全 文 ：文章编号 :100028551 (2009) 042602204
RPW2 表达载体构建及对烟草的遗传转化
何道一　段培树　陈丽萍
(淮北煤炭师范学院生命科学学院 ,资源植物生物学安徽省重点实验室 ,安徽 淮北　235000)
摘 　要 :将 RPW2 基因插入表达载体 pBI121 的表达盒中 ,构建了 RPW2 组成型表达载体。通过农杆菌叶
盘转化法转化烟草叶片 ,经卡那霉素筛选、PCR 扩增和 Southern 杂交鉴定证明 , RPW2 基因已成功转入烟
草细胞中 ,获得 6 个转基因株系。RT2PCR 半定量分析表明 ,转基因烟草株系的叶片中有 RPW2 基因的
表达。不同转基因株系的基因表达量不同 ,转基因株系 T2R2 和 T2R4 表达量较高。转基因植株叶片上
人工接种烟草赤星病菌液检测转基因植株的抗病性 ,结果表明 ,与对照植株相比 ,转 RPW2 基因植株对
烟草赤星病抗性显著增强 ,说明 RPW2 基因在烟草中也具有抗病能力。另外 ,转基因株系间 RPW2 基因
表达量虽有差异 ,但抗病性与其他株系相比没有显著差异。
关键词 : RPW2 基因 ;转化 ;烟草 ;抗烟草赤星病
CONSTRUCTION OF RPW2 EXPRESSION VECTOR AND ITS GENETIC TRANSFORMATION IN TOBACCO
HE Dao2yi 　DUAN Pei2shu 　CHEN Li2ping
( College of Life Huaibei Coal Industral Teachers College , Anhui Key Laboratory of Resources and Plant Biology , Huaibei , Anhui 　235000)
Abstract : RPW2 gene was cloned from a Triticum aestivum2Elytrigia elongatum aline substitution line , and the RPW2
expression vector was constructed by inserting RPW2 into the expression box of vector pBI1211Leaf disease of tobacco were
transformed by Agrobacterium tumef acien and the transformed plants were selected by kanamycin. And then , 6 transformed
plants were identified by PCR and southern blot . RT2PCR semi2quantitative analysis results indicated that the RPW2 expressed
in leaves of all transformed plants , however , the expression levels differed with different tansformed plants , high expression in
the transformed T2R2 and T2R4. Resistance to Alternaria alternata in the transformed plants of tobacco with RPW2 was
significantly increased comparing with the check plants. The RPW2 transformed plants which were characterized by different
expression levels of the foreign gene showed no difference in resistance to Alternaria alternata of tobacco.
Key words : RPW2 ; genetic transformation ; tobacco ; resistance to Alternaria alternata of tobacco
收稿日期 :2009201231 　接受日期 :2009204227
基金项目 :安徽省自然科学基金 (070411008)
作者简介 :何道一 (19632) ,男 ,安徽芜湖人 ,博士 ,教授 ,专业方向为植物细胞分子生物学。E2mail :daoyi1h @sohu. com　　植物真菌病害是最常见和最严重的作物病害之一 ,真菌病害引起的作物产量减少所造成的损失是十分惊人的[1 ] ,另外 ,真菌病害导致的作物品质下降也十分严重[2 ] 。尽管化学农药对真菌病害的防治非常有效 ,但是 ,一方面病原生物的不断进化使化学防治效果减弱 ,防治成本增加 ,另一方面 ,化学农药的使用对环境和食品安全都有一定的负面影响。无论从环境和食品安全角度 ,还是从防治成本的角度 ,培育抗性品种是最经济的策略。 植物对病原真菌的抗性有着复杂的机制。随着分子生物学研究的不断深入 ,病原生物与植物之间相互作用的分子机制逐步被揭示。植物的抗病机制主要包括 R 基因介导的小种对小种的特异性抗病机制和非特异性抗病机制两大类[3 ,4 ] 。在植物抵抗病原生物侵染过程中 ,有一系列相关基因表达 ,这些基因的产物包括植物抗病信号分子及其与抗性物质产生相关等[5 ] 。随着对这些基因功能的认识 ,它们都成为植物抗病基因工程的重要基因资源。
206　 核 农 学 报　2009 ,23 (4) :602～605Journal of Nuclear Agricultural Sciences
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目前已有一些抗植物真菌病害基因的应用[628 ] 。
Nakamura[9 ]将β21 ,32葡聚糖酶基因转入猕猴桃中获得
了抗病植株。Carstens[10 ] 等获得转几丁质酶基因的抗
病材料。通过转病程相关蛋白的基因提高其表达也能
获得抗病材料[11 ] 。随着研究的深入 ,更多的抗病基因
被发掘 ,这无疑对作物的抗病育种工作有重要意义。
RPW2 基因是我们从小麦异源代换系中克隆的与
小麦白粉病抗性相关的抗病基因[12 ] ,从基因碱基序列
和其推导的蛋白质序列来看 ,该基因编码产物与磷酸
丝氨酸转氨酶具有较高的相似性 ,但其在植物抗病过
程中的作用还不了解。为了解该基因的抗病特性 ,我
们构建了 RPW2 组成型表达载体并对烟草进行了遗传
转化 ,本文报道了 RPW2 组成型表达载体情况和对烟
草遗传转化的结果。
1 　材料与方法
111 　材料
试验用烟草是本实验室保存的烟草品种 SRI
( Nicotiana tabacuum cv . SRI) ,对烟草赤星病抗性弱。转
化用的农杆菌菌株为本实验室保存的 EHA105 ,侵染培
养基为 1Π2MS + 39mgΠL 的乙酰丁香酮 + 30gΠL 蔗糖。
112 　植物基因组 DNA 的制备
植物基因组 DNA 制备采用 CTAB 法[13 ] ,用 Trizol
提取法制备转基因烟草叶片总 RNA。
113 　表达载体构建及转入
表达载体为 pBI121。对 pBI121 用 Xba Ⅰ和 Sac Ⅰ
在 37 ℃条件下进行双酶切 5 h ,经 017 %琼脂糖凝胶电
泳回收大片段备用。目的基因 RPW2 在克隆载体
pUC18 中 ,用 Kpn Ⅰ酶切克隆载体 pUC18 ,采用高保真
Taq 酶 (TaKaRa) 从克隆载体中扩增 ,所用引物中分别
引入 Xba Ⅰ和 Sac Ⅰ酶切位点。扩增引物为 :
gattccggatccatggccgcagcaactacc 和 gttctaaggagctccgccctgaca2
cctcc。
用电激转化法将构建好的表达载体转入农杆菌菌
株。从培养平板中挑取单个农杆菌菌落 , 在含有
50mgΠL 卡那霉素、30mgΠL 链霉素的 YEB 培养基中培养
过夜 ,6000rΠmin 离心收集菌体 ,用侵染培养基重新悬
浮 ,菌液浓度调整至 OD600约 015。
114 　农杆菌介导的烟草转化
采用叶圆盘转化法 ,取无菌烟草试管苗叶片切成
4～6mm 的叶盘 ,叶盘外植体在农杆菌侵染溶液中感染
10min ,取出后用无菌滤纸吸干表面液体 ,放入含有共
培养液的滤纸上黑暗条件下 ,25 ℃共培养 2d。共培养
基为MS 基本培养基附加 015mgΠL BA、011mgΠL NAA 和
39mgΠL 的乙酰丁香酮。经共培养 2d 的叶盘用含有
500mgΠL 的头孢霉素水溶液洗涤 3 次 ,用无菌滤纸吸
干表面液体转入筛选分化培养基中 ,25 ℃光照培养。
115 　转化体的筛选与鉴定
转化体的筛选在筛选分化培养基中进行 ,培养基
组成为 :MS + 015mgΠL BA + 011mgΠL NAA + 500mgΠL 头
孢霉素 + 50mgΠL 卡那霉素 + 30gΠL 蔗糖 + 8gΠL 琼脂
粉。转化细胞再生的植株具有卡那霉素抗性 ,为正常
绿色植株。提取筛选出的正常绿色植株基因组 DNA ,
采用 PCR 初步鉴定。鉴定用 PCR 引物 (上海生物工程
公 司 ) 为 IF : tgggcatacttgtcgccgatg 和 IR :
agatgtccaccgaaactcg。扩增反应条件为 : 94 ℃预变性
2min ;94 ℃30s ,42 ℃50s ,72 ℃3min ,30 次循环 ;72 ℃延
伸 10min。对 PCR 鉴定为阳性的植株采用 Southern 杂
交进一步鉴定。
用 PCR 法制备杂交探针 ,扩增所用引物和条件同
上 ,探针用 Dig2dUTP (Roche) 标记。Southern 杂交方法
参照文献[14 ]。基因组 DNA 经 Hind Ⅲ酶切过夜 ,琼
脂糖电泳后真空印迹到硝酸纤维素膜上 (amcBiobind
NT2200) ,杂交箱中 65 ℃杂交过夜。采用地高辛标记检
测试剂盒 (深圳依诺金) 进行检测 ,方法按试剂盒说明
书进行。
116 　RPW2 在烟草中的表达
用 RT2PCR 对不同转基因烟草无性系进行 RPW2
表达的半定量分析。用 SuperScriptTM III( Invitrogen)逆转
录酶制备第 1 链 cDNA ,以此第 1 链 cDNA 为模板进行
PCR 扩增 ,扩增的引物和条件同上。以 Ubiquitin21 扩
增产物作内参控制模板的量。
117 　转化体的抗病性分析
对对照植株和转基因株系的叶片人工喷洒烟草赤
星病菌液 ,10d 后调查叶片的发病情况。病害严重度
分级标准按烟草行业标准进行。0 级为全叶无病 ;015
级为病斑占全叶的 1 %以下 ;1 级为病斑占 1 %～5 % ;2
级为病斑占 5 %～10 % ;3 级为病斑占 10 %～20 % ;4
级为病斑占 20 %以上。
2 　结果与分析
211 　表达载体构建
RPW2 基因已插入克隆载体 pUC 18 中 , RPW2 基
因碱基序列中有 1 个 Bam HI 酶切位点 , 没有 Kpn I、
Xba I和 Sac I酶切位点 ,在表达载体 pBI121 (见图 1) 35S
启动子下游的插入位点有 3 个内切酶酶切位点 ,分别
是 Xba I、Bam HI和 Sma I。在 GUS 基因下游终止子
306　4 期 RPW2 表达载体构建及对烟草的遗传转化
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图 1 　表达载体 pBI121 的 T2DNA 左右边界间的结构
Fig. 1 　The structure between LB and RB of T2DNA in pBI121 vector
前有 Sac I 酶切位点 ,因此可以选用 Xba I 和 Sac I 进
行双酶切定向插入 ,去除 GUS 基因 ,插入 RPW2 基因。
用高保真 Taq 酶从克隆载体中扩增目的基因 ,在
引物中分别引入 Xba I和 Sac I酶切位点。用 Kpn I酶
切克隆载体 pMD182T ,再以酶切产物为模板进行 PCR
扩增。扩增产物经 1 %琼脂糖电泳 ,切胶回收。回收
产物用 Xba I和 Sac I进行双酶切 4h ,再经 1 %琼脂糖
凝胶电泳 ,确认酶切产物 ,切胶回收备用。
取 10μl 表达载体 pBI121 双酶切回收产物与扩增
产物的酶解回收物 ,经 T4 DNA 连接酶 10 ℃连接过夜 ,
连接产物转化大肠杆菌 DH5a ,挑取抗性菌落 ,提取质
粒 ,酶切确认载体与目的基因已经连接完成。
212 　转化体的筛选与鉴定
从筛选分化培养基中筛选出 21 个抗性株系 ,对初
步筛选的抗性株系继代增殖 ,经多次继代后 ,有 6 个株
系保持着较好的抗性 ,分别记为 T2R1 到 T2R6。制备转
基因植株基因组 DNA ,对转基因株系进行 PCR 扩增 ,结
果见图 2。从图 2 可以看出 ,6 个抗性株系均能扩增出
RPW2 基因 358bp 左右片段 ,而对照植株未扩增出相应
条带 ,因此初步判断 RPW2 基因已转入烟草植株中。
图 2 　转基因株系 PCR 扩增的结果
Fig. 2 　The PCR results of the transgenic plants
M:marker ; 1 :表达载体 ; 2 :对照 ; 3～8 :T2R1～T2R6
M:marker ; 1 :expression vector ; 2 :CK; 3～8 :T2R1～T2R6
提取转基因烟草植株和非转基因烟草植株的基因
组 DNA ,以 RPW2 基因片段为探针进行 Southern 杂交 ,
结果见图 3。杂交结果显示 ,抗性植株中具有明显的
杂交信号 ,表明转基因烟草植株中具有 RPW2 基因。
图 3 　转基因植株 Southern 杂交结果
Fig. 3 　Southern blot results of the transgenic plants
CK:对照植株 ;1～6 :T2R1～T2R6
CK:control plant ; 1～6 :T2R1～T2R6
213 　转基因植株的基因表达
提取烟草叶片的总 RNA ,逆转录成 cDNA 第 1 链 ,
以此为模板进行 PCR 扩增 ,以 Ubiquitin21 扩增的量作
为模板量的控制。扩增结果见图 4。RT2PCR 结果表
明 , RPW2 基因在转基因植株的叶片中均有不同程度
的表达 ,其中转基因株系 T2R2 和 T2R4 表达量较大。
图 4 　转基因植株叶片的 RT2PCR 结果
Fig. 4 　RT2PCR results of the transgenic plant leaves
A : RPW2 ;B :Ubiquitin21 ;1 :对照植株 ;2～7 :T2R1～T2R6
A : RPW2 ; B :Ubiquitin21 ; 1 :CK; 2～7 :T2R1～T2R6
214 　转基因烟草的抗病性分析
对移栽于田间的转基因成熟植株进行人工喷洒烟
草赤星病菌液 ,每个株系选取 10 个叶片进行病害严重
度统计分析 ,结果见表 1。从表 1 可以看出 ,与对照相
比 ,转基因植株抗病性显著提高 ,说明 RPW2 基因在烟
草中也具有抗病能力。尽管 RT2PCR 结果显示株系 T2
406 核　农　学　报 23 卷
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R2 和 T2R4 表达量较大 ,但抗病性与其他转基因株系
相比并没有显著提高。
表 1 　转基因株系染烟草赤星病的叶数调查
Table 1 　The number of infested leaf by desease
in transgenic plants
转基因株系
transgenic plant
等级 disease grades
0 1 2 3 4
CK 0 0 0 7 3
T2R1 0 4 5 1 0
T2R2 0 4 6 0 0
T2R3 0 5 4 1 0
T2R4 0 4 5 1 0
T2R5 0 5 5 0 0
T2R6 0 4 4 2 0
3 　讨论
目前用于植物抗真菌病害的基因有两个基本类
型 :一类是基因表达产物直接作用于病原生物 ;另一类
主要是抗病信号传导途径中成员。前者如几丁质酶基
因、β21 ,32葡聚糖酶基因等 ,这类基因通常具有较广抗
菌谱。但由于它们的抗病机制是直接破坏或杀死病原
菌 ,在转基因植物中 ,它们的表达水平决定了抗性的强
弱 ,只有高水平表达才会有较高的抗性。然而 ,转基因
植株在多世代遗传以后 ,仍然保持转基因稳定高水平
的表达是很难实现的。另外 ,随着时间的推移 ,病原生
物对这些基因的产物也在慢慢适应。因此 ,转这类基
因的植物常表现出抗病性效果不明显或随时间延长抗
性降低的现象[7 ] 。植物抗病途径中的成员众多 ,是植
物本身抗性进化产物 ,用于植物抗病具有独特的优势。
由于植物抗病途径的高度相似性和交叉应答的关系 ,
越是抗性途径上游的成员其抗病谱越广。同时 ,由于
信号传导中的级联放大 ,上游成员的信号能被有效放
大 ,也就是说上游成员适当表达就能产生很好的抗病
效果。RPW2 是来自长穗偃麦草抗小麦白粉病的相关
基因 ,根据其序列推测其为磷酸丝氨酸转氨酶的类似
物 ,显然它的表达产物不是直接作用于病原生物 ,但应
与丝氨酸代谢有关。尽管目前还不知道 RPW2 在抗病
途径中的准确作用 ,但在转基因烟草中它的表达明显
提高烟草对烟草赤星病的抗性 ,这说明 RPW2 基因具
有较广的抗病谱 ,其抗病机制值得深入研究。
所转基因类型不同 ,转基因的表达水平与植物抗
病性的关系也呈现出复杂的关系[11 ,14 ] 。本试验表明 ,
转基因株系 T2R2 和 T2R4 的叶片中 RPW2 的表达水平
要显著高于其他转基因株系 ,但从抗病性情况看 ,这 2
个株系与其他株系没有显著差异。特别是 T2R1 株系
表达量很小 ,但与对照相比抗病性却显著提高 ,这表明
RPW2 的表达水平与抗病性没有相应的关系 ,这也间
接说明 RPW2 在抗病途径的中上游起作用。
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