全 文 ：核 农 学 报 2011，25(2):0242 ～ 0246
Journal of Nuclear Agricultural Sciences
收稿日期:2010-08-03 接受日期:2010-10-05
基金项目:国家自然科学基金(30871544)，国家公益性行业科研专项(nvhyzx07-014)
作者简介:赵明霞(1985-)，女，山东潍坊人，在读硕士研究生，研究方向为花生细胞工程。E-mail:zmx_0206@ yahoo. com. cn
通讯作者:王晶珊(1960-)，女，山东莱州人，博士，教授，研究方向为花生遗传育种。E-mail:jswang319@ 126. com
文章编号:1000-8551(2011)02-0242-05
平阳霉素对花生体细胞胚胎发生的影响
赵明霞 隋炯明 王晓杰 乔利仙 郭宝太 王晶珊
(青岛农业大学生命科学学院 / 青岛市主要农作物种质创新与应用重点实验室，山东 青岛 266109)
摘 要:本文对花生离体培养高频率体细胞胚(体胚)诱导方法，及平阳霉素(PYM)对体胚发生的抑制作
用进行了研究，旨在为以 PYM 作为化学诱变剂进行花生离体诱变提供有效方法。以花生品种花育 20
号和花育 22 号成熟种子的胚小叶为外植体，在添加不同浓度 2，4-D(0，5，10，15，20mg /L)的 MSB5
(MS 无机盐 + B5 有机成分)培养基上诱导体胚培养。结果表明:当 2，4-D 浓度为 10mg /L 时，体胚诱导
率高，极显著高于其他处理(除花育 20 号添加 10mg /L 与 5mg /L 无极显著差异)，花育 20 号和花育 22
号体胚诱导率分别高达 80. 1%和 92. 9%。将形成体胚的外植体转接到添加 4mg /L BAP 的体胚萌发培
养基上，成苗率达 85%以上。以此培养方法为基础，在诱导培养基中添加不同浓度的 PYM(0，1，2，3，
4，5mg /L)，进行体胚的诱导。结果显示:PYM 对体胚发生有显著的抑制作用，随着平阳霉素浓度的增
大，体胚诱导率显著下降，外植体褐化率急剧上升。2 个供试品种的 PYM 抑制浓度不同，综合褐化率和
体胚形成率，确定花育 20 号和花育 22 号适宜的 PYM 离体诱变浓度分别为 3 ～ 4mg /L 和 4 ～ 5mg /L，诱
变培养时间为 30d。
关键词:花生;平阳霉素;诱变;体细胞胚;2，4-D
EFFECT OF PINGYANGMYCIN ON SOMATIC EMBRYOGENESIS
IN EMBRYONIC LEAFLET CULTURE OF PEANUT
ZHAO Ming-xia SUI Jiong-ming WANG Xiao-jie QIAO Li-xian GUO Bao-tai WANG Jing-shan
(Qingdao Key Lab of Germplasm Innovation and Application of Major Crops，
College of Life Science，Qingdao Agricultural University，Qingdao，Shandong 266109)
Abstract:Efficient somatic embryogenesis and restriction effect of PYM in embryonic leaflet culture of peanut were
studied in this paper，which is to provide an effective method for mutation in vitro using PYM as the chemical mutagen.
The embryonic leaflets of peanut cv. Huayu No. 20 and Huayu No. 22 were cultured on MSB5(MS salts + B5 vitamins)
medium containing 2，4-D (0，5，10，15，20mg /L)to induce somatic embryos. The results showed that 10mg /L 2，4-
D was useful for somatic embryogenesis，the frequency of somatic embryo formation achieved 80. 1% and 92. 9% in
Huayu No. 20 and Huayu No. 22，respectively，which was significantly higher than the other treatment，except for 5mg /
L and 10mg /L 2. 4-D in Huayu No. 20 which showed no significant difference. When the explants with somatic embryos
were transferred to germination medium added with 4mg /L BAP，the embryos germinated and developed to shoots with a
frequency of 85% . With this culture method，the restriction effect of PYM on somatic embryogenesis was studied. The
results showed that PYM prohibited somatic embryogenesis remarkably. With the increasing of PYM concentration，the
frequencies of somatic embryo formation decreased greatly， while the rate of explants browning was increased.
Restriction concentrations of two cultivars were different. According to the explant browning rates and somatic embryo
242
2 期 平阳霉素对花生体细胞胚胎发生的影响
induction rates，it was suggested that 3 ～ 4mg /L and 4 ～ 5mg /L PYM were the optimum mutagen concentrations for
Huayu No. 20 and Huayu No. 22 respectively，and the optimum period of culture duration was 30d.
Key words:peanut;pingyangmycin (PYM);mutagenesis;somatic embryo;2，4-D
花生是世界上最重要的油料作物之一，中国是世
界花生生产大国，年产量居世界第一位。但是，盐渍化
土壤限制了花生种植业的发展，因此选育耐盐花生品
种具有重要意义。化学诱变育种在作物品质改良上具
有独特的作用，突变体具有遗传背景相似，多为单基因
突变的特点，是创造优异种质资源，研究基因功能的理
想材料［1］。化学诱变育种中常用的诱变剂有甲基黄
酸乙酯(EMS)、叠氮化钠等。PYM 是一种抗生素，属
于博莱霉素的一类，是博莱霉素的 A5 组分，目前主要
作为抗肿瘤药应用于临床，对多种癌症具有较好的疗
效。PYM 作为一种新的诱变剂已在许多试验中应用，
它与 EMS 的诱变特点相近，且在某些方面优于 EMS，
被证明具有安全、高效、诱变频率高、范围大等特点，具
有广阔的开发和应用前景［2］。上世纪 90 年代起许耀
奎［3，4］等以平阳霉素为诱变剂，研究了其对大麦、小
麦、大豆和水稻等几种作物的诱变效应。王红等［5］利
用 PYM 为诱变剂与组织培养相结合，在改良观赏植物
的叶色、叶形等方面进行了研究。但目前 PYM 在花生
离体诱变方面的应用尚未见报道。
离体诱变的成功应用依赖于高频率植株再生体系
的建立，尤其通过胚胎发生途径再生植株更优于器官
发生途径，因为体胚的形成一般起源于单个细胞，这样
可避免突变体的嵌合现象。近年来，许多学者开展了
利用花生不同外植体诱导体胚的研究，但多数试验结
果仍存在植株再生率低及基因型依赖等问题［6 ～ 12］。
本试验选用目前广泛栽培的 2 个花生品种为试
材，利用成熟胚小叶为外植体，首先研究诱导培养基中
添加不同浓度 2，4-D 对体胚发生的影响，并确立高效
再生体系。然后以此体系为基础，研究诱导培养基中
添加不同浓度的平阳霉素对体胚发生的抑制影响，旨
在为利用平阳霉素作为化学诱变剂进行花生离体诱变
奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 材料
供试材料为目前广泛推广栽培的花生品种花育
20 号和花育 22 号。选取粒大饱满的种子去子叶，将
种胚用 75%的酒精浸泡 20s，再用 0. 1% 的升汞浸泡
10min 进行表面消毒。用无菌水漂洗 5 次后，置于装
有无菌水的广口瓶中浸泡 12 ～ 16h，备用。
1. 2 方法
1. 2. 1 培养基及培养条件 基本培养基为 MSB5 培
养基，添加 3%蔗糖，0. 8%琼脂，pH 调至 5. 8。培养条
件均为(25 ± 1)℃、3000lx、13h /d 光照。
1. 2. 2 体胚的诱导 在超净工作台中取出经表面消
毒浸泡好的种胚，置于无菌培养皿中分离胚小叶，接种
到添加不同浓度 2，4-D(0，5，10，15，20mg /L)的诱
导培养基中进行培养。每处理重复 3 次，每个处理接
种 60 个外植体。30d 后统计体胚诱导率及外植体褐
化率。
1. 2. 3 平阳霉素诱变浓度的确立 以体胚的适宜诱导
培养基为基础。将胚小叶外植体接种到添加不同浓度
PYM(0，1，2，3，4，5mg /L)的诱导培养基上，每处理重
复 3次，以不添加 PYM 为对照，每个处理接种 60 个外植
体。30d后统计体胚诱导率及褐化率。综合褐化率及相
对体胚形成率，确定适宜的平阳霉素诱变浓度。
1. 2. 4 体胚萌发与植株再生 将形成体胚的外植体
转接到添加 4mg /L BAP 的体胚萌发培养基上，诱导体
胚萌发成苗，每隔 30d 继代 1 次。
2 结果与分析
2. 1 不同浓度 2，4-D 培养基上花生胚小叶体胚诱导
率的比较
胚小叶外植体为乳白色，当在添加 2，4-D 的培养
基上培养 4 ～ 6d 后颜色逐渐变黄，7d 后小叶长大展开
向上卷曲呈黄绿色，12 ～ 17d 后外植体开始形成体胚
(图 1)。在添加 5mg /L 2，4-D 的培养基上体胚形成较
早，随 2，4-D 浓度的提高，开始形成体胚的时间延长。
培养 30d 后，统计体胚形成结果(表 1)。由表 1 可以
看出，在添加 2，4-D 的培养基上均有体胚形成，但浓度
不同，体胚形成率有显著差异。随 2，4-D 浓度的提高，
体胚诱导率先升高后下降。花育 20 号和花育 22 号均
在添加 0 ～ 10mg /L 范围内，2，4-D 的培养基上体胚诱
导率最高，分别为 80. 1%和 92. 9%，除花育 20 号中与
添加 5mg /L 2，4-D 培养基上体胚诱导率无极显著差异
外，均极显著高于其他处理。而在未添加 2，4-D 的诱
导培养基上未观察到体胚的形成，说明 2，4-D 对花生
体胚的形成起重要作用，并且以添加 10mg /L 为宜。
342
核 农 学 报 25 卷
图 1 花育 20 号(A)和花育 22 号(B)胚小叶在添加 10mg /L 2，4-D 培养基上形成的体胚(培养 15d)
Fig. 1 Somatic embryos induced from embryonic leaflets of Huayu No. 20 (A)and
Huayu No. 22 (B)on the medium containing 10mg /L 2，4-D (culture 15d)
表 1 2，4-D 浓度对花生胚小叶胚胎发生的影响
Table 1 Effect of 2，4-D on somatic embryogenesis
from embryonic leaflets of peanut
品种
cultivar
2，4-D 浓度
2，4-D concentration
(mg /L)
体胚形成率
frequency of explants
with somatic embryos(%)
花育 20 号
Huayu No. 20
花育 22 号
Huayu No. 22
0 0D
5 78. 9A
10 80. 1A
15 61. 3B
20 20. 2C
0 0D
5 72. 1B
10 92. 9A
15 72. 9B
20 39. 6C
注:表中同列平均值后标注不同大写英文字母，表明处理间差异极
显著(P < 0. 01)。下表同。
Note:Values with different letters in each column mean significantly
different at P < 0. 01 level. The same as following tables.
由图 2 看出，随着 2，4-D 浓度的增大，外植体褐化
率升高，并且花育 20 号比花育 22 号褐化现象严重。
花育 22 号在 0 ～ 10mg /L 范围内 2，4-D 培养基上无褐
化现象，在 2，4-D 添加量达 20mg /L 时褐化率为
29. 5%。而花育 20 号在添加 2，4-D 20mg /L 培养基上
的褐化率为 42. 2%。
2. 2 平阳霉素对花生胚小叶体胚诱导的抑制
在添加 10mg /L 2，4-D 和不同浓度 PYM 的培养基
上培养 10d 后，外植体开始形成乳白色愈伤组织，并且
生长旺盛。培养 20 ～ 30d，部分愈伤组织逐渐褐化，另
有部分能够形成体胚(图 3)。将培养 30d 后体胚形成
结果及褐化情况分别列于表 2 和图 4。由图 4 可以看
出，供试的 2 个品种褐化情况不同，花育 20 号褐化率
明显高于花育 22 号。随着 PYM 浓度的增大，2 个品
种的褐化率几乎呈直线上升。PYM 浓度由 0 提高到
5mg /L，花育 20 号褐化率由 8. 1%上升到 62. 3%，花育
图 2 外植体褐化率的比较
Fig. 2 Comparison of explant browning rate
22 号由 0 提高到 46. 9%。花育 20 号在 PYM 浓度为
4mg /L 时褐化率为 46. 7%，花育 22 号在 PYM 浓度为
5mg /L 时褐化率为 46. 9%，均约为半致死率。
由表 2 可以看出，随 PYM 浓度的提高，体胚形成
率极显著下降。PYM 浓度由 0 提高到 5mg /L，花育 20
号体胚形成率由 81. 3%下降到 12. 6%，花育 22 号由
81. 6%下降到 28. 9%。PYM 浓度为 3mg /L 时花育 20
号的体胚形成率(41. 1%)和 PYM 浓度为 4mg /L 时花
育 22 号的体胚形成率(40. 7%)分别约为对照的
(81. 3%和 81. 6%)一半。综合褐化率及体胚诱导率，
确定花育 20 号在诱导培养基中添加 PYM 3 ～ 4mg /L，
花育 22 号添加 4 ～ 5mg /L 为合适的诱变浓度，诱变培
养时间为 30d 左右。
2. 3 体胚萌发与植株再生
将花育 22 号形成体胚的外植体转移到添加
4mg /L BAP 的 MSB5 培养基上诱导体胚萌发成苗，结
果列于表 3。由表 3 可以看出，诱导培养基中未添加
PYM 时，萌发成苗率为 85. 1%，并且生长较快(图 5-
A)，畸形苗率和玻璃化苗率分别仅为 8. 5% 和 6. 4%
(表 3);而培养基中添加 4mg /L PYM 时，萌发成苗率
下降至 44. 9%，且苗的生长较缓慢(图 5-B)，畸形苗率
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2 期 平阳霉素对花生体细胞胚胎发生的影响
图 3 花育 22 号胚小叶形成体胚及褐化情况(培养 30d)
Fig. 3 Somatic embryos and browning explants
in Huayu No. 22 (culture 30d)
A:培养基中未添加 PYM;B:培养基中添加 4mg /L PYM
A:medium without PYM;B:medium containing 4mg /L PYM
图 4 PYM 对愈伤组织褐化率的影响
Fig. 4 Effect of PYM on callus browning rate
和玻璃化苗率分别增加到 31. 9% 和 23. 2% (表 3)。
结果说明，体胚诱导培养基中添加 PYM，不但对体胚
形成率有显著抑制作用，并且对之后体胚萌发成苗也
有明显抑制影响，且增加了畸形苗率和玻璃化苗率。
表 2 PYM 对花生胚小叶体胚发生的影响
Table 2 Effect of PYM on somatic embryogenesis
from embryonic leaflets of peanut
品种
cultivar
PYM 浓度
PYM concentration
(mg /L)
体胚形成率
frequency of
explants with
somatic embryos
(%)
花育 20 号
Huayu No. 20
花育 22 号
Huayu No. 22
0 81. 3A
1 53. 3B
2 48. 2C
3 41. 1D
4 27. 8E
5 12. 6F
0 81. 6A
1 69. 1B
2 59. 4C
3 53. 5D
4 40. 7E
5 28. 9F
表 3 平阳霉素对花育 22 号体胚萌发成苗的影响
Table 3 Effect of PYM on somatic embryo germination and shoot formation in Huayu No. 22 (%)
诱导培养基
induction medium
成苗的外植体频率
frequency of
explants with
shoot
形成畸形苗的外植体频率
frequency of explants with
abnormal plantlet
形成玻璃化苗的外植体频率
frequency of explants
with vitrification
plantlet
10mg /L 2，4-D 85. 1 8. 5 6. 4
10mg /L 2，4-D + 4mg /L PYM 44. 9 31. 9 23. 2
注:萌发成苗培养基为 MSB5 + 4mg /L BAP。
Note:Germination medium MSB5 + 4mg /L BAP.
图 5 花育 22 号体胚丛萌发成苗情况
Fig. 5 Somatic embryo germination and
shoot formation in Huayu No. 22
A:诱导培养基中未添加 PYM;B:培养基中添加 4mg /L PYM
A:induction medium without PYM;
B:induction medium with 4mg /L PYM
3 讨论
植物组织培养中，通过器官发生途径再生植株，不
定芽往往起源于多个细胞［13］;而胚胎发生途径，体胚
一般起源于单个细胞［14］。在离体诱变或遗传转化中，
通过胚胎发生途径，能够克服再生植株的嵌合现象。
本试验以花生品种花育 20 号和花育 22 号胚小叶为外
植体诱导胚胎发生。结果表明，诱导培养基中添加不
同浓度的 2，4-D，极显著影响体胚形成率。在添加
10mg /L 2，4-D 的培养基上体胚诱导率最高，这与周蓉
等［9］和张书标等［10］分别以花生子叶和胚轴为外植体
诱导体胚时结果不同，他们的结果表明高浓度的 2，4-
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D (20 和 40mg /L)有利于体胚的形成，这可能与基因
型及外植体不同有关。Chengalrayan K［7］和 George
L［11］报道花生体胚诱导率在基因型之间存在差异，本
试验结果也证实了这一点。
PYM 作为一种诱变剂应用到农作物诱变育种中
已有十几年的历史，通过对大豆［15］、大麦［4］、小麦［14］、
水稻［17］等诱变效应的研究，肯定了其效用和应用价
值［4，10，15，16］。在利用化学因素进行离体诱变中，适宜
的诱变浓度有的以半致死剂量为指标，如薛建平等在
药菊的离体诱变中，以 EMS 半致死剂量作为诱变浓
度［18］;也有人认为相对再分化率接近于 50% 的处理
为适宜诱变剂量，如王瑾等在小麦幼胚愈伤组织诱变
中，以愈伤组织相对分化率接近 50%时的诱变剂浓度
和处理时间作为诱变浓度和时间［19］。本研究中褐化
率接近 50%时，花育 20 号诱导培养基中添加的 PYM
浓度为 4mg /L，花育 22 号为 5mg /L;体胚相对诱导率
约为 50%时，花育 20 号对应 PYM 浓度为 3mg /L，花育
22 号为 4mg /L。综合褐化率及体胚诱导率，确定花育
20 号在诱导培养基中添加 PYM 3 ～ 4mg /L，花育 22 号
添加 4 ～ 5mg /L 为合适的诱变浓度，诱变培养时间为
30d。本研究中 2 个供试品种适宜的诱变浓度不同，这
与王红等［5］以小菊叶片和茎段为外植体研究 PYM 对
愈伤组织的诱导率和分化率的影响结果一致。
4 结论
本研究以花育 20 号和花育 22 号胚小叶为外植体
诱导胚胎发生，建立了其高效的再生体系。即，体胚诱
导培养基为 MSB5 + 10mg /L 2，4-D;体胚萌发培养基为
MSB5 + 4mg /L BAP。花育 20 号和花育 22 号体胚诱导
率分别达 80. 1%和 92. 9%，成苗率达 85%以上。
以上述培养方法为基础，在诱导培养基中添加不
同浓度的 PYM。根据体胚诱导率及外植体褐化率，确
定花育 20 号和花育 22 号 PYM 诱变浓度分别为 3 ～
4mg /L 和 4 ～ 5mg /L，诱变培养时间为 30d。
本试验结果可为利用安全、高效的 PYM 作为诱变
剂进行花生离体诱变提供依据。
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(责任编辑 王媛媛)
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