全 文 ：中棉所 12 ( Gossypi um hi rsut um C. V.
Zhongmian 12)体细胞胚发生及植株再生
何道一　李雅志　王桂荣
(山东农业大学遗传所　泰安　271018)
通过对不同外植体的研究 ,发现幼胚下胚轴是理想的外植体材料 ;2 ,42D 和 ZT
是中棉所 12 体细胞胚发生的关键植物生长调节物。从愈伤组织诱导到大量再生植
株只需 4 个月左右的时间。
关键词 :中棉所 12 　体细胞胚胎发生 　植株再生
此文于 1997 年 9 月 3 日收到。3 本研究得到山东省科委资助。
前 　　言
棉花组织培养工作是许多现代棉花育种手段的基础 ,在建立高频植株再生体系后 ,棉花转
基因、离体诱变以及人工种子等方面的研究能够更顺利地进行。尽管近年来这方面的研究取
得较大进展 ,许多棉花品种能成功地再生植株[2 ,3 ,4 ] 。但是 ,目前生产上所采用的许多优良品
种培养难度仍较大 ,开展对优良品种组织培养的研究无疑很有意义。中棉所 12 是目前生产上广
泛推广的高产优质抗病的优良品种 ,本文就其体细胞胚发生再生完整植株的初步研究进行报道。
材 料 与 方 法
供试材料 　中棉所 12 种子由山东省棉花中心提供。干胚材料 ,种子脱绒后 ,温水浸泡
1d ,去壳 ,用 011 %HgCl2 灭菌 8min ,接种于含 016 %琼脂的空白培养基上萌发。5d 后 ,取其胚
轴和子叶。幼胚材料 ,自花授粉 20d 的幼胚 ,接种于幼胚培养基上培养 ,待幼胚萌发后 ,取其胚
轴和子叶 ,幼胚培养基为 MS + GA3011mg/ L + IAA015mg/ L 。
组织培养 　外植体接种于脱分化培养基中培养 ,待形成大量愈伤组织后 ,一部分材料在原
培养基上继代保持 ,另一部分材料转接于分化培养基上 ,30d 后 ,产生明显可区别的胚性和非
胚性愈伤组织 ,继代 1 次 ,胚性愈伤组织上产生大量体细胞胚 ,将体细胞胚转接于萌发培养基
上 ,4wk 后可再生出完整植株。脱分化培养基为 MS + KT015mg/ L + 2 , 42D 011mm/ L +
ZT0105mg/ L 。分化培养基为 MS + ZT012mg/ L + IAA011mg/ L 。体细胞胚萌发培养为 MS +
IAA 011mg/ L 。
233　 核 农 学 报　1998 ,12 (6) :332～336Acta A gricult urae N ucleatae Sinica
结 　　果
(一)不同外植体对愈伤组织及体细胞胚发生的影响
表 1 　不同外植体与其愈伤组织诱导频率
Table 1 　The explants and their callus formation rate
外植体
Explant
外植株数
The number
of explants
愈伤组织数
The number
of callus
诱导率
Induction rate
( %)
成熟胚
Mature embryo
子叶
Cotyledon
下胚轴
Hypocotyl
120
120
35
64
2911
5810
幼胚
Immature embryo
子叶
Cotyledon
下胚轴
Hypocotyl
120
120
115
103
9518
8518
　　不同来源的外植体材料形成愈伤组织的能力明显不同。从表 1 中看出 ,幼胚材料愈伤组
织发生能力明显高于干胚材料。在干胚材料中 ,下胚轴比子叶更易形成愈伤组织 ,而在幼胚材
料中 ,子叶的愈伤组织形成能力又明显高于下胚轴。反映了两类材料脱分化特性的差异。不
同外植体产生的愈伤组织类型也不相同 ,尽管在愈伤组织诱导培养基上产生的愈伤组织基本
相似 ,为灰色稀泥状 ,但愈伤组织转移至分化培养基上产生的次生愈伤组织明显不同 ,干胚和
幼胚的子叶都形成灰白色松脆型愈伤组织 (图版 Ⅰ27) ,两者之间没有明显区别 ,这种愈伤组织
培养至今未发现有体细胞胚发生。干胚胚轴产生两种类型次生愈伤组织 ,一种是绿色坚硬类
型 ,另一种是淡绿色松脆类型 ,前者没有体细胞胚发生 ,后者有少量类似芽体结构和根状物发
生。幼胚胚轴产生的次生愈伤组织有 3 种类型 ,第 1 种是淡绿色松脆型 ,与干胚胚轴的极为相
似 ,但却有少量体细胞胚产生 ;第 2 种是淡黄色颗粒状愈伤组织 (图版 Ⅰ28) ,这种类型愈伤组
织能够大量产生体细胞胚 ;第 3 种类型是白色坚硬的愈伤组织 ,它没有体细胞胚发生能力。
(二)植物生长调节物质对愈伤组织形成及体细胞胚发生的影响
以幼胚下胚轴为材料研究几种植物生长调节物质对愈伤组织形成及胚性愈伤组织产生的
表 2 　植物生长调节物对愈伤组织及胚性愈伤组织诱导的影响
Table 2 　The effect of the plant growth regulators on
induction of callus and embryogenic callus( %)
培养基
Medium
外植体数 ( %)
The number of explants
愈伤组织诱导率
Induction rate
of callus
胚性愈伤组织比例
The rate of
embryogenic callus
a 95 40 0
b 95 42 0
c 95 89 0
d 95 87 6215
　　 Note :a :MS + KT 015 + IAA 011 ;b :MS + KT 015 + IAA 011 + Z T0105 ;c :MS + KT 015 + 2 ,42D 011 ;
d :MS + KT 015 + 2 ,42D 011 + ZT 0105 (mg/ L) .
333　6 期 中棉所 12 ( Gossypium hi rsut um C. V. Zhongmian 12)体细胞胚发生及植株再生
影响 ,结果见表 2。诱导愈伤组织形成 ,2 ,42D 比 IAA 更有效 ,在预备试验中曾研究过 NAA、
IBA 对愈伤组织诱导的作用 ,也发现 2 ,42D 诱导形成愈伤组织能力最强。ZT 对于形成胚性愈
伤组织具有重要作用 ,在我们所试的培养基中 ,只有在含有 ZT 的培养基上形成的愈伤组织转
至含有 ZT 的分化培养基上 ,才能有体细胞胚胎发生。其它几种激素都不能代替 ZT 的作用。
(三)体细胞胚胎发生及植株再生
在脱分化培养基上诱导形成的愈伤组织转至分化培养基上 ,1wk 后 ,愈伤组织大多发生褐
变 ,20d 后从褐变的组织周缘产生出次生愈伤组织 ,这些愈伤组织明显表现出如前所述的不同
形态类型。将淡黄色粒状愈伤组织在分化培养基上继代培养 ,3wk 可看到不同发育时期的体
细胞胚产生 (图版 Ⅰ25) ,将子叶形体细胞胚分散在体细胞胚萌发培养基上 ,2wk 后 ,子叶增大 ,
约 30d 可再生出大量正常完整植株 (图版 Ⅰ22)或不正常植株。从愈伤组织诱导到植株再生整
个过程需 4 个月左右的时间 ,而且胚性愈伤组织继代至今 (2a) 仍有大量体细胞胚产生。胚性
愈伤组织产生的体细胞胚有多种类型 ,其中以双子叶型 (图版 Ⅰ23) 为主 ,约占 65 % ,它们萌发
后产生正常完整植株 (图版 Ⅰ21) ,其它畸形胚包括单子叶型和连体型等 (图版 Ⅰ24) ,单子叶型
胚萌发产生顶芽的单子叶结构 (图版 Ⅰ26) 。
图 版 Ⅰ
11 再生的完整植株。21 体细胞胚萌发大量再生植株。31 正常体细胞胚。41 不正常连体胚。51 胚性愈伤组织及体细胞
胚发生。61 单子叶胚萌发产生的结构。71 子叶产生的非胚性愈伤组织。81 幼胚胚轴产生的胚性愈伤组织。
Plate Ⅰ
1. Regeneratd plant . 2. Regeneration of the large number plants from somatic embryo. 3. Normal somatic embryo. 4. Anomalous
somatic embryo. 5. Embryogenic callus and embryogenesis. 6. The structure of germination of anomalous somatic embryo with
monocotyledon. 7. The nonembryonic callus induced from the cotyledon. 8. The embryogenic callus induced from hypocotyl of the
immature embryo.
433 核　农　学　报 12 卷
讨 　　论
许多研究表明 ,不同基因型棉花品种体细胞胚发生能力明显不同 ,中棉所 12 曾被认为是培
养难度较大的品种类型[8 ]。张大力等[5 ]报道中棉 12 得到非胚性愈伤组织 ,我们通过改变外植体
的来源和不同生长调节物质组合 ,成功地诱导中棉所 12 产生体细胞胚并再生大量植株 ,这一点
给我们一个启示 :不排除基因型差异的存在 ,能否通过改变外植体、培养条件与方法以及其它因
素 ,使目前被认为难以再生的优良棉花品种得以培养成功。从植物组织培养技术发展的历程来
看 ,这是可能的。若实现这一目标 ,将有利于利用生物技术手段培养棉花新品种。
外植体和植物生长调节物是影响中棉所 12 产生体细胞胚的两个关键因素 ,下胚轴一直被
认为是陆地棉培养的理想材料 ;在中棉所 12 培养过程中发现 ,成熟胚下胚轴诱导的愈伤组织
较难形成体细胞胚 ,只有在继代时间很长的情况下 ,才分离出少量胚性愈伤组织 ,但幼胚下胚
轴却是理想的培养材料。Bhojwani[10 ]曾认为在生长素存在情况下诱导胚性愈伤组织 ,在低浓
度或无生长素培养基上体细胞胚进一步发育 ,而我们在实验中发现 ,2 ,42D 和 ZT 都是中棉所
12 体细胞胚发生不可缺少的植物生长调节物质。
目前有关陆地棉体细胞胚发生大都需长时间继代或悬浮培养[2 ,12 ] ,这使再生的植株产生
变异的可能性增加[6 ,9 ] ,这样虽更有利于体细胞无性系变异的筛选 ,但也给离体诱导带来一定
困难 ,即增加了非期望的变异。刘春明等[1 ]曾报道珂字棉的 3 步培养法 ,这与我们建立的中棉
所 12 再生体系基本类似。该法培养周期短 ,植株产生变异的可能性小 ,因而更适于进行基因
转化和离体诱变。
目前能够诱导体细胞胚发生及植株再生的棉花品种多为珂字棉系列和生产上已不采用的
老品种[3 ,6 ,9 ] ,虽然也有优质高产的品系培养成功的报道[7 ] ,但象中棉所 12 这样在生产上大面
积推广的优良品种能够建立高频体细胞胚发生及植株再生体系更有现实意义 ,它将更有利于
棉花优良品种遗传操作的研究 ,特别是离体诱变和基因转化的研究。
参 考 文 献
1 　刘春明 ,姚敦义. 陆地棉体细胞胚发生及其细胞组织学观察. 植物学报 ,1991 ,33 (5) :378～384
2 　陆志贤 ,李淑君. 棉花细胞悬浮培养胚胎发生和植株再生某些特性的研究. 中国农业科学 ,1987 ,20 :6～11
3 　张献龙等. 棉花体细胞培养及其应用基础研究. 华中农业大学学报 ,1993 ,12 (5) :421～426
4 　时香玉等. 海岛棉突变系体细胞培养及植株再生研究. 核农学报 ,1996 ,10 (4) :221～227
5 　张大力 ,王吉吉之. 陆地棉的组织培养和胚胎发生. 植物学报 ,1989 ,31 (2) :161～163
6 　王吉吉之等. 陆地棉胚性愈伤组织的变异及高频胚胎发生. 植物学报 ,1994 ,36 (5) :331～338
7 　吴夫安等. 陆地棉优良新品系高频率再生细胞系筛选. 山东农业科学 ,1991 ,5 :11～14
8 　董合忠. 棉花体细胞胚发生和植株再生. 植物生理学通讯 ,1990 ,2 :8～12
9 　张献龙等. 陆地棉体细胞胚发生与植株再生. 遗传学报 ,1991 ,18 (5) :461～467
10 　Bhojwani S , S , Hazdan M K. Somatic embryogenesis in“Plant Tissue Culture : Theory and Practice”, Elsevier ,Amsterdam ,
1983 ,91.
11 　Davidonis G H ,Hamilton R H. Plant regeneration from callus of Gossypium hirsutum L . Plant Sci. Let . 1983 ,32 :89～93
12 　Trolinder N. L , Goodin J R. Somatic embryogenesis in cotton ( Gossypium hiysut um L . ) I. Effect of explant and hormone
regime. Plant Cell Tissue and Organ Culture. 1988 ,12 :31～42
533　6 期 中棉所 12 ( Gossypium hi rsut um C. V. Zhongmian 12)体细胞胚发生及植株再生
SOMATIC EMBRYOGENESIS AND PLANT REGENERATION IN
Gossypium hi rsutum L. cv. ZHONGMIAN 12
He Daoyi 　Li Yazhi 　Wang Guirong
( S handong A gricult ural U niversity , Taian 　271018)
ABSTRACT
The study on explants ,the cotyledon and hypocotyl from the mature and immature embryo ,
suggests that the hypocotyl from immature embryo is a suiltable explant for embryogenesis in
Zhongmian 12. As plant growth regulators ,2 ,42D and ZT play an essential role in embryogene2
sis . The rapid establ ishment of embryogenesis system has been complished. It take about 4
months from callus induction to plant regeneration.
Key words : Gossypi um hi rsut um cv. Zhongmian 12 ,somatic embryogenesis ,plant regenera2
tion.
633 Acta A gricult urae N ucleatae Sinica
1998 ,12 (6) :332～336