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AgNO3对苹果叶片培养的
影响及其与乙烯产生的关系
陈喜文 3 　范　晖　裘立群　王其会
(山东农业大学作物遗传育种研究所　泰安　271018)
此文于 1995 年 12 月 18 日收到。3 现通信地址 :南开大学生命科学学院 300071。
在附加 62BA 310mg/ L 、IBA0105mg/ L 的 MS 再生培养基中加入 1～100μmol/ L
AgNO3 ,均显著促进苹果叶片再生不定芽 ,但以 1μmol/ L 浓度效果最好。与对照相
比 ,在培养早期 (2～5d) ,1μmol/ L AgNO3对乙烯的抑制率为 16 %～20 % ,在培养中
后期则为 25 %～40 % ,因而显著降低了各培养时期 ,特别是中后期 (芽分化期) 培养
容器中乙烯的浓度 ,降低了乙烯对芽发生的抑制 ,从而促进不定芽的发生。
关键词 :AgNO3 　叶片培养 　苹果 　乙烯
前 　　　言
苹果为多年生木本植物 ,其现有品种都是高度杂合的 ,遗传基础极为复杂 ,常规育种所需
年限长 ,占据空间大 ,要保持原品种优良特性难度极大。植物组织培养和诱变技术相结合为苹
果育种开辟了途径 ,而高效、稳定植株再生系统的建立则是其中关键的技术之一。
苹果的组织培养国内外已有报道[1 ,2 ] ,但大多仅限于外植体选择、培养条件及基因型等方
面的研究 ,而 AgNO3作为一种乙烯生成与作用抑制剂 ,可显著促进愈伤组织再生不定芽 ,这在
小麦、玉米、油菜、烟草中已有报道[3 - 6 ] ,但对苹果叶片培养的影响 ,因内外尚未见报道。本文
研究 AgNO3对苹果叶片培养的影响及其与乙烯产生的关系。
材 料 与 方 法
材料 　用于离体培养研究的叶片取自苹果 Gala 品种的试管苗 ,其扩繁培养基为 MS 附加
310mg/ L 62BA ,011mg/ L NAA。
叶片培养 　试管苗在培养基上生长 30d 后 ,取其顶端完全展开的叶片 ,去除叶柄 ,以下面
3 种方式切割 :11 完整叶片 ;21 沿主脉横向均匀地在叶上轻划 2 条切痕 ;31 沿主脉横向将叶
等分成 3 个独立小块。以远轴面着培养基的方式接种在附加 310mg/ L 6、BA20105mg/ L IBA
的 MS 再生培养基上 ,先在黑暗下培养 20d ,然后转入 10001x 光照下培养 ,培养温度为 25 ℃。
AgNO3处理 　将 AgNO3过滤灭菌后分别以 0、1、10、100μmol/ L 浓度加入到再生培养基
中 ,充分混匀后 ,以 20ml 的等分倒入直径 90mm 培养皿中。选择大小相似的叶片 ,分别以上
93　核 农 学 报　1997 ,11 (1) :39～44Acta A gricult urae N ucleatae Sinica
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述 3 种切割方式接种于培养皿中 ,每皿接种叶片 9 块 , Paraffin 封口 ,45d 统计叶片培养结果 ,
并测定乙烯的产生。
乙烯的测定 　在上述条件下测定乙烯的产生 :11 培养不同时间后 ,取出叶片 ,放入 50ml
三角瓶中 ,加入 5mol 0105mol/ L 磷酸缓冲液 (p H710)后密封 ,于 25 ℃黑暗条件下保温 6h 后 ,
抽出 1ml 气样 ,测定不同培养时期每克鲜重样品每小时产生乙烯的量 ;21 于不同培养时期 ,从
培养皿中抽出 1ml 气样 ,测定培养皿中乙烯的浓度。乙烯的测定在 GC29A 型气相色谱仪中
进行 ,每处理重复 2 次。
结 果 与 分 析
(一)不同切割方式下叶片培养的效果
将叶片接种在培养基上 ,3～5d 始见叶片的膨大 ,8～10d 叶基和切口处可见少量淡黄色
颗粒状愈伤组织 ,16～18d 从愈伤组织上产生肉眼可见的不定芽。不同切割方式下叶片变化
基本相似。主要差异见表 1。划痕切割的叶面膨大非常明显 ,叶面积约增加 30 % ,而整叶和切
块的叶面膨大不明显 ;愈伤组织发生部位不同 ,整叶培养的 ,愈伤组织仅见于叶基处 ,划痕和切
块培养的 ,除叶基外 ,大量愈伤组织发生于切口和伤口处 ;划痕和切块培养的 ,叶片再生百分率
分别为 85 %和 86 % ,显著高于整叶培养的 57 % ;平均每叶再生芽数则以划痕切割最高 ,平均
每叶再生 314 个芽 ,整叶培养的最低 ,平均每叶再生 1 个芽 ,切块培养的则居于两者之间 ,平均
每叶再生 210 个芽。
表 1 　不同切割方式下叶片培养的效果
Table 1 　Effects of leaf culture under different cut methods
切割方式
Cut methods
叶面膨大
Leaf enlarging
愈伤组织 (芽)发生部位
Calli position
(shoots) produced
再生百分率
Regeneration
percentage ( %)
平均每叶再生芽数
No. of shoots produced
from each leaf
整叶 不明显 叶基 57b 3 110c
Whole leaf Not distinct Leaf base
划痕 明显 ,约 30 % 叶基和切口 85a 314a
Trace cut Distinct , Leaf base
about 30 % and cut area
切块 不明显 叶基和切口 86 a 210 b
Piece cut Not distinct Leaf base
and cut area
　3 表中数值经 Duncan′s 测验 ,P = 0105 ,以下同。
　3 Numbers in the table is measured through Duncan′s test ,P = 0105 ,the same as the follows.
(二)不同浓度 AgNO3 对叶片培养的影响
在培养基中加入 0、1、10、100μmol/ L AgNO3 ,苹果叶片分化不定芽的结果见图版 Ⅰ和表
2。1～100μmol/ L AgNO3对 3 种切割方式的叶片再生不定芽均有显著的促进作用 ,且均以
1μmol/ L 效果最好 ,其叶片再生百分率均达到 100 % ,平均每叶再生芽数最高 1512 个 (划痕) ,
最低 815 个 (整叶) ;10μmol/ L 次之 ,叶片再生百分率在 93 %～100 % ,平均每叶再生芽数最高
1012 个 (划痕) ,最低 416 个 (整叶) ;该两种处理与对照相比均达极显著水平 ;100μmol/ L 再
次 ,其叶片再生百分率与对照相比没有显著差异 ,只显著提高了每叶再生芽数。
04 核　农　学　报 11 卷
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在相同 AgNO3浓度的培养基中 ,3 种切割方式均以划痕的叶片再生频率最高 ,平均每叶
再生芽数最多 ,切块次之 ,整叶最低 ,AgNO3处理并不改变这一趋势。
　　图版 Ⅰ　不同切割方式下不同浓度 Ag2
NO3的处理叶片培养效果
1. 整叶 ,2. 划痕 ,3. 切块。
Plate Ⅰ　Effect of leaf culture treated
with different concentrations
of AgNO3 and cut methods
1. Whole leaf ,2. Trace cut ,
3. Pieces cut .
(三) AgNO3对叶片培养过程中乙烯释放量的影响
11AgNO3对不同培养时期叶片乙烯释放量的影响 :叶片培养过程中乙烯释放量的结果见
表 3。不同培养时期叶片乙烯释放量均以 2d 达最高 (峰) 值 ,以后逐渐下降 ,10d 后基本上达
到稳定。3 种叶片切割方式及 AgNO3处理下 ,其变化趋势相同。
3 种切割方式中 ,划痕和切块的叶片 ,培养 2d 和 5d 时乙烯释放量显著高于整叶的 ,但培
养 10d 以后 ,三者之间乙烯释放量没有显著差异。培养基中加入 AgNO3并不改变这一变化趋
势。这也许就是划痕、切块叶片培养再生频率和每叶再生芽数显著高于整叶培养的原因。
AgNO3对不同培养时期叶片乙烯释放量均有一定的抑制作用。培养早期 (2～5d) ,乙烯抑
制率在 16 %～20 % 之间 ,在培养中、后期 ,乙烯抑制率在 25 %～40 %之间 ,三种切割方式之间
没有显著差异。
21AgNO3对不同培养时期容器中乙烯浓度的影响 :不同培养时期容器中乙烯的浓度见表
4。由于培养容器是一相对密闭的系统 ,外植体释放的乙烯在环境中积累 ,因而随着培养时间
的延长 ,容器中的乙烯浓度逐渐达最高值 ,20d 时略有下降。3 种叶片切割方式和 AgNO3处理
均呈现相同的乙烯积累趋势。
AgNO3对不同培养时期容器中乙烯的积累均有一定的抑制作用。处理与对照相比 ,各时
期乙烯浓度的差异均达显著水平。因而降低了乙烯对分化的抑制 ,促进了不定芽的发生。
14　1 期 AgNO3对苹果叶片培养的影响及其与乙烯产生的关系
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表 2 　不同浓度 AgNO3对苹果叶片培养的影响
Table 2 　Effects of different concentrations of AgNO3 on apple leaf culture
AgNO3 浓度
AgNO3 concentration
(μmol/ L)
叶片切割方式
Leaf cut method
叶片再生百分率
Leaf regeneration
percentage ( %)
平均每叶再生芽数
No. of shoots
produced from each leaf
0 整叶 57 d 110 f
Whole leaf
划痕 85 c 314 e
Trace cut
切块 86 c 210 f
Piece cut
1 整叶 100 a 815 c
Whole leaf
划痕 100 a 1512 a
Trace cut
切块 100 a 1112 b
Piece cut
10 整叶 93 b 416 de
Whole leaf
划痕 95 b 1012 b
Trace cut
切块 100 a 716 c
Piece cut
100 整叶 69 d 311 e
Whole leaf
划痕 88 c 519 d
Trace cut
切块 87 c 310 e
Piece cut
表 3 　AgNO3对不同培养时期叶片乙烯释放量的影响
Table 3 　Effects of AgNO3 on ethylene releasing from leaves during different culture stages
AgNO3浓度
AgNO3 concentration
(μmol/ L)
叶片切割方式
Leaf cut method
乙烯释放量
Ethylene released(n1/ h·gFW)
2d 5d 10d 15d 20d
整叶 9107 7132 5198 4172 4151
Whole leaf
0 划痕 14182 10168 6108 5163 5108
Trace cut
切块 13175 10176 5194 5142 5122
Piece cut
整叶 7125 (20) 3 5199 (18) 4128 (28) 3102 (36) 3115 (40)
Whole leaf
1 划痕 11184 (20) 8196 (16) 4152 (26) 3147 (38) 3112 (39)
Trace cut
切块 10175 (19) 8172 (19) 4146 (25) 3139 (37) 3125 (38)
Piece cut
　3 括号中数字为与对照相比的乙烯抑制百分率 ( %) 。
　3 Numbers in brackets are the ethylene surpressing percentage in contrast to the control ( %) 1
24 核　农　学　报 11 卷
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表 4 　AgNO3对不同培养时期容器中乙烯浓度的影响
Table 4 　Effects of AgNO3 on ethylene concentration in the container
during different culture periods
AgNO3浓度
AgNO3 concentration
(μmol/ L)
不同切割方式
Different cut
method
乙烯浓度
Ethylene concentration (ppm)
2d 5d 10d 15d 20d
整叶 0123b 0142a 0162a 0181a 0169a
Whole leaf
0 划痕 0128a 0145a 0166a 0189a 0172a
Trace cut
切块 0126a 0145a 0165a 0187a 0170a
Piece cut
整叶 0118c 0129b 0143b 0161b 0150b
Whole leaf
1 划痕 0122b 0135b 0145b 0165b 0152b
Trace cut
切块 0121b 0133b 0147b 0166b 0149b
Piece cut
讨 　　　论
尽管不少研究已证实 Ag + 显著促进芽的发生 ,但有关 Ag + 的作用机理研究并不多。Bey2
er 认为 , Ag +干扰乙烯与其受体的结合 ,是一种乙烯作用抑制剂[7 ] 。Yang 则认为 ,Ag + 是一
种乙烯合成抑制剂 ,在 ACC →乙烯中起抑制作用[8 ] 。本研究也证实 , Ag + 对不同培养时期的
叶片乙烯产生有一定的抑制作用。尽管培养早期即细胞脱分化期间 ,乙烯对诱导细胞分裂有
利[9 ] ,但由于此期 AgNO3处理的乙烯抑制率相对较低 ,而由机械切割产生的乙烯使得此期乙
烯释放量最高 ,因而培养早期叶片所释放的乙烯足以启动细胞的分裂。相反 ,尽管培养后期叶
片的乙烯释放量逐渐降低 ,但由于培养容器是一相对密闭的系统 ,外植体所释放的乙烯在培养
容器中积累 ,使得培养中、后期容器中乙烯浓度逐渐升高 ,AgNO3则显著降低了培养容器中乙
烯的浓度 ,部分解除了乙烯对分化的抑制作用 ,促进了不定芽的发生。当然 ,是否 AgNO3在抑
制乙烯产生的同时 ,竞争性地抑制乙烯的作用有待进一步研究。
尽管如此 ,在培养基中加入 AgNO3显著促进苹果叶片不定芽的再生已得到证实。这一高
效苹果叶片直接再生不定芽的实验系统可大大提高诱变育种的效率 ,因为大量不定芽的发生
可以为直接分离出更多单个突变细胞提供机会 ,从而为避免嵌合体的形成 ,加速突变育种进程
展现了更广阔的前景。
34　1 期 AgNO3对苹果叶片培养的影响及其与乙烯产生的关系
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参 考 文 献
1 　Fasolo F ,Malavasi F , Predieri S. Cultivar dependent response to regeneration from leaves in apple. Acta Horticulturae ,1990 ,
280 :61～68
2 　Dufour M. Improving yield of adventitious shoots in apple. Acta Horticulturae ,1990 ,280 :51～58
3 　Purnhauser L , Gyulai G. Effect of copper on shoot and root regeneration in wheat ,triticale ,rape and tobacco tissue culture. Plant
Cell Tissue and Organ Culture ,1993 ,35 :131～139
4 　Purnhauser L ,Medgyesy P ,Czako M et al. Stimulation of shoot regeneration in Triticum aestiv um and Nicotiana plumbagini2
f olia Viv. tissue culture using the ethylene inhibitor AgNO3. Plant Cell Reports ,1987 ,6 :1～4
5 　Songstad DD ,Duncan DR , Widholm J M. Effect of 12aminocyclopropane212carboxylic acid ,silver nitrate ,and nonbornadiene on
plant regeneration from maize callus culture. Plant Cell Reports ,1988 ,7 :262～265
6 　Sethi U ,Basu A , Gaha2Mukherjee S. Control of cell proliferation and differentiation by modulators of ethylene biosynthesis and
action in B rassica hypocotyl explants. Plant Science ,1990 ,69 :225～229
7 　Beyer EM. A potent inhititor of ethylene action in plants. Plant Physiology ,1976 ,58 :268～271
8 　Yang SF. Regulation of ethylene synthesis. Hortscience ,1980 ,15 :238～243
9 　中国科学院上海植物生理研究所细胞室. 植物组织和细胞培养. 上海 :上海科技出版社 ,1978 ,58～72
EFFECT OF AgNO3 ON APPL E L EAF CULTURE AND
ITS RELATION TO ETHYL ENE PROD UCTION
Chen Xiwen 　Fan Hui 　Qiu Liqun 　Wang Qihui
( Instit ute of Crop Genetics and B reeding , S handong A gricult ural U niversity , Taian 271018)
ABSTRACT
When AgNO3 ( 1～100μmol/ L) was added to MS regeneration medium containing 62BA
310ml/ L , IBA 0105mg/ L ,the shoot regeneration from apple leaf signif icantly enhanced. And the
optimum concentration of AgNO3 tested was 1μmol/ L. In contrast to the control ,the suppression
rate to ethylene with 1μmol/ L of AgNO3 was 16 %～20 % in early culture stage( 2～5days) while
the rate was 25 %～40 % in middle and late stages. Therefore , the ethylene concentration in the
container throughout the culture period especially at the middle and late stages( known as differ2
entiation stage) decreased ,thus lessening the ethylenes inhibition on shoot regeneration and pro2
moting shoot formation.
Key words :AgNO3 ,apple ,leaf culture ,ethylene
44 Acta A gricult urae N ucleatae Sinica
1997 ,11 (1) :39～44