全 文 ：核 农 学 报 2010，24(6):1297 ～ 1304
Journal of Nuclear Agricultural Sciences
收稿日期:2010-05-21 接受日期:2010-06-12
基金项目:中国农业部资助项目(2009ZX08009 － 076B)，国家自然基金项目(NSFC30971700)
作者简介:孟华兵(1981-)，男，安徽太湖人，在读博士研究生，研究方向为作物逆境分子生理。E-mail:mhb828@ 163. com
通讯作者:蒋立希(1964-)，男，浙江杭州人，教授，研究方向为作物基因组学与分子生理学。E-mail:jianglx@ zju. edu. cn
文章编号:1000-8551(2010)06-1297-08
镉胁迫下二倍体和同源四倍体油菜
DNA甲基化差异分析
孟华兵1 杜 雪1 姜宇晓1 朴学成1，2 郭万里1 蒋立希1
(1. 浙江大学农业与生物技术学院作物科学所，浙江 杭州 310029;
2. 朝鲜金日成综合大学生命科学院，朝鲜 平壤 999093)
摘 要:二倍体与四倍体在逆境抗性上的差别可以从表观遗传学的角度予以解释。本研究以“矮脚黄”
纯合二倍体和同源四倍体油菜为材料，采用 DNA 甲基化敏感扩增多态性分析(Methylation-sensitive
amplification polymorphism，MSAP)方法和 HDA-GT12TM 全自动凝胶毛细管核酸电泳检测技术，在全基
因组水平上研究了 CdCl2 胁迫下油菜二倍体和四倍体 DNA 序列中 CCGG 位点的甲基化水平及模式变
化特征差异。采用 56 对引物在 4 个处理样品中共检测出 9 687 个基因位点。结果显示，二倍体和四倍
体在镉胁迫下，其总甲基化水平、全甲基化水平和半甲基化水平较各自的对照均有一定程度的上升。由
此可见，镉胁迫导致四倍体和二倍体甲基化水平的提高，但四倍体基因组在镉胁迫下拥有更高的 DNA
甲基化水平。DNA 甲基化模式分析表明，镉胁迫导致二倍体和四倍体的过甲基化位点数均高于去甲基
化位点数，二者在镉胁迫下去甲基化位点数差异不大，但四倍体发生过甲基化的位点数要明显多于二倍
体。
关键词:二倍体;同源四倍体;甲基化敏感扩增多态性(MSAP);镉胁迫
COMPARISON BETWEEN TETRAPLOID TURNIP (Brassica rapa)AND ITS
DIPLOID PROGENITOR OF DNA METHYLATION UNDER CADMIUM STRESS
MENG Hua-bing1 DU Xue1 JIANG Yu-xiao1 Pak Haksong1，2 GUO Wan-li1 JIANG Li-xi1
(1. College of Agriculture and Biotechnology，Zhejiang University，Hangzhou，Zhejaing 310029)
(2. College of Life Science，Kim Il-sung University，Pyongyang，Democratic People’s Republic of Korea，Pyongyang 999093)
Abstract:The difference of stress tolerance between diploids and tetraploids may be explained from the view of
epigenetics. In this study，an autotetraploid turnip (cv. Ai-Jiao-Huang 4X)and its diploid progenitor (cv. Ai-Jiao-
Huang 2X)under cadmium stress were compared for their degree of genomic DNA methylation and the pattern of DNA
methylation at CCGG sites by MSAP (methylation-sensitive amplification polymorphism)and the high-speed HDA-GT12
(TM) analysis system. A total of 56 pairs of selective primers which generated 9687 genetic loci were applied.
Compared to the respective control，the diploid and tetraploid under cadmium stress had a higher ratio of general
methylation，full methylation and half methylation，indicating that，cadmium stress gave rise to an increase of DNA
methylation degree for both the diploid and tetraploid type. Nevertheless， the DNA methylation of the tetraploid
correlated more closely to cadmium stress than that of the diploid did. Analysis of DNA methylation patterns suggested
that the number of hypermethylation sites was greater than those of demethylation sites both in the diploid and tetraploid
under cadmium stress. There was no significant difference between diploid and tetraploid for the number of demethylation
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sites，however，the tetraploid had a higher number of hypermethylation sites.
Key words:diploid;autotetraploid;MSAP;cadmium stress
重金属镉(Cadmium，Cd)于作物而言是非必需元
素，对作物有毒害作用，是已知危害最严重的农田污染
类型之一。镉能够影响作物的多种生理过程，致使其
代谢紊乱，从而影响植物生长和发育［1 ～ 3］。目前关于
镉对植物毒害作用机理的研究主要集中于植物生理生
化反应机制方面，而对镉胁迫下植物的 DNA 甲基化研
究报道不多。
多倍体作物比二倍体作物往往具有更大的营养器
官和生殖器官，且在生长过程中表现出一定的抗性差
异，但以往的研究多集中在异源多倍体，而对同源多倍
体和二倍体的抗性研究甚少［4 ～ 6］。DNA 甲基化是植
物表观遗传修饰的主要方式之一，在植物的生长、发育
及基因表达调控等过程中发挥着重要作用［7 ～ 10］。有
研究认为植物 DNA 甲基化状态与植物所处的不同生
长环境有很大的关系［11，12］，逆境胁迫下的甲基化多态
性分析和多倍体的甲基化多态性分析已有相关报
道［13 ～ 17］，但有关逆境条件下同源四倍体和二倍体的表
观遗传差异的研究报道尚不多见。研究二倍体和同源
四倍体在镉胁迫条件下的表观遗传差异有利于揭示同
源四倍体和二倍体胁迫应答分子机制的差异，也能够
揭示甲基化在响应胁迫方面所起的作用。
甲基化敏感扩增多态性(MSAP)技术是建立在
AFLP 技术上的分子标记技术，用来研究样本的甲基
化水平和甲基化模式［18 ～ 20］。该方法采用 2 组内切酶，
即 EcoR I / Msp I 和 EcoR I / Hpa II 分别酶切基因组
DNA。Msp I 和 Hpa II 都能识别并切割 CCGG 序列，但
对该序列的胞嘧啶甲基化的反应不同。Hpa II 对序列
中的 任 何 胞 嘧 啶 甲 基 化 都 敏 感，不 能 酶 切 含
CmCGG、mCCGG 和mCmCGG 的位点，但能切割单链
DNA 外侧胞嘧啶甲基化的位点;Msp I 对外侧胞嘧啶
甲基化位点敏感，不能酶切mCCGG 和mCmCGG 的位
点，可以酶切 CmCGG 位点。因而该方法可以较好地
反映基因组 DNA 序列中 CCGG 位点的甲基化状态和
程度。
本文采用同源四倍体和二倍体矮脚黄油菜为材
料，在全基因组水平上研究了二者在镉胁迫下 DNA 甲
基化水平及模式变化特征差异，从 DNA 甲基化修饰角
度阐述了二者抗性差异的原因，有利于揭示镉胁迫下
同源四倍体 DNA 甲基化修饰规律和分子应答机制。
1 材料与方法
1. 1 材料
供试材料为白菜型油菜“矮脚黄”二倍体和“矮脚
黄”四倍体，四倍体直接由二倍体“矮脚黄”加倍而来，
属于同源四倍体。
1. 2 重金属处理
选取当年采摘健康饱满的二倍体和四倍体“矮脚
黄”种子，在培养皿发芽 7d 后转入蛭石中生长，待二
倍体和四倍体长至 5 ～ 7 叶期时，选取数株同期种植的
四倍体和二倍体“矮脚黄”健康植株，移植到装有
Hoagland 营养液的小桶中，并用气泵通气。植株在营
养液中培养 1 周后，在营养液中加入 CdCl2(终浓度为
50μmol /L)，共 4 个处理(其中 2 个未加镉的处理作为
对照)，处理 24h 后，取各处理的叶片 5g，用蒸馏水洗
净后迅速放入液氮中冷冻，最后将材料存放到 － 80℃
冰箱中备用。
1. 3 基因组 DNA 的提取
采用尿素法提取油菜叶子基因组的 DNA，即取 2
～ 3g备用叶片，研碎，加入 DNA 提取液(42% 尿素，
312. 5mmol /L NaCl，50mmol /L Tris，20mmol /L EDTA，
1%肌胺酸)，加入氯仿 ∶异戊醇(24∶ 1)进行纯化，抽提
2 次后，加入 RNAase 酶 37℃恒温 2h，用苯酚 ∶氯仿 ∶ 异
戊醇(25 ∶ 24 ∶ 1)再进行纯化，DNA 用 TE(pH8. 0)溶
解，完全溶解后，使用 1. 0% 琼脂糖电泳检验样品的
DNA 质量，再用 NanoDrop 2000 测定样品的浓度，并经
TE(pH8. 0)稀释，将各处理样品的浓度调整成一致。
1. 4 MSAP 分析
使用 xiong 等［18］所描述的方法，分别用 EcoR I /
Msp I 和 EcoR I / Hpa II 2 组内切酶对每个样品进行双
酶切。酶切体系为 500ng 模板 DNA，10U EcoR I，5U
Hpa II(Msp I)，反应混合液在 37℃恒温 3h。酶切后的
反应液与人工接头(表 1)连接，用 T4 连接酶将酶切混
合物进行连接，16℃连接 2h，连接反应后，将连接液稀
释至 100μl。每个样品吸取 5μl 加入预扩增引物(表
1)用于预扩增反应，反应程序为 94℃ 预变性 3min，
94℃变性 30s，56℃复性 1min，72℃延伸 1min，共 25 个
循环，最后 72℃延伸 10min，将扩增液保持于 4℃。预
扩增反应完成后，将扩增产物稀释至 500μl。按照表 1
中的引物进行选择性扩增，每个样品反应体系为
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6 期 镉胁迫下二倍体和同源四倍体油菜 DNA 甲基化差异分析
表 1 MSAP 所用的接头和引物序列
Table 1 Adapters and primers used in MSAP
引物和接头 primers and adaptors 序列(5′→3′)sequence (5′→3′)
EcoR I adaptor1 CTCGTAGACTGCGTACC
EcoR I adaptor2 AATTGGTACGCAGTCTAC
Hpa II / Msp I adaptor1 GATCATGAGTCCTGCT
Hpa II / Msp I adaptor2 CGAGCAGGACTCATGA
EcoR I pre-selective primer GACTGCGTACCAATTC
Hpa II / Msp I pre-selective primer ATCATGAGTCCTGCTCGG
EcoR I selective primer 1 GACTGCGTACCAATTCAAC
EcoR I selective primer 2 GACTGCGTACCAATTCACG
EcoR I selective primer 3 GACTGCGTACCAATTCACT
EcoR I selective primer 4 GACTGCGTACCAATTCAGT
EcoR I selective primer 5 GACTGCGTACCAATTCAAG
EcoR I selective primer 6 GACTGCGTACCAATTCACA
EcoR I selective primer 7 GACTGCGTACCAATTCACC
EcoR I selective primer 8 GACTGCGTACCAATTCAGC
Hpa II / Msp I selective primer 1 ATCATGAGTCCTGCTCGGTAA
Hpa II / Msp I selective primer 2 ATCATGAGTCCTGCTCGGTCC
Hpa II / Msp I selective primer 3 ATCATGAGTCCTGCTCGGTTC
Hpa II / Msp I selective primer 4 ATCATGAGTCCTGCTCGGTAC
Hpa II / Msp I selective primer 5 ATCATGAGTCCTGCTCGGTGC
Hpa II / Msp I selective primer 6 ATCATGAGTCCTGCTCGGTAG
Hpa II / Msp I selective primer 7 ATCATGAGTCCTGCTCGGTTG
Hpa II / Msp I selective primer 8 ATCATGAGTCCTGCTCGGTCA
20μl，反应程序为 94℃ 预变性 3min，94℃ 变性 30s，
65℃复性 30s，72℃延伸 1min，每循环一圈复性温度降
低 0. 7℃，共 12 个循环，此后按 56℃为复性温度进行
23 个循环，72℃延伸 10min，最后保持在 4℃。
将上述每个样品的选择性扩增 PCR 产物按试验
顺序转移至平整的 96 孔 PCR 板上，并放入 HDA-
GT12TM 全自动凝胶毛细管核酸分析系统中，按照仪
器使用要求开启仪器和相关软件，在“Method”菜单下
选择 OM700 的分离方法，在其他相应菜单中输入样品
名称、取样起始位置、进样时间、分离时间、样品信息、
数据存储位置等相关信息，确认并检查仪器状态设置
无误。数据完成后，保存相关数据，在得到毛细管电泳
结果图后进行分析。MSAP 条带用“1”和“0”分别代
表“有带”和“无带”，统计数据转化成二元矩阵。根据
带的有无，可能出现以下 4 种类型，分别为(1、1)、(1、
0)、(0、1)和(0、0)(表 2)。
2 结果与分析
2. 1 油菜样品 DNA 的提取
基因组 DNA 电泳结果如图 1，从图 1 可以看出 4
个样品基因组 DNA 质量是理想的，可进一步用于甲基
化分析试验。
表 2 同裂酶 Hpa II 和 Msp I 的甲基化敏感性及其限制性谱带
Table 2 The sensitive methylation and its bands type of Hpa II and Msp I
类型 type
E + H 带型
E + H bands type
E + M 带型
E + M bands type
CCGG 位点状态
state of CCGG sites
CCGG 位点甲基化状态
methylation state of CCGG sites
(1、1) 1 1
CCGG
GGCC
非甲基化
(1、0) 1 0
m CCGG
GGCC
单链外侧胞嘧啶甲基化
(0、1) 0 1
Cm CGG
GGCm C
双链内侧胞嘧啶甲基化
(0、0) 0 0
1. m Cm CGG
GGCm Cm
2. m CCGG
GGCCm
3. CCGG
3 种可能的状态
双链内、外侧胞嘧啶甲基化;
双链外侧胞嘧啶甲基化;
不存在 CCGG 位点
注:CCGG:未甲基化位点;m CCGG:外侧胞嘧啶甲基化;Cm CGG:内侧胞嘧啶甲基化。
Note:CCGG:unmethylation;m CCGG:methylation of the outer cytosine;Cm CGG:methylation of the inner cytosine.
2. 2 选择性扩增结果
选用 64 对引物进行 MSAP 选择性扩增，其中 56
对引物扩增效果较好，条带也非常丰富、清晰，且重复
性好，扩增展现一定的多态性(图 2)。
2. 3 镉胁迫下油菜的 DNA 甲基化水平
在镉胁迫下，二倍体和四倍体经 MSAP 法扩增的
带数及甲基化水平见表 3。56 对引物用毛细管电泳方
法检测出 4 个样品扩增总片段数为 9 687，平均每对引
物可扩增出约 43 条带。
对照和镉胁迫下二倍体和四倍体油菜 DNA 的甲
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核 农 学 报 24 卷
图 1 样品基因组 DNA 的琼脂糖电泳检测结果
Fig. 1 Agarose gel electrophoresis
of the genomic DNAs
1:二倍体对照;2，四倍体对照;3:镉处理后
的二倍体;4:镉处理后的四倍体。下图均同
1:the diploid CK;2:the tetraploid CK;
3:the diploid treated with Cd;4:the tetraploid
treated with Cd. The same as following figures
基化图谱中总扩增位点数分别为 2 501、2 537、2 327
和 2 322(表 3)。其中总甲基化水平(MSAP 比率，即
总甲基化位点数占总扩增条带数)分别为 20. 3%、
19. 8%、22. 7%和 23. 3%;全甲基化率(双链甲基化
率)分别为 13. 4%、10. 9%、13. 8% 和 12. 5%;半甲基
化率(单链甲基化率)分别为 7. 0%、8. 9%、8. 9% 和
10. 8%。在未经镉处理的对照中，二倍体和四倍体油
菜总体甲基化水平差异不明显。从表中的总甲基化率
和全甲基化率以及半甲基化率来看，镉处理导致二倍
体和四倍体油菜叶片中的全基因组 DNA 总甲基化水
平、全甲基化水平以及半甲基化水平的提高，镉胁迫下
四倍体的总甲基化率和半甲基化率要高于二倍体。表
明四倍体基因组 DNA 的甲基化对镉胁迫的反应更加
敏感，在镉胁迫下拥有更高的 DNA 甲基化水平。
图 2 凝胶毛细管电泳检测选择性扩增的结果
Fig. 2 The results of selective PCR products detected by HDA-GT12TM
H:Hpa II / EcoR I;M:Msp I / EcoR I. The same as followin figures
表 3 镉胁迫下二倍体和四倍体油菜
的 DNA 甲基化水平
Table 3 The degree of genomic DNA methylation
of the diploid and tetraploid turnip
under cadmium stress
项目 item 1 2 3 4
总扩增带数 total bands 2 501 2 537 2 327 2 322
全甲基化带数 full methylated bands 334 276 321 291
半甲基化带数 hemimethylated bands 174 226 207 250
总甲基化带数 total methylated bands 508 502 528 541
全甲基化率 full methylation ratio (%) 13. 4 10. 9 13. 8 12. 5
半甲基化率 hemimethylation ratio (%) 7. 0 8. 9 8. 9 10. 8
总甲基化率 total methylation ratio (%) 20. 3 19. 8 22. 7 23. 3
注:全甲基化指双链都为 5′ － m Cm CGG － 3′;半甲基化指单链外甲基化
5′ － m CCGG － 3′。
Note:Full methylation denotes 5′ － m Cm CGG － 3′ in double strands;half
methylation denotes 5′ － m CCGG － 3′ in outer cytosine single strand.
2. 4 镉胁迫下二倍体和四倍体油菜基因组 DNA 甲
基化变化模式
对 56 对引物选择性扩增模式进行分析，结果显
示，所有的扩增模式可以分为 A、B、C、D 4 个大类，15
个亚类(图 3，表 4)。类型 A 包含 3 个亚类(A1、A2、
A3)，显示的是镉胁迫前与胁迫后相比，油菜 DNA 甲
基化模式未发生任何改变，这样的 DNA 甲基化模式变
化类型大约占检测类型的一半，其中四倍体在镉胁迫
后，未发生 DNA 甲基化模式改变的类型占总模式类型
的比例最高，为 46. 6%。类型 B 包含 5 个亚类(B1、
B2、B3、B4、B5)，表示镉胁迫前与胁迫后相比，油菜基
因组内相应位点 DNA 发生了去甲基化。在对照生长
条件中，四倍体与二倍体相比有 30. 1% 的位点 DNA
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6 期 镉胁迫下二倍体和同源四倍体油菜 DNA 甲基化差异分析
甲基化水平下降;而镉胁迫下，四倍体与二倍体相比有
24. 8%的位点 DNA 发生了去甲基化。与正常生长条
件下的二倍体相比，镉胁迫下的二倍体有 23. 6% DNA
位点发生了去甲基化;镉胁迫下的四倍体与正常生长
条件下的四倍体相比有 23. 8% DNA 位点发生了去甲
基化过程。类型 C 包含 5 个亚类(C1、C2、C3、C4、
C5)，表示镉胁迫前与胁迫后相比，油菜基因组内相应
位点 DNA 发生了过甲基化(hypermethylation)过程。
在对照生长条件中，四倍体与二倍体相比有 22. 0%的
位点 DNA 甲基化水平上升;在镉胁迫下，四倍体与二
倍体相比有 25. 8%的位点 DNA 发生了过甲基化。在
镉胁迫下，二倍体与正常生长条件下的二倍体相比有
24. 5% DNA 位点发生了过甲基化事件;而四倍体与正
常生长条件下的四倍体相比有 26. 8% DNA 位点有过
甲基化。类型 D 包含 2 个亚类(D1、D2)，该类型在目
前的分析中无法确定 DNA 甲基化的变化模式，其占整
个 DNA 甲基化模式的比率很小，只有 3% 左右，因此
不在分析之列。从上述分析可以看出，镉导致二倍体
和四倍体的过甲基化位点数均高于去甲基化位点数，
镉胁迫会导致叶片中基因组 DNA 甲基化位点以过甲
基化为主，以去甲基化为辅。四倍体和二倍体油菜在
镉胁迫中分别有 187、171 个位点发生过甲基化事件，
分别有 166、165 个位点发生去甲基化事件。说明二者
的去甲基化事件位点数差异不大，但过甲基化事件位
点有较大差异，且四倍体发生过甲基化的位点数要明
显多于二倍体。
图 3 MSAP 分析中检测到的不同 DNA 甲基化模式变化类型
Fig. 3 Changes of DNA methylation patterns detected by the MASP assay
A1 ～ C5 所示箭头为不同的 DNA 甲基化模式变化类型，见表 4
The arrows of A1 ～ C5 denote the changes of DNA methylation patterns
1031
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表 4 同源四倍体和二倍体油菜在镉胁迫下的 MSAP 甲基化模式变化
Table 4 Comparison between the diploid and the autotetraploid
under cadmium stress for the changes of DNA methylation patterns
带型
band
pattern
处理前
before
treatment
处理后
after
treatment
甲基化改变状态
changes of methylation status
模式类型数量及其占总模式类型的比例
number and frequency of pattern
H M H M 处理前
before treatment
处理后
after treatment
2N /4N 2N(Cd)/4N(Cd) 2N(Cd)/2N 4N(Cd)/4N
A 334(45. 0%) 330(46. 5%) 342(46. 4%) 325(46. 6%) =
A1 1 1 1 1
CCGG
GGCC
CCGG
GGCC
299 291 309 296
A2 1 0 1 0
CCGG CCGG
GGCC GGCC
CCGG CCGG
GGCC GGCC
15 9 10 7
A3 0 1 0 1
CCGG
GGCC
CCGG
GGCC
20 30 23 22
B 223(30. 1%) 176 (24. 8%) 165(23. 6%) 166 (23. 8%) ↓
B1 1 0 1 1
CCGG
GGCC
CCGG
GGCC
43 35 34 33
B2 0 1 1 1
CCGG
GGCC
CCGG
GGCC
56 33 29 30
B3 0 0 1 1
CCGG CCGG
GGCC GGCC
CCGG
GGCC
33 38 41 24
B4 0 0 1 0
CCGG CCGG
GGCC GGCC
CCGG CCGG
GGCC GGCC
42 29 37 46
B5 0 0 0 1
CCGG CCGG
GGCC GGCC
CCGG
GGCC
49 41 24 33
C 163 (22. 0%) 183 (25. 8%) 171 (24. 5%) 187 (26. 8%) ↑
C1 1 1 1 0
CCGG CCGG
GGCC GGCC
CCGG CCGG
GGCC GGCC
36 45 44 38
C2 1 1 0 1
CCGG
GGCC
CCGG
GGCC
10 40 31 40
C3 1 1 0 0
CCGG
GGCC
CCGG CCGG
GGCC GGCC
45 10 35 40
C4 1 0 0 0
CCGG CCGG
GGCC GGCC
CCGG CCGG
GGCC GGCC
64 58 36 34
C5 0 1 0 0
CCGG
GGCC
CCGG CCGG
GGCC GGCC
8 30 25 35
D 22 (3. 0%) 21 (3. 0%) 20 (2. 9%) 20 (2. 9%) ≠
D1 0 1 1 0
CCGG CCGG
GGCC GGCC
CCGG CCGG
GGCC GGCC
15 14 11 14
D2 1 0 0 1
CCGG
GGCC
CCGG GGCC 7 7 9 6
总计 total 742 710 698 698
注:“ =”表明的是二倍体和同源四倍体在镉胁迫下 CCGG 位点的 DNA 甲基化模式没有发生变化;“↑”表明的是二倍体和同源四倍体在镉胁迫下
CCGG 位点的 DNA 甲基化模式发生了过甲基化调整;“↓”表明的是二倍体和同源四倍体在镉胁迫下 CCGG 位点的 DNA 甲基化模式发生了去甲基化
调整;“≠”表明通过 MSAP 分析无法确定的 DNA 甲基化模式调整。2N:二倍体油菜;4N:四倍体油菜;Cd:镉处理。括号内的数字表示模式类型数量
占总模式类型数量的比例。
Note:‘=’indicated that the patterns of DNA methylation at CCGG sites were unchanged;‘↑’indicated that the patterns of DNA methylation at CCGG sites
were changed due to hypermethylation events;‘↓’indicated that the patterns of DNA methylation at CCGG sites were changed due to demethylation events;
‘≠’indicated the alternations of DNA methylation patterns that were unidentified by MSAP methods;2N:diploid;4N:tetraploid;Cd:cadmium stress;the
number in bracket indicated that the proportion of each patterns in total patterns type.
2031
6 期 镉胁迫下二倍体和同源四倍体油菜 DNA 甲基化差异分析
3 讨论
在多倍体的形成过程中，与异源多倍体相比，同源
多倍体很少发生基因组内序列的消减、增加、转座子激
活等事件，这可以归因于同源多倍体基因组内无来自
异质基因组结合的影响［21］。对一些同源多倍体植物
的研究发现，同源多倍体与二倍体相比，其表达谱非常
相似［22 ～ 24］，但同源多倍体比亲本二倍体拥有更大的营
养和生殖器官，其抗性也有差异。既然同源多倍体的
表达谱与二倍体无明显差异，那么它所表现出的表型
和抗性表现又该如何解释呢?最近有研究发现，这可
能与植物的另一种调控方式———即表观遗传调控有
关。DNA 甲基化修饰是表观遗传调控的重要方式之
一，而 DNA 甲基化与基因沉默和激活有关，大量的研
究表明，异源多倍体存在着广泛的 DNA 甲基化修饰变
化［25 ～ 28］，但人们对逆境条件下同源多倍体 DNA 甲基
化修饰的了解甚少。
重金属胁迫可以提高基因组 DNA 甲基化水平，如
Cu2 +、Hg2 + 和 Cd2 + 胁迫导致小麦和水稻叶片 DNA
中5m C 比例的升高，Cr 可以诱导油菜(Brassica napus)
基因组中 DNA 甲基化水平的上升［14，17］。本研究中，
Cd2 +胁迫下的二倍体和四倍体叶片基因组 DNA 中分
别有 22. 7%和 23. 3% 的 CCGG 位点发生了胞嘧啶甲
基化，均分别高于二者未经镉处理的对照(20. 3% 和
19. 8%)。本研究结果也显示，未经镉处理时，二倍体
和四倍体间甲基化程度没有明显差异，而镉胁迫后均
导致二倍体和四倍体油菜叶片甲基化程度的上升，与
前人的研究结果一致，但四倍体甲基化水平对镉胁迫
的反应较之二倍体更加敏感，拥有更高的甲基化水平。
重金属离子胁迫导致植物基因组 DNA 甲基化水平的
上升，可能有利于植物抵抗重金属胁迫，防止 DNA 被
内切酶酶切和多拷贝转座［29，30］。Aina 等［15］研究发
现，对重金属敏感的三叶草(Trifolium repens L.)其根
部基因组 DNA 的甲基化水平只有耐重金属的大麻
(Cannabis sativa L.)甲基化水平的 30%，他们推测其
基因组较高的 DNA 甲基化水平是大麻耐重金属的原
因，所以植物在重金属胁迫下可能通过增加基因组
DNA 甲基化水平来抵御逆境胁迫。本研究中在镉胁
迫下四倍体与二倍体相比，其基因组 DNA 的甲基化水
平高，可能是四倍体比二倍体油菜更具有耐重金属性，
四倍体通过提高 DNA 甲基化水平来抵御镉的胁迫。
镉逆境条件下，通过对四倍体油菜和二倍体油菜
DNA 甲基化模式分析，发现各处理样品之间甲基化带
型的改变共出现 4 大类，15 亚类(图 3、表 4)，可归纳
为不变模式(A 类)、去甲基化模式(B 类)、过甲基化
模式(C 类)以及不定类型(D 类)。去甲基化类型可
使基因位点 DNA 甲基化程度降低，而过甲基化类型可
使基因位点 DNA 甲基化程度升高。在镉胁迫下，二倍
体和四倍体基因组 DNA 发生过甲基化位点的数目均
上升，而发生去甲基化位点数目均下降。这与 Labra
等研究重铬酸钾胁迫的结果一致［14］，表明四倍体和二
倍体油菜在镉胁迫下，基因组 DNA 的某些位点发生了
改变，植物体内启动了相应的分子应激机制来抵御重
金属的胁迫，从而有利于植物的生长发育。在镉胁迫
下，四倍体与二倍体相比具有更多的位点发生了过甲
基化，而发生去甲基化的位点数二者相差不大，因此推
测四倍体和二倍体抗镉的逆境差异主要是由于四倍体
的部分位点发生了过甲基化，关闭了某些基因的表达，
使其转录受到抑制。重金属镉胁迫下，同源四倍体和
二倍体油菜差异甲基化片段的哪些特定基因发生过甲
基化，以及这些差异基因是如何调节四倍体和二倍体
重金属镉胁迫应激反应的机制还有待进一步研究。
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