全 文 ：核 农 学 报 2010，24(6):1124 ～ 1131
Journal of Nuclear Agricultural Sciences
文章编号:1000-8551(2010)06-1124-08
收稿日期:2009-12-15 接受日期:2010-08-18
基金项目:国家高技术研究发展计划(863 计划)重大专项(2009AA101102)，高等学校博士学科点专项科研基金(20090204110024)，陕西省
“13115”科技创新工程重大科技专项(2010ZDKG-68)，国家杨凌农业生物技术育种中心专项基金(99 － 1A)，西北农林科技大学拔尖
人才支持计划项目
作者简介:张 瑜(1983-)，女，重庆江津人，硕士，研究方向为小麦分子细胞遗传及其杂种优势利用。E-mail:zhangyu_8311@ yahoo. com. cn
牛 娜(1977-)，女，陕西商州人，博士，讲师，主要从事小麦分子细胞遗传及其杂种优势利用研究。E-mail:niuna1977@ yahoo. com. cn。
与第一作者同等贡献。
通讯作者:张改生(1951 －)，男，陕西周至人，教授，博士生导师，主要从事小麦分子细胞遗传及其杂种优势利用研究。E － mail:zhanggsh@
public. xa. sn. cn
黏类小麦 CMS不育基因 rfv1 的分子细胞
遗传学跟踪鉴定及定向转育研究
张 瑜 牛 娜 张改生 王 青 葛峰辉 曹 栎 马守才
(西北农林科技大学 / 陕西省作物杂种优势研究与利用重点实验室 /小麦育种教育部工程研究中心，陕西 杨陵 712100)
摘 要:为了实现黏类小麦雄性不育基因 rfv1 的定向转育，创制优良的黏类非 1BL /1RS 小麦雄性不育新
保持系，本研究以 1BS 上带有不育基因 rfv1 的非 1BL /1RS 小麦变种 SP4、莫迦小麦为供体材料，以杀雄
剂途径培育的小麦强优势组合西杂 1 号和西杂 5 号杂交小麦新品种的母本西农 Fp1 和西农 Fp2 为受体
材料，采用专一核置换回交转育方法，同时结合根尖细胞学镜检、复合引物 PCR 及 SDS-PAGE 和 A-
PAGE 技术，进行不育基因 rfv1 定向转入的鉴定，旨在育成既携带 rfv1 不育基因，又具有西农 Fp1 和西农
Fp2 核遗传背景的黏类非 1BL /1RS 小麦雄性不育新保持系。结果如下:(1)根尖体细胞随体鉴定和复
合引物 PCR 分析表明，该法不仅能准确鉴定出 1BL /1RS 纯合易位系，还可鉴定出 1BL /1RS·1BL /
1BS rfv1易位杂合体，两者结果一致。其中复合引物 PCR 更适合于回交后代中大量目标植株的筛选，为小
麦雄性不育基因 rfv1 定向转移到 1BL /1RS 易位系提供了准确的鉴定方法与依据;(2)利用 SDS-PAGE
技术对供试材料进行高低分子量麦谷蛋白亚基的分析表明，在低分子量谷蛋白 D 亚基区存在莫迦小麦
和 SP4 的特征带;而 SP4 的高分子量谷蛋白亚基区的 6 + 8 亚基，也可以作为示踪小麦雄性不育基因 rfv1
定向转移到非 1BL /1RS 易位系的特征亚基条带;(3)A-PAGE 技术对醇溶蛋白的分析表明，在 ω-醇溶蛋
白区也发现莫迦小麦和 SP4 不同于西农 Fp2 的特异蛋白条带，也可作为示踪小麦雄性不育基因 rfv1 定
向转移到非 1BL /1RS 易位系的特征蛋白条带。本研究成功地将小麦杂种优势利用中的杀雄剂法和三
系法相结合，促进了小麦杂种优势利用新技术体系的建立。同时该方法亦可应用于黏类小麦雄性不育
恢复基因 Rfv1 的定向转育，进而可实现小麦由生理型不育向遗传型不育的定向转化，以探索一套杂交
小麦强优势组合多途径利用的新方法。
关键词:小麦;黏类雄性不育系;rfv1 基因;定向转育;分子细胞学鉴定
MOLECULAR CYTOGENETIC TRACER IDENTIFICATION AND DIRECTIONAL TRANSDUCTION OF MALE
STERILE GENE rfv1 OF WHEAT STERILITY LINES WITH SOME Aegilops CYTOPLASMS
ZHANG Yu NIU Na ZHANG Gai-sheng WANG Qing GE Feng-hui CAO Yue MA Shou-cai
(Key Laboratory of Crop Heterosis of Shaanxi Province /Wheat Breeding Northwest A＆ F University
Engineering Research Center，Ministry of Education，Yangling，Shannxi 712100)
Abstract:In order to utilize wheat heterosis in multiple pathways，a special backcross was performed to transform
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6 期 黏类小麦 CMS 不育基因 rfv1 的分子细胞遗传学跟踪鉴定及定向转育研究
physiological male sterile-restoration system to genetic male sterile-restoration system directionally，and female parents of
hybrid wheat XZ1 and XZ5，which were bred by means of physiological male sterile-restoration system and had proved of
robust heterosis，were used as recurrent parents crossing and backcrossing to Triticum spelta var. duhamelianum(for short
SP4)and T. macha var. subletschchumicum with male sterile gene rfv1 on short arm of 1B chromosome to breed the new
non-1BL /1RS maintainers of CMS. The results are as follows: (1)Both root-tip cytological identification and multiplex
PCR makers exactly differentiated between homozygote and heterozygote of 1BL /1RS translocation，and multiplex PCR
was more suitable for the selection of large backcross progenies and provided an accurate method for tracing rfv1 gene in
directional transduction of non-1BL /1RS translocation; (2) The HMW(High Molecular Weight)and LMW (Low
Molecular Weight)subunits analysis by SDS-PAGE revealed that the special subunit in D subunit area of SP4 and T.
macha could trace rfv1 gene in directional transduction. For SP4，6 + 8 HMW subunit could be the tracer subunit; (3)
Based on A-PAGE，the special gliadin band in ω-gliadins area of SP4 and T. macha were found，which could be a
tracer gliadin band of rfv1 gene in directional transduction. These results could be applied for directional transduction of
restoring gene Rfv1 of wheat sterility lines with some Aegilops cytoplasms.
Key words:wheat;wheat sterility lines with some Aegilops cytoplasms;rfv1 gene;directional transduction;molecular
cytogenetical identification
杂种优势利用是大幅度提高小麦单产和品质的最
有效途径之一，是小麦育种发展的必然趋势［1］。目
前，利用小麦雄性不育配制强优势组合主要采用诱导
生理型不育的杀雄剂法和遗传型不育三系或二系法。
生理型不育杀雄剂法，可直接利用小麦常规品种
(系)作为杂交小麦亲本，任意大量地配制杂种组合，
无须培育专门的不育系与恢复系，只要筛选出强优势
组合，用适宜杀雄剂喷施母本，即可达到生产杂交种的
目的。但杀雄剂法关键技术之一，必需有一种高效无
毒的杀雄剂，并需对杀雄剂的使用技术和制种技术进
行系统研究，成熟后方能推广，进而才能真正地突破杂
交小麦的生产应用关［2］。
黏类小麦雄性不育系是指小麦黏型(K 型)和偏
型(Ven 型)等一类既易保持又易恢复，且种子饱满，
保持系与恢复系来源都分布在普通小麦推广品种
(系)内的小麦雄性不育系的总称。大量研究表明，黏
类小麦细胞质雄性不育(CMS)系是小麦杂种优势利
用中很有应用潜力的三系不育类型。不过，对黏类小
麦雄性不育系强优势组合配制等的研究证实，其在配
制强优势组合上较难达到像杀雄剂途径那样广泛组配
组合，且出现强优势组合的几率也较杀雄剂途径低;但
黏类小麦细胞质雄性不育系育性基因单一，不育性彻
底，易恢复性高，为小麦雄性不育研究和杂种优势多途
径利用提供了极有利的材料基础。
对黏类小麦 1BL /1RS 雄性不育系和非 1BL /1RS
雄性不育系的研究表明，绝大多数 1BL /1RS 易位型雄
性不育系及其 F1 都会产生一定频率的单倍体，且育性
恢复性变异较大，部分不育系随转育世代增高其育性
表现不稳定等现象。近年来培育的黏类非 1BL /1RS
不育系，已较好地克服了上述缺点，现正在大量进行强
优势组合的组配与筛选，有望在生产上获得突破。
本研究将杀雄剂途径与黏类小麦雄性不育三系途
径相结合，选用特定小麦种质材料 1BS 上带有不育基
因 rfv1 的非 1BL /1RS 普通小麦变种为供体，以杀雄剂
途径组配出的强优势组合的母本为受体，实现 rfv1 基
因的定向转入，从而创制黏类非 1BL /1RS 小麦雄性不
育新保持系(新恢复系已另文报道)，克服杀雄剂途径
与黏类小麦雄性不育三系途径各自的缺陷，充分发挥
各自优点，从而建拓出一套杂交小麦杂种优势利用的
新途径，为三系杂交小麦早日进入生产应用提供理论
依据和技术支撑。
1 材料与方法
1. 1 材料
以西北农林科技大学陕西省作物杂种优势研究与
利用重点实验室选育出的杂交小麦新品种“西杂 1
号”母本西农 Fp1(1BL /1RS 易位系，Triticum aestivum)
和“西杂 5 号”母本西农 Fp2(非 1BL /1RS 易位系，T.
aestivum)为 1BS rfv1染色体定向转换受体;1BS 上带有
黏类小麦雄性不育基因 rfv1的非 1BL /1RS 普通小麦变
种 SP4(T. spelta var. duhamelianum )和莫迦小麦(T.
macha var. subletschchumicum)为染色体定向转换供
体［3］ ，受体和供体分别组配杂交，选用杂交 F1 及回
交各世代种子及植株为试验材料，中国春和黑麦作为
对照，并辅以部分中国春小麦染色体工具材料 CS1BL、
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CS1BS，CS1BN，CS1DN，CS1B01DⅣ作为对照对检测结
果进行验证分析。
1. 2 回交转育
以“西杂一号”母本西农 Fp1(1BL /1RS 易位系)
和“西杂五号”母本西农 Fp2(非 1BL /1RS 易位系)为
轮回亲本，使其与 SP4 和莫迦小麦的杂交 F1 代进行连
续置换回交。对回交后代进行农艺性状的选择和不育
基因定向转入的鉴定，选择农艺性状相似于轮回亲本，
且含有不育基因 rfv1 的后代再进行连续回交，以保证
后代具有轮回亲本遗传背景的同时又含有不育基因
rfv1。如此连续回交 4 ～ 5 代，再对回交后代自交纯化，
即可育成既具有西农 Fp1 和西农 Fp2 优良农艺性状又
含有不育基因 rfv1 的新保持系(图 1，图 2)。
图 1 西农 Fp1 的专一核置换回交转育法示意图
Fig. 1 Transduction of gene rfv1 into the targeted female parents Xinong Fp1
图 2 西农 Fp2 的专一核置换回交转育法示意图
Fig. 2 Transduction of gene rfv1 into the targeted female parents Xinong Fp2
1. 3 染色体制片
将回交各代的种子用 1% H2O2消毒处理 12h 后，
清水冲洗滤净置于铺有吸水纸的培养皿中，放入光照
培养箱(24℃)中培养，当根长至 1 ～ 2cm 时，分别取根
尖于 0℃ ～ 4℃冰水中预处理 20 ～ 22h，然后转入 3 ︰ 1
(95%乙醇︰冰乙酸)卡诺氏固定液固定 1 ～ 2d 后，用
1. 5%醋酸洋红染色 2h 以上，45%冰乙酸压片观察或
先转入 70%乙醇中 4℃保存，同时将已切取根尖的种
子放入 4℃展示柜沙培。
1. 4 复合引物多重 PCR
1. 4. 1 小麦基因组总 DNA 的提取 采用 2 × CTAB
法，提取供试植株三叶期幼嫩叶片的总 DNA。按苯酚
∶氯仿 ∶异戊醇 = 25∶ 24 ∶ 1，以无水乙醇沉淀 DNA，反复
操作 3 ～ 4 次，直至最后提取的絮状沉淀物为白色或微
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6 期 黏类小麦 CMS 不育基因 rfv1 的分子细胞遗传学跟踪鉴定及定向转育研究
带淡黄色。
1. 4. 2 引物序列的合成 根据文献［4 ～ 6］合成 Glu-
B3 的 STS-PCR 引物和 Sec-P1 与 P2 引物，由北京六合
华大基因科技股份有限公司合成。引物序列为:
Glu-B3 F:GGTACCAACAACAACAACCC; R:
GTTGCTGCTGAGGTTGGTTC
Sec-P1:ACCTTCCTCATCTTTGTCCT;
Sec-P2:CCGATGCCTATACCACTACT
其中，Glu-B3 的 STS-PCR 引物位于小麦 1BS 上，
其 PCR 产物约 630bp;Sec-P1 与 P2 引物位于黑麦 1RS
上，其 PCR 产物约 1076bp。因此，若材料为 1BL /1RS
易位纯合体，则能扩增出约 1076bp 的条带;若为非
1BL /1RS 易位的普通小麦材料，则能扩增出约 630bp
的条带;若为 1BL /1RS 易位杂合体，则能同时扩增出
1076 和 630bp 的条带。
1. 4. 3 PCR 反应的体系及程序 PCR 反应体系为 20
μl，包 含 1 × Buffer、MgCl2 1. 6mmol /L、dNTPs 0. 2
mmol /L、Taq DNA 聚合酶 1. 5U、每条引物 0. 2μmol /
L、模板 DNA 100ng。反应程序:94℃ 预变性 6min;
94℃变性 1min，62℃退火 3min，72℃延伸 1min，5 个循
环;94℃变性 50s，62℃退火 1min，72℃延伸 50s，35 个
循环;最后 72℃终延伸 10min，4℃保存。用 1% 琼脂
糖凝胶电泳检测 PCR 产物。
1. 5 高低分子量谷蛋白亚基的 SDS-PAGE 分析
切取 1 /3 粒小麦种子(无胚端)进行研磨，将粉末
转移到 1. 0ml 离心管，按文献［7，8］方法，配制提取液
A(50%异丙醇)、提取液 B(50%异丙醇 + 0. 04mol /L
Tris-Hcl，pH8. 0 + 10% SDS + 2%二硫苏糖醇)和提
取液 C(0. 625mol /L Tris-Hcl，pH6. 8 + 20% 甘油 +
2% SDS + 0. 2%溴酚蓝)提取高低分子量谷蛋白。
配制浓度为 7. 5%和 17%的分离胶，3. 7%的浓缩
胶，采用梯度密度电泳，以便更好地分离出不同分子量
的蛋白条带。电泳时浓缩胶每板电流 15mA，分离胶
每板电流 20mA，电泳 10h。
1. 6 醇溶蛋白的 A-PAGE 分析
从提取谷蛋白的同一粒种子中再切取 1 /3(无胚
端)研磨，将面粉转入 1. 0ml 离心管，加入提取液
500ml［提取液含 0. 05%(质量 /体积)甲基绿，25% 2s-
氯乙醇］，振荡混匀，4℃提取过夜，次日 1000r /min 离
心 10min，将上清液转移至另一干净离心管，冷藏备
用。
配制凝胶(凝胶溶液含 10%丙烯酰胺，0. 5%甲叉
双丙烯酰胺，6%尿素，0. 005%硫酸亚铁，0. 1%抗坏血
酸，0. 1%甘氨酸，2%醋酸)，采用改进的 ISTA 聚丙烯
酰胺凝胶电泳(pH3. 2)标准程序进行电泳［9］。
2 结果与分析
2. 1 根尖染色体观察与分析
1BL /1RS 易位系小麦是指小麦的 1B 染色体短臂
被黑麦的 1R 染色体短臂所取代。一般情况下，普通
小麦 1B 和 6B 为带有随体的染色体，在光学显微镜下
可观察到清晰的 4 个随体。黑麦 1RS 也具有随体，但
由于小麦背景的核仁组织者(NOR)对黑麦的 NOR 的
排斥而造成黑麦 NOR 不能表达，看不到 1RS 随体，因
而 1BL /1RS 纯合易位系中随体数仅为 1 对，即 1 对
6BS 随体。
对西农 Fp1、SP4、莫迦及其部分回交后代的根尖
细胞在光学显微镜下进行观察，结果西农 Fp1 带有 2
个随体(图 3)，SP4、莫迦小麦均带有 4 个随体(图 4)，
进一步证实了西农 Fp1 为 1BL /1RS 易位系，SP4、莫迦
小麦为非 1BL /1RS 普通小麦变种。不育基因 rfv1 位
于 1BS 上，与随体连锁。对其回交后代进行根尖细胞
学镜检时，若观察到 3 个随体(图 5)，即 1BL /1RS 易
位杂合体(1BL /1RS·1BL /1BS rfv1)，且细胞数目占观
察总细胞数的 75%以上，则可证明该个体一定含有携
带 rfv1 不育基因的 1BS 染色体，保留该个体，并加代种
植。
图 3 西农 Fp1 根尖染色体(2 个随体)
Fig. 3 Chromosomes in roots-tip of
Xinong Fp1(two satellites)
图 4 SP4 小麦根尖染色体(4 个随体)
Fig. 4 Chromosomes in roots-tip of
SP4(four satellites)
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图 5 回交后代根尖染色体(包含 1 条
1BL /1BS rfv1和 1 对 6B 随体染色体)
Fig. 5 Chromosomes in roots-tip of backcross
generations (containing one chromosome with
1BL /1BS rfv1 and a pair of 6B satellites)
2. 2 复合引物多重 PCR 检测的可靠性验证
2. 2. 1 亲本及部分工具材料的 PCR 检测 对西农
Fp1(1BL /1RS 易位系)、SP4、莫迦小麦亲本材料和中
国春、黑麦、CS1BL、CS1BS、CS1BN、CS1DN、CS1B01 DⅣ
等进行复合引物 PCR 检测，发现西农 Fp1、黑麦只扩增
出了约 1076bp 的 条 带，SP4、莫 迦 小 麦、中 国 春、
CS1BS、CS1DN 只扩增出 630bp 的条带，而 CS1BL、
CS1BN 和 CS1B01DⅣ无扩增产物。对根尖鉴定为 2 个
随体和 3 个随体的回交后代植株进行复合引物 PCR
检验分析，发现根尖鉴定为 2 个随体的 1BL /1RS 易位
纯合体只扩增出了 1076bp 的条带，而根尖鉴定为 3 个
随体的 1BL /1RS 易位杂合体同时扩增出了 630 和
1076bp 的条带(图 6)。这一检测结果与材料本身染
图 6 亲本及部分工具材料的复合 PCR 扩增结果
Fig. 6 Results of multiplex PCR of parents and partial tool material varieties
泳道:1:中国春;2:黑麦;3:CS1BL;4:CS1BS;5:CS1BN;6:CS1DN;7:CS1B01 DⅣ;8:SP4;9:西农 Fp1;
10:莫迦小麦;11 ～ 20:根尖鉴定为 3 个随体的后代;21 ～ 27:根尖鉴定为 2 个随体的后代;M:100bp DNA Ladder
Lane:1:Chinese spring;2:rye;3:CS1BL;4:CS1BS;5:CS1BN;6:CS1DN;7:CS1B01 DⅦ;8:SP4;9:Xinong Fp1;
10:Triticum macha;11 ～ 20:Three satellites by chromosome of roots-tip preparations;21 ～ 27:Two satellites by chromosome of
roots-tip preparations;M:100bp DNA Ladder
色体构型和根尖鉴定结果完全吻合，证明了复合引物
PCR 检测的可靠性。
2. 2. 2 西农 Fp1 与 SP4、莫迦小麦的 BC3 群体 PCR 检
测 利用复合引物 PCR 分子标记对供试 BC3 代群体
进行大批量筛选鉴定，淘汰 1BL /1RS 易位纯合体
(1BL /1RS· 1BL /1RS)，保留 1BL /1RS 易位杂合体
(1BL /1RS·1BL /1BS rfv1)，回交后代的种子，来年进行
田间种植。回交 3 代后代植株若为 1BL /1RS 易位纯
合体(1BL /1RS·1BL /1RS)，则只能扩增出 1076bp 的
条带，若为 1BL /1RS 易位杂合体(1BL /1RS· 1BL /
1BS rfv1)，则能同时扩增出 1076 和 630bp 条带(图 7)。
2. 3 SDS-PAGE 分析
西农 Fp2(1BL /1BS·1BL /1BS)和 SP4、莫迦小麦
(1BL /1BS rfv1·1BL /1BS rfv1)均为非 1BL /1RS 易位系，
根尖染色体数目为 2n = 42，4 个随体。其回交转育后
代也为非 1BL /1RS 易位系，不能采用根尖染色体随体
观察和复合引物 PCR 进行不育基因 rfv1 定向转入的
鉴定。故利用 SDS-PAGE 对西农 Fp2、SP4、莫迦小麦
及其回交置换后代进行高低分子量谷蛋白亚基组成分
析。在高分子量谷蛋白亚基(HMWs-GS)的 Glu-B1 位
点，西农 Fp2 和莫迦小麦亚基组成均为 7 + 8，SP4 为 6
+ 8。在低分子量谷蛋白亚基(LMWs-GS)的 D 亚基区
发现了特异亚基(图 8)，且该亚基为 SP4 和莫迦小麦
所特有，西农 Fp2 不具有。回交后代中，可将其作为示
踪 SP4 或莫迦小麦的 1BS
rfv1染色体定向导入的标记，
选择具有特异亚基的相对应的后代种子，来年种植。
2. 4 A-PAGE 分析
对西农 Fp2 (1BL /1BS· 1BL /1BS)、莫迦小麦
(1BL /1BS rfv1·1BL /1BS rfv1)及其回交转育后代进行醇
溶蛋白的 A-PAGE 分析，在醇溶蛋白的 ω 区发现一条
特异醇溶蛋白条带，且该特异条带为莫迦所特有，西农
Fp2 不具有。莫迦小麦、西农 Fp2 /莫迦小麦杂种 F1，
均存在该特异条带(图 9 箭头所示)，而西农 Fp2 明显
不具有该蛋白条带。因此回交后代若含有该特异蛋白
条带，则可认为该个体含有莫迦(或 SP4)的 1BS
rfv1染
色体，保留该类个体种子并种植。
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6 期 黏类小麦 CMS 不育基因 rfv1 的分子细胞遗传学跟踪鉴定及定向转育研究
图 7 西农 Fp1 / SP4 的部分 BC3 群体的复合引物 PCR 扩增结果
Fig. 7 Results of multiplex PCR products of BC3 generations of Xinong Fp1 /SP4
1 ～ 17:西农 Fp1 / SP4 的部分 BC3 植株;M:100bp DNA Ladder
1 ～ 17:BC3 generations of Xinong Fp1 / SP4;M:100bp DNA Ladder
图 8 西农 Fp2 /莫迦部分回交 3 代及西农 Fp2 / SP4 部分回交 1 代种子的 SDS-PAGE 分析
Fig. 8 SDS-PAGE analysis of BC3 generations of Xinong Fp2 /Macha and BC1 generations of Xinong Fp2 /SP4
泳道:1:中国春;2:西农 Fp2;3:莫迦;4 ～ 14:西农 Fp2 /莫迦 BC3 植株;15:西农 Fp2;16:SP4;
17 ～ 29:西农 Fp2 / SP4 BC1 植株;箭头示特异亚基条带
Lane:1:Chinese spring;2:Xinong Fp2;3:Macha;4 ～ 14:BC3 of Xinong Fp2 /Macha;15:Xinong Fp2;16:SP4;17 ～ 29:
BC1 of Xinong Fp2 / SP4 . The arrows show the special subunits
图 9 西农 Fp2 /莫迦小麦部分回交 3 代种子的 A-PAGE 分析
Fig. 9 A-PAGE analysis of BC3 generations of Xinong Fp2 /Macha
泳道:1:中国春;2:西农 Fp2;3，4:西农 Fp2 /莫迦小麦杂种 F1;5:莫迦小麦;6 ～ 13:西农 Fp2 /莫迦回交 3 代。箭头示特异醇溶蛋白条带。
Lane:1:Chinese spring;2:Xinong Fp2;3，4:F1 of Xinong Fp2 /Macha;5:Macha;6 ～ 13:
BC3 of Xinong Fp2 /Macha. The arrows show the special gliadins.
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3 讨论
3. 1 小麦根尖细胞染色体镜检与复合引物 PCR 联合
鉴定 1BL /1RS 易位杂合体
本研究中，准确有效地鉴定 1BL /1RS 易位纯合体
(1BL /1RS· 1BL /1RS)和易位杂合体(1BL /1RS·
1BL /1BS rfv1)对于跟踪鉴定莫迦小麦和 SP4 所携带的
不育基因 rfv1 的定向转入具有重要意义。不育基因
rfv1 位于 1BS 上，与 1BS 染色体随体连锁。本试验采
用根尖染色体随体观察和复合引物 PCR 对西农 Fp1
回交后代进行 1BL /1RS 易位纯合体和杂合体的鉴定，
以鉴定的 1BL /1RS 易位杂合体 (1BL /1RS· 1BL /
1BS rfv1)作为跟踪不育基因 rfv1 定向转入的标记。两者
鉴定结果一致，验证了复合引物 PCR 鉴定的可靠性。
多重 PCR 是近几年兴起的一项新技术［10］，它高
效快捷、高度特异敏感、能够降低试验成本，节省时间，
很适宜于大样本的植物生物学研究。由于根尖染色体
制片采用种子发根后切取部分根尖进行观察，然后将
切取根尖的种子置于 4℃沙培，这样既不利于后代植
株的正常生长，也不适合回交后代不育基因 rfv1 的大
规模早期快速鉴定筛选。而利用复合引物 PCR 进行
鉴定筛选，取材为田间植株三叶期少量叶片，不会影响
植物正常生长，同时也是一种适于大规模的快速有效
的早期鉴定筛选不育基因的分子标记辅助育种方法。
3. 2 利用 SDS-PAGE 与 A-PAGE 技术示踪非 1BL /
1RS 小麦雄性不育基因
尽管目前分子标记技术在很多领域被广泛应用，
但由于小麦贮藏蛋白组成具有高度的异质性、复杂性
和遗传稳定性，利用 SDS-PAGE 和 A-PAGE 电泳仍然
是进行小麦品质检测和近等基因系鉴定的一种有效工
具。1975 年，Bietz 将编码“中国春”HMWs-GS 基因定
位于第一同源群染色体 1B、1D 的长臂上，并提出这 2
个位点是具有多等位基因的复合位点，这一结论得到
随后的研究证实［11］ 。而 LMWs-GS 与醇溶蛋白相似，
被定位于染色体 1A、1B、1D 短臂上，由紧密连锁的基
因簇控制［12］ 。LMWs-GS 又分为 B 亚基、C 亚基和 D
亚基，D 亚基的迁移率大致在 A 和 B 组亚基之间，接
近醇溶蛋白的 ωs-醇溶蛋白的迁移率，由位于第 1 同
源染色体群短臂上的位点编码［13］ 。Nieto-Taladriz
等［14］ 提出，D 型 LMWs-GS 是由编码典型 B 型 LMW-
GS 的相同位点 Glu-B3 编码。在 A-PAGE 中，醇溶蛋
白分为 α、β、γ、ω 四个区［15］ ，现已证实全部的 ω -醇
溶蛋白、大部分 γ -醇溶蛋白和少数的 β -醇溶蛋白的
控制基因位于第 1 同源染色体的短臂上，所有 α -醇溶
蛋白、多数的 β -醇溶蛋白和部分 γ -醇溶蛋白由第 6
同源染色体短臂上的基因控制。
本试验采用 SDS-PAGE 和 A-PAGE 对西农 Fp2 及
其回交转育后代进行高低分子量谷蛋白亚基和醇溶蛋
白的鉴定，寻找与黏类小麦雄性不育基因 rfv1 表达有
关的特异亚基或特异醇溶蛋白条带作为跟踪 SP4 和莫
迦小麦的 1BS rfv1染色体的标记，从而进一步对回交转
育后代目标基因 rfv1 进行选择，最终获得黏类非 1BL /
1RS 雄性不育系的新保持系。研究表明，在 LMW-GS
的 D 亚基、醇溶蛋白的 ω 区发现了特异蛋白条带，其
他区尚未发现明显差异带，可能是本试验材料为 BC3，
已近似为近等基因系，只存在 1BS 上基因的差异，而
谷蛋白的 HMW-GS 区、LWM-GS 的 B、C 区以及醇溶蛋
白的 α、β、γ 区不表达第 1 同源染色体 1BS 上的该目
的基因。
此外，本研究认为 1BL 上高分子量谷蛋白亚基
(如 SP4 的 6 + 8 亚基)在低代(如回交 1 代，回交 2
代)时可以作为筛选材料的依据，但随着回交代数的
增加，后代与轮回亲本具有相同遗传背景，为近等基因
系，只存在 1BS 上目标基因 rfv1 的差异，因而其供体亲
本(SP4、莫迦小麦)1BL 上的亚基必然会丢失。所以，
鉴定黏类非 1BL /1RS 小麦不育基因 rfv1 的定向转入
还是应以 LMW-GS 和醇溶蛋白所反应的差异蛋白条
带为主。而 PAGE 方法对谷醇溶蛋白的分辨率不
高［16］，若要更深入地了解这种差异，需要借助更精密
的仪器和更高分辨率的方法，如反相高压液相色谱
(RP-HPLC)和毛细管电泳(CE)进行分析。
4 结论
本研究将小麦杂种优势利用中的杀雄剂法和三系
法相结合，利用染色体定向转移技术，采用专一核置换
回交转育方法，将非 1BL /1RS 普通小麦变种 SP4 或莫
迦小麦中携有 rfv1 不育基因的 1BS
rfv1 染色体定向转
移到由杀雄剂法组配的强优势组合的母本，并对各代
回交后代进行了不育基因定向转入的跟踪检测。其
中，复合引物 PCR 鉴定结果准确，试验成本低，提高了
黏类非 1BL /1RS 雄性不育新保持系和不育系的定向
选育效率。同时这一方法亦可应用于黏类小麦雄性不
育恢复系的定向转育，进而可实现小麦由生理型不育
向遗传型不育的定向转化，从而建拓一套杂交小麦强
优势组合多途径利用的新方法。
0311
Journal of Nuclear Agricultural Sciences
2010，24(6):1124 ～ 1131
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(责任编辑 王媛媛)
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