , hygromycin in different
concentrations and selection methods were studied. And a genetic transformation system of Xiaoyan 22 mediated by
Agrobacterium tumef aciens was set up . The genetic transformation system was as follows : Firstly , the embryonic callus from
immature spikes and the physiological status of callus from immature spike about 30 days and sub2cultured 15 days was good
and the drying time was 30min before Agrobacteriu infection. Secondly , the concentration of Agrobacteriu was 0. 8OD and the
Agrowbacteriu infection time was 5min in the evacuation and 10min in the non2evacuation. Thirdly , the co2culture time was
72h and co2culture temperature was 22 ℃. Lastly , the AS concentration was 150μmolΠL , and 75mgΠL hygromycine
concentration in callus selection stage and 0mgΠL or 25mgΠL in cllus regeneration stage. The results showed that the genetic
transformaion system was feasible by the repeat transformation tests and molecular biology analysis.
Key words :wheat ; Xiaoyan 22 ; Agrobacterium tumef aciens ; genetic transformation
收稿日期 :2008208211 　接受日期 :2008211205
基金项目 :科技部国家转基因专项 (jy032b223202) ,西北农林科技大学青年学术骨干支持计划 (01140306) ,转基因生物新品种培育科技重大专项
(2008ZX080022003)
作者简介 :奚亚军 (19682) ,男 ,博士 ,教授 ,博士生导师 ,主要从事植物基因工程研究。E2mail :xiyajun11 @126. com
通讯作者 :刘曙东 (19582) ,男 ,教授 ,硕士生导师 ,主要从事作物遗传育种方面教学与科研工作。E2mail :liushd3251 @163. com
581　核 农 学 报　2009 ,23 (2) :185～192Journal of Nuclear Agricultural Sciences
　　自 1992 年 Vasil 等[1 ] 获得第一例转基因小麦以
来 ,许多研究者利用不同方法将多种基因导入小麦 ,获
得了一批转基因材料 ,在小麦遗传改良方面展示出良
好的应用前景[2 ,3 ] 。在诸多遗传转化方法中 ,农杆菌介
导的遗传转化体系因其具有转化的外源 DNA 结构完
整、遗传稳定、拷贝数低、转化的 DNA 片段较大等优
点 ,成为小麦基因转化的重要方法[4 ] 。然而 ,由于小麦
品种间遗传差异较大 ,农杆菌介导法在小麦转化上又
存在基因型限制 ,使得目前建立的农杆菌转化体系在
不同品种间应用时存在很大差异 ,从而增加了其转化
技术的复杂性和随机性[5 ] 。因此 ,针对小麦某一特定
品种进行遗传转化时 ,仍有必要对农杆菌转化体系的
各种影响因素进行研究。
小偃 22 因具有多穗多粒、结实性突出、品质优良、
增产潜力大、抗逆性强、适应性广等突出优点 ,成为继
小偃 6 号、陕 7859、陕 229 之后陕西省小麦第 6 次更新
换代的主栽品种和区域试验的对照品种 ,是迄今在陕
西省应用面积最大、适应范围最广的品种之一。同时 ,
黄淮麦区的其他地区如河南、安徽、江苏、山西等省也
在大面积推广种植。基于其在生产上的突出表现 ,小
偃 22 成为了育种工作的重要种质材料和基因转化的
主要受体目标之一。
本研究通过对愈伤组织的来源、生理状态和干燥
时间 ,根癌农杆菌的接种浓度和侵染方式 ,AS 的加入
浓度 ,愈伤组织和根癌农杆菌的共培养温度和共培养
时间 ,潮霉素的筛选浓度和筛选方式等参数的比较研
究 ,旨在建立小偃 22 农杆菌介导的遗传转化体系 ,为
通过转基因技术对小偃 22 进行遗传改良提供研究基
础和技术支持 ,并为其他小麦品种的农杆菌介导遗传
转化体系的构建研究提供参考。
1 　材料与方法
111 　材料
11111 　小麦材料 　供试品种小偃 22 由国家小麦改良
中心杨凌分中心小麦远缘杂交育种课题组提供。
11112 　菌株和转化载体 　农杆菌菌株为 EHA105 ,转
化载体为 pCAMBIA1301 ,均由澳大利亚 CAMBIA 实验
室提供。pCAMBIA1301 含有潮霉素 ( Hymgromycin) 抗
性基因 Hyg(R) ,卡那霉素 ( Kanmycin)抗性基因 Kan (R)
和 GUS 报告基因 ,结构简图如下 :
35sHygLBKan 35s GUS RB2
11113 　培养基 　本试验所用培养基及其成分如表 1
所示。
表 1 　本试验使用的培养基
Table 1 　Medium used in the examination
名称
medium name
培养基成分
medium composition
WMI1 MS + Proline 500mgΠL + Glntamin 500mgΠL + 2 ,42D 210mgΠL + 3 %Sucrose + 017 %Agarose ,PH 518
WMC1 MS + Proline 500mgΠL + Glntamin 500mgΠL + 2 ,42D 115mgΠL + 3 %Sucrose + 017 %Agarose ,PH 518
WMS1 MS + Proline 500mgΠL + Glntamin 500mgΠL + 2 ,42D 115mgΠL + 250 mgΠL Cefo + 3 %Sucrose + 017 %Agarose ,PH 518
WMX MS + Proline 500mgΠL + Glntamin 500mgΠL + 2 ,42D 115mgΠL , PH 518
WMR2 MS + Proline 500mgΠL + Glntamin 500mgΠL + KT 014mgΠL + 250mgΠL Cefo + 3 %Sucrose + 017 %Agarose ,PH 518
WMO 1Π2MS + 3 %Sucrose + 250mgΠL Cefo + 018 %Agarose ,PH 518
112 　方法
11211 　农杆菌的培养和一般转化方法 　挑取农杆菌
EHA105 一单菌落于含有 50mgΠL 卡那霉素和 25mgΠL
利福平的LB 培养基中 ,28 ℃,振荡培养至农杆菌菌株
浓度为 OD600 = 018～110 时加入 AS(乙酰丁香酮) 。离
心收集农杆菌后 ,以 WMX 培养基重新悬浮农杆菌。
将愈伤组织干燥后加入上述培养基中进行侵染。弃去
农杆菌菌液 ,将愈伤组织转入筛选培养基进行共培养。
将共培养后的愈伤组织转入含有潮霉素的新筛选培养
基 WMS1 ,24 ℃,暗培养。每 2～3 星期更换一次培养
基 ,共培养 6～8 星期。将筛选获得的抗性愈伤组织转
入含有潮霉素的分化培养基 WMR2 中 ,26 ℃,光照条
件下培养 5～8 星期。当再生苗长至 1～2cm 高时 ,转
入生根培养基 WMO 中 ,26 ℃,光照条件下培养 3～4 星
期至幼苗高度达 5cm 以上。移栽至温室进行分子生物
学方法检测。
11212 　不同来源愈伤组织的筛选试验 　取大小基本相
同 ,分别来自于幼胚、幼穗和成熟胚的 3 种胚性愈伤组
织各 100 个左右 ,重复 3 次 ,经相同条件的农杆菌侵染 ,
共培养和筛选培养 ,统计各自获得的抗性愈伤组织数。
11213 　不同愈伤组织生理状态的筛选试验 　取从幼
穗直接诱导 30d、45d ,幼穗诱导 30d 后 1 次继代 15d ,2
次分别继代 15d 的 4 种胚性愈伤组织各 100 个左右 ,
重复 3 次 ,采用相同条件的农杆菌侵染 ,共培养和抗性
681 核　农　学　报 23 卷
愈伤组织筛选 ,统计各处理的抗性愈伤组织频率 ,以选
择适合农杆菌侵染的小麦愈伤组织生理状态。抗性愈
伤组织频率 ( %) = 抗性愈伤组织数/ 处理的胚性愈伤
组织数 ×100 %。
11214 　农杆菌侵染前愈伤组织干燥时间的筛选试验
　取从幼穗直接诱导 30d 后 1 次继代 15d 的胚性愈伤
组织 ,在铺有 3 层无菌滤纸的培养皿中进行干燥处理 ,
干燥时间设置 0 ,30 ,60 和 90min 4 种 ,每处理接入 100
个左右的胚性愈伤组织 ,重复 3 次 ,采用相同条件的农
杆菌侵染 ,共培养和抗性愈伤组织筛选 ,统计各处理的
抗性愈伤组织频率。
11215 　农杆菌侵染菌液浓度的筛选试验 　用 WMX悬
浮培养基配制农杆菌侵染菌液 ,菌液浓度设置 OD 值
为 014 ,018 ,112 和 116 的 4 种处理 ,分别处理从幼穗直
接诱导 30d 后 1 次继代 15d、大小基本一致的胚性愈伤
组织各 100 个左右 ,重复 3 次 ,经相同条件的农杆菌侵
染 ,共培养和筛选培养 ,统计各处理的抗性愈伤组织
数。
11216 　农杆菌侵染方式的筛选试验 　农杆菌侵染方
式设置 3 种 : (1) 农杆菌真空侵染 5min + 非真空侵染
10min ; (2)农杆菌真空侵染 10min + 非真空侵染 20min ;
(3)农杆菌真空侵染 15min + 非真空侵染 30min。侵染
的愈伤组织为从幼穗直接诱导 30d 后 1 次继代 15d、大
小基本一致的胚性愈伤组织 ,每个处理接入 100 个左
右的胚性愈伤组织 ,重复 3 次 ,经相同条件的共培养和
筛选培养 ,统计不同处理的抗性愈伤数。
11217 　共培养时间和温度的筛选试验 　共培养设置
19 ℃,22 ℃和 25 ℃3 个温度梯度和 24 ,48 ,72 和 96h 四
个时间梯度 ,愈伤组织为从幼穗直接诱导 30d 后 1 次
继代 15d、大小基本一致的胚性愈伤组织各 100 个左
右 ,重复 3 次 ,经相同条件的农杆菌侵染和筛选培养 ,
统计各自处理获得的抗性愈伤数。
11218 　AS适宜浓度的筛选试验　AS浓度设置 50 ,100 ,
150μmolΠL 3 个水平 ,在侵染前 30min 加入到农杆菌菌液
中。每个处理接入 100 个左右的从幼穗直接诱导 30d 后
1 次继代 15d、大小基本一致的胚性愈伤组织 ,重复 3 次 ,
采用相同条件的农杆菌侵染 ,共培养和抗性愈伤组织筛
选 ,统计不同处理的抗性愈伤组织频率。
11219 　愈伤组织生长对潮霉素的敏感性试验 　潮霉
素浓度设置 0 ,25 ,50 ,75 ,100 ,125mgΠL 6 个水平 ,培养
基采用 WMS1 ,每个处理接入 100 个左右的从幼穗直
接诱导 30d 后 1 次继代 15d、大小基本一致的胚性愈伤
组织 ,重复 3 次 ,22 ℃暗培养 4 周 ,观察愈伤组织生长
情况。
112110 　筛选方式的选择 　以未经农杆菌侵染和潮霉
素筛选的从幼穗直接诱导 30d 后 1 次继代 15d、大小基
本一致的胚性愈伤组织为对照 ,筛选方式分为潮霉素
75mgΠL (抗性愈伤筛选阶段) + 0 (分化培养阶段) ,潮霉
素 75mgΠL (抗性愈伤筛选阶段) + 25mgΠL (分化培养阶
段) ,潮霉素 75mgΠL (抗性愈伤筛选阶段) + 50mgΠL (分
化培养阶段) ,潮霉素 75mgΠL (抗性愈伤筛选阶段) +
75 mgΠL (分化培养阶段) 4 种处理。采用相同条件的农
杆菌侵染 ,共培养和抗性愈伤组织筛选 ,统计各处理的
分化效率。分化效率 ( %) = 形成绿芽的愈伤组织数/
总愈伤组织数 ×100 %。
112111 　转化体系的确定和重复验证 　按照上述试验
建立的小偃 22 小麦农杆菌介导的遗传转化步骤 ,进行
3 次以上重复试验 ,验证该转化体系的可行性。
112112 　转化植株的分子鉴定
11211211 　PCR 检测　PCR 引物依据潮霉素 B 磷酸转
移酶序列设计。引物序列为 : Hpt 2R :5′2GCT GGG GCG
TCG GTT TCC ACT ATC GG23′, Hpt 2F : 5′2CGC ATA
ACA GCG GTC ATT GAC TGG AGC23′。PCR 反应条件 :
94 ℃预变性 2min →94 ℃40s ,60 ℃30s ,72 ℃1min ,30 个
循环 →72 ℃延伸 5min ,4 ℃保存。
11211212 　GUS 活性检测　抗性愈伤组织的 GUS 基因
表达的组织化学法检测参照 Rueb[6 ]的方法进行。
11211213 　RT2PCR 检测　RT2PCR 反应条件 :cDNA 合
成 30min ,94 ℃预变性 2min →94 ℃15s ,58 ℃30s ,68 ℃
1min ,40 个循环 →68 ℃延伸 5min ,4 ℃保存。
2 　结果与分析
211 　不同来源愈伤组织与农杆菌侵染
表 2 　不同来源愈伤组织的农杆菌侵染结果
Table 2 　The Agrowbacterium infection results
of different resource callus
愈伤组织来源
resource of callus
愈伤组织数 (块)
No1of callus 抗性愈伤数 (块)No1 of resistant
callus
抗性愈伤率
frequence of
resistant
callus( %)
幼胚
immature embyro 304 36 1118
幼穗
immature spike
307 45 1417
成熟胚
mature embyro
299 26 817
　　表 2 结果显示 ,不同来源的胚性愈伤组织经过相同
条件的农杆菌侵染 ,共培养和筛选培养 ,抗性愈伤组织
频率存在明显差异 ,表现为来源于幼穗的胚性愈伤组织
781　2 期 黄淮麦区推广品种小偃 22 农杆菌遗传转化体系的建立
的抗性愈伤组织频率最高 ,幼胚次之 ,成熟胚的最低 ,说
明采用农杆菌介导法转化小偃 22 小麦时 ,以来源于幼
穗的胚性愈伤组织作为转化受体可能较为适宜。
212 　愈伤组织不同生理状态与农杆菌侵染
表 3 　不同生理状态愈伤组织的农杆菌侵染结果
Table 3 　The Agrowbacterium infection results
of callus in different physiological status
愈伤组织状态
physiological
status of callus
愈伤组织数 (块)
No1 of
callus
抗性愈伤
组织数 (块)
No1of
resistant callus
抗性愈伤率
frequence of
resistant callus
( %)
1 307 45 1417
2 295 46 1516
3 319 58 1812
4 312 54 1713
注 :1 :幼穗直接诱导 30d 后的胚性愈伤组织 ;2 :幼穗直接诱导 45d 后的
胚性愈伤组织 ;3 :幼穗直接诱导 30d 后 1 次继代 15d 的胚性愈伤组织 ;
4 :幼穗直接诱导 30d 后 2 次分别继代 15d 的胚性愈伤组织。
Note : 1 ; the embryonic callus that produced from immature spike about 30 days ;
2 : the embryonic callus that produced from immature spike about 45 days ; 3 : the
embryonic callus that produced from immature spike about 30 days and then sub2
cultured 15 days ; 4 : the embryonic callus that produced from immature spike
about 30 days and then sub2cultured two times of each 15 days.
　　从表 3 可以看出 ,4 种不同生理状态的愈伤组织
获得的抗性愈伤率不同 ,其中以幼穗直接诱导 30d 后
1 次继代 15d 的胚性愈伤组织 (愈伤组织状态 3) 获得
的抗性愈伤率最高 ,幼穗直接诱导 30d 后 2 次分别继
代 15d 的胚性愈伤组织 (愈伤组织状态 4) 次之 ,幼穗
直接诱导 30d 的胚性愈伤组织 (愈伤组织状态 1) 的抗
性愈伤率最低。上述结果初步说明 ,采用农杆菌介导
法转化小偃 22 时 ,对胚性愈伤组织应该进行继代培
养 ,以调节愈伤组织的生理状态和提高愈伤组织的活
力 ,且以 1 次继代培养较为适宜。
213 　愈伤组织干燥时间与农杆菌侵染
表 4 　不同干燥时间的愈伤组织的农杆菌侵染结果
Table 4 　The Agrowbacterium infection results
of callus in different drying time
愈伤组织
干燥时间
drying time
(min)
愈伤组织数
(块)
No1 of
callus
抗性愈伤组织数
(块)
No1 of
resistant callus
抗性愈伤率
frequence of
resistant callus
( %)
0 289 44 1512 b B
30 290 55 1910 a A
60 302 47 1516 b B
90 294 42 1413 b B
注 :大写字母表示 1 %的显著水平 ,小写字母表示 5 %的显著水平。下表
同。
Note : Capital and normal letters show the significant difference at 1 % and 5 %
level , respectively. The same as the following tables.
　　表 4 结果表明 ,胚性愈伤组织在农杆菌侵染前进
行不同时间的干燥处理对获得抗性愈伤的数量存在明
显影响 ,表现为经 30min 干燥处理后的愈伤组织抗性
愈伤率明显高于未进行干燥处理的对照愈伤组织 ,
60min干燥处理的抗性愈伤率与对照基本相当 ,而
90min 干燥处理的抗性愈伤率则较对照有所降低 ,说
明在农杆菌侵染前对小偃 22 小麦的胚性愈伤组织进
行适当时间的干燥处理有利于提高农杆菌的转化效
率 ,干燥时间以 30 min 较为理想。
214 　不同浓度农杆菌对愈伤组织的侵染
表 5 　不同浓度农杆菌对愈伤组织的侵染效果
Table 5 　The infection results of different
Agrowbacteriu concentration
农杆菌浓度
Agrowbacteriu
concentration
(OD)
愈伤组织数
(块)
No1 of callus 污染愈伤组织数 (块)No1 ofcontaminated
callus
抗性愈伤
组织数 (块)
No1 resistant
callus
抗性愈伤率
frequence of
resistant
callus
( %)
014 311 7 50 1611
018 293 19 58 1918
112 287 46 47 1614
116 295 122 43 1416
　　研究发现 ,农杆菌菌液浓度与共培养和筛选阶段
的农杆菌增殖和侵染能力密切相关[5 ] 。若菌液浓度过
小 ,愈伤组织周围只有很少的农杆菌生长 ,则侵染的机
率必然较小 ;而菌液浓度过大 ,农杆菌会在愈伤组织周
围过度繁殖 ,导致愈伤组织死亡和后期筛选过程中的
抑菌困难。从表 5 可以看出 ,不同菌液浓度对污染愈
伤组织数量和抗性愈伤率高低的影响存在差异。愈伤
组织的农杆菌污染程度表现为随着菌液浓度的增加而
增加 ,而抗性愈伤率则表现为菌液浓度 OD 值 018 时
最高 (1918 %) ,116 时最低 (1416 %) ,014 和 112 时抗性
愈伤率基本相当。从提高愈伤组织的抗性愈伤率和尽
可能减少愈伤组织污染两方面综合考虑 ,得出农杆菌
转化的最佳菌液浓度为 OD 值 018。
215 　农杆菌侵染方式与抗性愈伤的关系
从表 6 可以看出 ,农杆菌的不同侵染方式对筛选
阶段的污染愈伤组织数量和抗性愈伤率高低均有明显
影响。愈伤组织污染数经方差分析 ,3 个处理间均达
到了极显著差异水平。以处理 3 (抽真空侵染 15min +
非真空侵染 30min) 的愈伤组织污染率最高 , 达到
7615 % ,而处理 1 (抽真空侵染 5min + 非真空侵染
10min)的愈伤组织污染率最低 ,只有 319 %。说明随着
侵染时间的延长 ,愈伤组织污染率急剧提高。在抗性
愈伤率方面 ,处理 1 和处理 2 间抗性愈伤组织频率没
881 核　农　学　报 23 卷
有显著差异 ,而处理 3 却极显著降低。说明抗性愈伤
率并不随农杆菌侵染时间的延长相应提高 ,且侵染时
间达 45min (抽真空侵染 15min + 非真空侵染 30min)
后 ,抗性愈伤率会极显著降低。综合考虑抗性愈伤率
和农杆菌污染对后期培养影响两方面因素 ,农杆菌侵
染方式选用抽真空侵染 5min + 非真空侵染 10min 较为
理想。
表 6 　农杆菌不同侵染方式获得的抗性愈伤结果
Table 6 　The results of resistant callus
from different Agrowbacteriu infection methods
侵染方式
infection
methods
愈伤组织数
(块)
No1 of
callus
污染愈伤
组织数 (块)
No1 of
contaminated
callus
抗性愈伤
组织数 (块)
No1 of
resistant
callus
抗性愈伤率
frequence of
resistant callus
( %)
1 305 12aA 54 1717aA
2 296 66bB 53 1719aA
3 302 231cC 7 213bB
注 :1 :农杆菌真空侵染 5min + 非真空侵染 10min ; 2 :农杆菌真空侵染
10min + 非真空侵染 20min ; 3 : 农杆菌真空侵染 15min + 非真空侵染
30min。
Note : 1 : the Agrowbacteriu infection time is 5min in the evacuation and 10min in
the non2evacuation ; 2 : the Agrowbacteriu infection time is 10mins in the
evacuation and 20min in the non2evacuation ; 3 :the Agrowbacteriu infection time
is 15min in the evacuation and 30min in the non2evacuation.
216 　共培养时间和共培养温度对农杆菌侵染的影响
在农杆菌介导的植物遗传转化中 ,共培养时间和
温度被认为是影响转化效率的重要因素。表 7 结果显
示 ,共培养 24h ,3 个共培养温度处理均未获得抗性愈
伤组织 ,这可能是由于共培养时间过短 ,T - DNA 的转
移过程未能完成。共培养 48h 和 72h ,3 个共培养温度
处理均表现为共培养 72h 的抗性愈伤率高于 48h 的抗
性愈伤率。共培养 96h ,其抗性愈伤率则呈下降趋势 ,
可能是由于农杆菌的过度生长对愈伤组织造成了伤
害 ,这从筛选阶段农杆菌的污染程度大幅度提高也可
得到证明。同时 ,从表 7 结果可以看出 ,共培养温度和
表 7 　不同共培养时间和共培养温度获得的抗性愈伤率
Table 7 　The results of resistant callus from different
co2culture time and co2culture temperature
时间 time (h) 温度 temperature
( ℃)
19 22 25
24 0 0 0
48 1415 1419 1611
72 1512 1818 1814
96 1017 910 715
共培养时间之间有一定的相关性。当共培养 48h 时 ,
共培养温度 25 ℃的抗性愈伤率最高 ;共培养 72h 时 ,共
培养温度 22 ℃的抗性愈伤率最高 ,共培养 96 时 ,则以
共培养 19 ℃的抗性愈伤率最高。
217 　AS 浓度对农杆菌侵染的影响
研究表明 ,AS (乙酰丁香酮) 能够激活农杆菌 Vir
区基因 ,从而促进 T2DNA 区向植物中转移[7 ,8 ] 。根据
表 8 结果 ,在 0～200μmolΠL 浓度范围内 , 随着 AS 浓度
表 8 　添加不同浓度 AS的农杆菌侵染结果
Table 8 　The Agrowbacterium infection results
with different AS concentration
AS浓度
AS concentration
(μmolΠL) 愈伤组织数(块)No1 of callus 抗性愈伤组织数 (块)No1 of
resistant callus
抗性愈伤率
frequence of
resistant callus
( %)
GUS表达率
frequence of
GUS expression
( %)
0 306 9 219aA 0aA
50 300 47 1517bB 413bB
100 313 53 1619bcBC 611bcB
150 293 55 1818cC 712bcB
200 290 55 1910cC 716cB
的增加 ,愈伤组织的抗性愈伤率和 GUS 表达率随之增
加 ,其中 AS 浓度为 200μmolΠL 的抗性愈伤率和 GUS 表
达率最高 ,其次为 150μmolΠL ,但二者在抗性愈伤率和
GUS表达率方面的差异经方差分析并未达到显著水
平。在未加 AS 的对照处理中 ,虽获得了极个别抗性
愈伤组织 ,但未发现 GUS 表达 ,这与前人的研究结果
基本相似[9 ] 。结果表明在农杆菌菌液中加入 AS 能够
明显提高愈伤组织的抗性愈伤率和 GUS 表达率。结
合试验的成本因素 ,AS 的添加浓度以 150μmolΠL 较为
适宜。
218 　潮霉素对小偃 22 小麦愈伤组织的影响
从表 9 可以看出 ,100mgΠL 和 125mgΠL 潮霉素处理
下 ,小偃 22 小麦的愈伤组织呈黑褐色已全部死亡。研
究发现 ,细胞在死亡过程中分泌的有毒物质 ,会对邻近
的正常细胞产生较强的抑制作用 [10 ] 。因此 , 采用
100mgΠL 和 125mgΠL 潮霉素两种处理筛选小偃 22 的愈
伤组织 , 将影响转化细胞的正常生长。25mgΠL 和
50mgΠL 潮霉素处理不能有效抑制愈伤组织的生长 ,若
用于抗性愈伤组织的筛选 ,将会造成非转化细胞的大
量逃逸。而 75mgΠL 潮霉素处理既能有效抑制愈伤组
织的生长 ,又不至于造成愈伤组织细胞的迅速大量死
亡 ,因此是小偃 22 小麦遗传转化中抗性愈伤组织筛选
较为理想的浓度。
981　2 期 黄淮麦区推广品种小偃 22 农杆菌遗传转化体系的建立
表 9 　潮霉素对愈伤组织生长的影响
Table 9 　Effects of hygromycin to callus growing
潮霉素浓度
Hygromycin
concentration
(mgΠL) 愈伤组织数 (块)No1 ofcallus 愈伤组织死亡或停止生长数(块)No1 of callusthat died or
not growing
愈伤组织
颜色
color of
callus
愈伤组织
状态
status of
callus
0 309 0
黄色
yellow
生长正常
normal
25 293 27 黄色
yellow
生长正常
normal
50 295 173 部分褐色
part brown
部分停止生长
partly stop growing
75 305 297
褐色
brown
停止生长
stop growing
100 312 312
深褐色
black2brown 死亡died
125 303 303 深褐色
black2brown 死亡died
219 　筛选方式对愈伤组织分化的影响
从表 10 可以看出 ,潮霉素对愈伤组织的再生存在
一定影响。在筛选方式 1 处理中 ,分化阶段未加入潮
霉素 ,但其抗性愈伤组织的分化率仅为对照筛选方式
0 处理 (未经农杆菌侵染和潮霉素筛选的胚性愈伤组
织)的 4712 % ,与对照达到了极显著差异水平。在筛
选方式 2 处理中 , 分化阶段加入 25mgΠL 潮霉素后 , 仅
表 10 　不同筛选方式的愈伤分化率
Table 10 　The transformation frequencies
from different selection methods
筛选方式
selection
method
愈伤组织或抗性
愈伤组织数
(块)
No. of callus or
resistant callus
分化愈伤数 (块)
No. of
regenerated
callus
愈伤分化率
Freq. of
unence
( %)
0 96 74 7711 a A
1 88 32 3614 b B
2 93 18 1914 c BC
3 91 2 212 d C
4 99 0 0 d C
注 :0 :未经农杆菌侵染和潮霉素筛选的胚性愈伤组织 ;1 :潮霉素 75mgΠL
(抗性愈伤筛选阶段) + 0 (分化培养阶段) ;2 :潮霉素 75mgΠL (抗性愈伤
筛选阶段) + 25mgΠL (分化培养阶段) ;3 :潮霉素 75mg ΠL (抗性愈伤筛选
阶段) + 50mgΠL (分化培养阶段) ;4 :潮霉素 75mgΠL (抗性愈伤筛选阶段)
+ 75mgΠL (分化培养阶段) 。
Note : 0 :The embryonic callus was not infected by Agrowbacteriu and not selected
by hygromycine ;1 :The hygromycine concentration was 75mgΠL in callus selection
stage and 0mgΠL in callus regeneration stage ; 2 : The hygromycine concentration
was 75mgΠL in callus selection stage and 25mgΠL in callus regeneration stage ; 3 :
The hygromycine concentration was 75mgΠL in callus selection stage and 50mgΠL
in callus regeneration stage ; 4 : The hygromycine concentration was 75mgΠL in
callus selection stage and 75mgΠL in callus regeneration stage.
获得了 1914 %分化率。当潮霉素浓度达到 50mgΠL 时 ,
抗性愈伤组织几乎不能进行再生。说明经过潮霉素筛
选后获得的抗性愈伤组织 ,虽然能够存活和生长繁殖 ,
但可能由于潮霉素的毒副作用 ,其分化能力受到了影
响。因此 ,从保持抗性愈伤组织的分化能力出发 ,在分
化阶段不应再进行筛选或采用 25mgΠL 低浓度潮霉素
筛选较为适宜。
2110 　转化体系的确定
综合以上试验确定的各个较佳因素 ,建立小偃 22
小麦农杆菌遗传转化体系 :
(1)幼穗于 WMI1 培养基中 ,24 ℃,暗培养 30d 诱
导愈伤组织 ; (2) 挑取胚性愈伤组织于 WMC1 培养基
中 ,24 ℃,继代培养 15d ; (3) 农杆菌培养至菌株浓度为
OD600 = 018～110 时加入 150μmolΠL AS。收集农杆菌并
用 WMX 培养基重新悬浮 ,调节菌株浓度为 OD600 =
018 ; (4) 将愈伤组织干燥处理 30min ,加入悬浮好的农
杆菌菌液真空侵染 5min + 非真空侵染 10min ; (5) 弃去
农杆菌菌液 ,将愈伤组织转入筛选培养基 WMS1 ,
22 ℃,暗培养 72h ; (6) 将愈伤组织转入含有 75mgΠL 潮
霉素的新筛选培养基 WMS1 ,24 ℃,暗培养。每 2 - 3 星
期更换一次培养基 ,共培养 6 - 8 星期 ; (7) 将经过筛选
获得的抗性愈伤组织转入不含潮霉素或含有 25mgΠL
潮霉素的分化培养基 WMR2 中 ,26 ℃,光照条件下培
养 5 - 8 星期 ; (8) 再生苗的生根培养和分子生物学方
法检测。
采用上述转化体系对小偃 22 小麦进行了 3 次重
复转化 ,结果均获得了较高的抗性愈伤率和抗性愈伤
分化率 (试验均采用在分化阶段不再加入潮霉素的筛
选方式 ,表 11 ,图 1) ,经 PCR 鉴定 (图 2) ,已获得含外
源目的基因的转基因植株 ,转化效率均在 3 %左右。
同时 ,经 RT2PCR 鉴定 (图 3) ,外源目的基因在部分转
基因植株中得以表达 ,表明试验建立的遗传转化体系
具有可行性。
表 11 　小偃 22 小麦农杆菌介导的遗传转化体系的转化效率
Table 11 　Efficiency of Agrobacterium2mediated
transgenic system of Xiaoyan 22
试验批次
experiment
batch
愈伤数
No. of callus
(块)
抗性
愈伤数
No. of
resistant
callus
(块)
抗性
愈伤率
frequence of
resistant
callus
( %)
抗性愈伤
分化率
frequence of
regenerated
resistant2
callus
( %)
转化率
frequence of
Transformation
( %)
1 653 119 1812 4013 314
2 977 172 1716 4711 219
3 720 141 1916 3716 318
091 核　农　学　报 23 卷
图 1 　农杆菌介导法转化小偃 22 小麦
Fig. 1 　Genetic transformation of Xiaoyan 22 mediated by Agrobacterium tumef aciens
A :愈伤组织 ; B :抗性愈伤组织 ;C :抗性愈伤组织 GUS检测 ;D :抗性愈伤组织的再生
A : callus ; B : resistant callus ; C : GUS test of resistant callus ; D : regeneration of resistant callus
图 2 　部分转基因植株的 PCR 扩增结果
Fig. 2 　PCR results of some transgenic plants
1 :DNA 分子量标准 ;2 :阳性对照 ;3 :阴性对照 ;4～9 :转基因植株
1 :DNA ladder ;2 :positive control ;3 :negative control ;4～9 :transgenetic plants
3 　讨论
311 　潮霉素筛选浓度和筛选方式的确定
利用潮霉素筛选是目前单子叶植物遗传转化最常
用的筛选方法[11 ,12 ] 。对潮霉素的使用原则是能有效抑
制非转化细胞的生长、发育和分化 ,但不影响转化细胞
的正常生长或对转化细胞影响较小 ,也即建立一个非
图 3 　部分转基因植株 RT2PCR 扩增结果
Fig. 3 　RT2PCR results of some transgenic plants
1 :DNA 分子量标准 ;2～7 :转基因植株
1 :DNA ladder ; 2～7 :transgenetic plants
转化细胞抑制和转化细胞生长的平衡关系。潮霉素的
筛选浓度选择要适宜 ,当筛选压力太小 ,势必造成非转
化愈伤组织的大量逃逸 ,增加后期分子生物学检测的
工作量 ,同时也存在与转化愈伤组织的彼此消长问题 ;
而筛选压力过大 ,又会影响转化愈伤组织的生长 ,甚至
不能获得抗性愈伤组织或使抗性愈伤组织分化时间延
长 ,幼苗生长缓慢甚至死亡等[13 ] 。有研究发现 ,潮霉
191　2 期 黄淮麦区推广品种小偃 22 农杆菌遗传转化体系的建立
素浓度过大能迅速杀死植物细胞 ,而细胞在死亡过程
中分泌的有毒物质 ,会对邻近的正常细胞产生较强的
抑制作用[7 ] 。关于潮霉素的工作浓度 ,会因不同植物
甚至同一植物的不同基因型有所差异 ,在小麦上也不
例外。叶兴国等[14 ]发现在宁春 16 小麦的愈伤组织筛
选中 ,潮霉素的适宜工作浓度为 100～150mgΠL。根据
本研究结果 ,75mgΠL 潮霉素既能基本有效抑制非转化
愈伤组织的生长 ,又不至于造成愈伤组织细胞的迅速
大量死亡 ,是小偃 22 小麦遗传转化中抗性愈伤组织筛
选较为理想的浓度。至于造成这种差距的原因还需以
后的试验进一步证实。
关于筛选方式 ,不同实验室在不同植物上的方法
不尽相同 ,但从总体上可分为三大类 : (1) 不同生长阶
段潮霉素采用同一工作浓度 ,即在抗性愈伤组织筛选、
抗性愈伤组织分化及生根培养阶段潮霉素采用同一浓
度筛选 ; (2)潮霉素工作浓度前高后低 ,即在抗性愈伤
组织筛选阶段使用较高的工作浓度 ,而在抗性愈伤组
织分化和生根培养阶段使用较低的工作浓度或不再进
行筛选 ; (3)潮霉素工作浓度 V 型筛选法 ,即在抗性愈
伤组织筛选和生根培养阶段分别使用较高或相对较高
的工作浓度 ,而在抗性愈伤组织分化阶段使用较低的
工作浓度或不再进行筛选[15 ,16 ] 。根据本试验研究结
果 ,经潮霉素筛选获得的抗性愈伤组织 ,其分化能力较
正常愈伤组织大幅度下降。若在分化阶段再利用较高
浓度潮霉素进行筛选 ,很难获得或仅能获得极少量的
再生植株。而遗传转化体系优化的最终目的就是在提
高转化效率的基础上获得较大规模的转基因植株 ,唯
此才有可能选择出外源目的基因高效表达的目标植
株。因此 ,在实践中要确定不同的筛选方式时 ,其原则
就是要建立起一个提高转化效率和适当扩大再生植株
规模的平衡体系。从小偃 22 小麦抗性愈伤组织的实
际分化结果看 ,在分化阶段不进行筛选或采用 25mgΠL
低浓度潮霉素筛选可能较为适宜。
312 　试验确立的不同优化因素的整体效应
农杆菌介导的基因转化是农杆菌菌株与植物细胞
之间生物相互作用的结果。因此 ,凡是能影响农杆菌
侵染能力、植物细胞转化应答能力和转化细胞再生能
力的因素都会对转化效率产生影响。而要提高农杆菌
转基因体系的转化效率 ,就必须对各种影响因子进行
优化和转化条件进行改善。由于农杆菌遗传转化是一
种利用生物实现 DNA 转移和整合的天然系统 ,因而受
环境及其作用对象的影响要比其他转化方法复杂得
多。而目前在不同植物中对农杆菌转化体系的优化研
究一般都是先对单个影响因素进行分析比较 ,确定出
较佳因素 ,然后将各因素进行综合后形成优化的遗传
转化体系[17～20 ] 。在这种情况下 ,由于不同因素和不同
转化条件间的相互协调性问题 ,就有可能存在各个较
佳因素组合的整体效应并不能最终形成较理想的遗传
转化体系的这种可能性。本试验通过对共培养时间和
共培养温度的共同研究表明 ,对抗性愈伤率的影响方
面二者之间存在一定的互作效应 ,如当共培养时间为
48h 时 , 共培养温度 25 ℃的抗性愈伤率最高 ;共培养
72h 时 ,共培养温度 22 ℃的抗性愈伤率最高。这个结
果也初步说明了在农杆菌遗传转化体系的研究中 ,在
研究方法上可能应该考虑从整体效应上对不同影响因
素和转化条件进行优化和改善。然而 ,由于农杆菌遗
传转化中生物相互作用的复杂性和生物反应的难以控
制性 ,目前还很难同时对多个影响因素进行研究。
313 　小偃 22 小麦农杆菌介导的遗传转化体系的通用性
采用本试验建立的遗传转化体系对西农 1376 和
西农 2611 小麦分别进行农杆菌介导的基因转化 ,二者
均获得了含有外源目的基因的转基因植株。其中西农
1376 小麦的转化效率与小偃 22 小麦基本相当 ,而西农
2611 则明显低于小偃 22。由于西农 1376 和小偃 22 小
麦均属于组培特性相对较好的基因型[21 ] ,西农 2611 的
组织培养则较为困难 ,可以初步推断试验建立的小偃
22 小麦农杆菌介导的遗传转化体系可能在组培特性
相对较好的小麦基因型中具有通用性 ,而在组培特性
较差的小麦转化中仍需进一步优化提高。由于试验涉
及的基因型较少 ,推论的正确与否尚需以后的试验进
一步证实。
由于小麦的组织培养研究相对滞后 ,目前建立的
不同转化体系的转化效率普遍较低 ,大多在 1 %左右。
本研究虽有所提高 ,但也仅获得了 3 %的转化效率。
如何进一步提高小麦的转化效率 ,仍是今后应该深入
研究的内容。
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291 Journal of Nuclear Agricultural Sciences
2009 ,23 (2) :185～192
水平 ,而且诱发内源激素达到峰值。且在外植体分化
与脱分化过程中 ,内源激素的变化和使用外源生长物
质诱导的结果基本一致。这些研究结果的获得 ,将为
今后外源生长物质的应用提供有力的参考依据。
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