全 文 ：核 农 学 报 2010，24(3):466 ～ 469
Journal of Nuclear Agricultural Sciences
文章编号:1000-8551(2010)03-0466-04
60 Co γ射线辐照对沟叶结缕草的离体诱变效应
贾玉芳 陈 曙 柴明良
(浙江大学园林研究所，浙江 杭州 310029)
摘 要:分别以 0(对照)、5、10、20 和 40Gy 的60 Co γ 射线辐照沟叶结缕草匍匐茎诱导的胚性愈伤组织，比
较愈伤组织的生长和再生情况，测定再生植株的染色体倍性以及脯氨酸含量、超氧化物歧化酶(SOD)、
过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性。结果表明:5Gy 辐照对愈伤组织的生长、再生没有影响;
10 和 20Gy 处理对愈伤组织的再生速度有显著的促进作用，再生分化形成 3 个以上小苗的外植体比率
分别比对照提高 12. 50% 和 8. 68%;而 40Gy 辐照使愈伤组织的胚性保持能力和再生率分别下降
21. 67%和 8. 78%。不同处理对再生植株的 SOD、POD、CAT 活性及染色体倍性没有影响;与对照相比，
经 γ 射线辐照的愈伤组织获得的再生植株中脯氨酸含量显著提高，最高可达对照的 2. 4 倍(20Gy)。
关键词:沟叶结缕草;
60 Co γ 射线;染色体倍性;脯氨酸;SOD;POD;CAT
EFFECTS OF 60Co γ-IRRADIATION ON MANILAGRASS in vitro MUTAGENESIS
JIA Yu-fang CHEN Shu CHAI Ming-liang
(Institute of Landscape Architecture，Zhejiang University，Hangzhou Zhejiang 310029)
Abstract:The embryogenic calluses induced from the stolons of manilagrass (Zoysia matrelia L. Merr.)were treated
with60 Co γ-rays at doses of 0 (control)，5，10，20 and 40Gy. Growth and regeneration of the calluses，ploidy，content
of proline，activities of superoxide dismutase(SOD)，peroxidase(POD)and catalase (CAT)enzymes of the regenerated
plants were measured. The results showed that 5Gy irradiation had no effect on growth and regeneration of the callus. 10
and 20Gy irradiation had significant promoting effects on regeneration of the calluses，and the rates of explants that
differentiated and formed more than 3 plantlets per explant increased by 12. 50% and 8. 68%，respectively. However，
40Gy irradiation resulted in the decreases of rates of embryogenic calluses and regeneration by 21. 67% and 8. 78%，
respectively. There were no differences among the ploidy and the activities of SOD，POD，CAT enzymes of the
regenerated plants from different treatments. Proline contents in the regenerated plants acquired from the calluses that
were treated with60 Co γ-irradiation at doses of 5，10，20 and 40Gy were significantly higher than that in control，and the
highest content (20Gy)was 2. 4 times of that in control.
Key words:manilagrass;60 Co γ-irradiation;ploidy;proline;SOD;POD;CAT
收稿日期:2009-10-15 接受日期:2009-12-04
基金项目:国家自然科学基金项目(30771522)
作者简介:贾玉芳(1983-)，女，山东青岛人，硕士研究生，从事园林植物与观赏园艺研究。Tel:0571-86971036;E-mail:bamboo27@ zju. edu. cn
通讯作者:柴明良(1964-)，男，浙江安吉人，副教授，研究方向为园艺植物生物技术。Tel:0571-86971036;E-mail:mlchai@ zju. edu. cn
沟叶结缕草(Zoysia matrella L. Merr.)是禾本科
(Gramineae)结缕草属(Zoysia Willd.)的多年生草本
植物，以叶片细密、色泽翠绿、草层密集、持绿期长、抗
逆性较强而著称，被广泛应用于高尔夫球场、田径场和
公园，成为我国南方地区的主要草坪草种［1］。沟叶结
缕草在自然界是通过匍匐茎进行无性繁殖的，难以用
杂交等传统方法育种。虽然沟叶结缕草对干旱、高温、
盐害有很强的抗性，但还存在着易感锈病、抗寒性差等
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3 期 60 Co γ 射线辐照对沟叶结缕草的离体诱变效应
缺点［2］，因此通过现代生物技术进行其遗传物质的改
良具有重要意义。
辐射育种具有较高的变异频率和变异范围，能够
在短时间内获得稳定遗传的突变体，已在小麦［3］、水
稻［4］等作物的品质改良和新品系选育方面取得了不
少成果，在狗牙根［5］、高羊茅［6］等草坪草育种上也有
所应用。辐射育种与生物技术相结合，已成为一种重
要的育种手段。目前，关于沟叶结缕草辐射诱变的研
究还未见报道。本实验室经过多年的离体试验，熟练
掌握了以沟叶结缕草匍匐茎段为外植体诱导愈伤组织
并高效再生的技术。在此基础上，研究了不同剂量
的60 Co γ 射线辐照对沟叶结缕草愈伤组织生长速度、
胚性保持、再生能力、再生植株染色体倍性和脯氨酸、
过氧化酶等生理指标的影响，以为沟叶结缕草辐射诱
变育种奠定基础。
1 材料和方法
1. 1 材料
沟叶结缕草匍匐茎诱导的胚性愈伤组织。
1. 2 方法
1. 2. 1 辐照对愈伤组织生长的影响 以 MS +
2. 0mg /L 2，4-D + 1. 15g /L 脯氨酸 + 40g /L 蔗糖 +
5. 3g /L 琼脂粉的培养基上继代培养的愈伤组织为外
植体，取生长旺盛、均匀一致、直径约 3mm 的小块，接
种到新鲜的同种培养基上，每皿接种 16 小块。材料在
浙江大学核农所辐照中心进行60 Co γ 射线急性照射，
剂量为 0(对照)、5、10、20 和 40Gy，每处理设 5 个重
复。之后将愈伤组织放在 25℃ ± 2℃条件下暗培养，4
周后观察愈伤组织的生长和胚性保持状况。通过测量
每块愈伤组织的直径，发现大部分愈伤组织直径在
5mm 以上，因此以 5mm 为标准，直径超过 5mm 的愈伤
组织比率越高，则表明愈伤组织生长速度越快。同时
统计胚性愈伤组织的比率(颜色淡黄、质地紧密的胚
性愈伤组织块数 /总愈伤组织块数)。
1. 2. 2 辐照对愈伤组织再生的影响 将上述辐照处
理的愈伤组织继代培养 8 周，测定其再生能力。取直
径约 3mm、生长良好的胚性愈伤组织，接种到 1 /2 MS
(大 量 元 素 减 半) + 0. 1mg /L BA + 30g /L 蔗 糖
+ 5. 3g /L琼脂粉的再生培养基上。每皿接种 16 小块，
每处理设 5 皿重复，在光强约 12. 5μmol /m2· s、光照
12h /d、25℃ ± 2℃条件下培养。愈伤组织再生过程中
颜色由黄转绿，膨大生长，再生较快的愈伤组织率先分
化形成绿色小苗。4 周后观察记录直径超过 5mm 的
外植体比率和分化形成 3 个以上小苗的外植体比率，
同时统计愈伤组织再生率(再生的愈伤组织块数 /总
愈伤组织块数)。用上述 3 个指标综合衡量愈伤组织
的再生能力。
1. 3 分析测定
1. 3. 1 再生植株染色体倍性检测 将再生植株移栽
到温室，8 周后长成生长旺盛的成熟植株。采用 Otto
提取液［7］，利用流式细胞仪测定再生植株的 DNA 相对
含量。具体为每个处理取再生植株幼嫩的茎叶约
50mg，放在塑料培养皿上，加入 400μl OttoⅠ缓冲液，
用刀片将其切碎，使细胞核释放出来。用直径 30μm
的尼龙网过滤，然后 4400rpm 离心 5min，去上清，加
20μl OttoⅠ和 80μl OttoⅡ，轻轻摇动，使沉淀和缓冲液
混匀。再加 100μl PI(propidium iodide + RNase)，摇匀
后用 BD FACSCalibur 流式细胞仪测定。从随机软件
cellQuest Pro 获取数据，并通过 WinMDI 2. 9 软件显示
直方图，每个处理设 3 次重复。
1. 3. 2 再生植株抗逆性指标测定 取不同处理再生
植株幼嫩叶片 0. 2g，加 3ml 50mmol /L 的磷酸缓冲液
(pH 7. 8，含 0. 2mmol /L EDTA，1% PVP)，于冰浴中研
磨提取，匀浆液于 12 000rpm、4℃离心 20min。取上清
液用于 SOD、POD 和 CAT 活性的测定。SOD 活性测定
采用 NBT(氮蓝四唑)光还原法［8］;POD 活性测定采用
愈创木酚法［9］;CAT 活性测定参照 Lu 等［10］的方法;脯
氨酸含量测定采用酸性茚三酮比色法［8］。每处理 3 个
重复。采 用 UV － 2550 型 分 光 光 度 计 (日 本
SHIMADZU 公司生产)测定吸光度，计算各项指标含
量。
1. 4 数据分析
试验数据分析采用 SAS 分析软件，Tukey 多重比
较法，5%水平差异。
2 结果和分析
2. 1 不同剂量辐照对愈伤组织生长的影响
随着辐照剂量的增加，愈伤组织的胚性保持能力
呈下降趋势(表 1)，当剂量为 40Gy 时，胚性愈伤组织
比率为 68. 33%，比对照低 21. 67%，达到显著水平。
不同剂量辐照对于胚性愈伤组织的生长速度没有显著
影响，直径≥5mm 的愈伤组织在 52. 50% ～ 63. 75%
间。
2. 2 不同剂量辐照对愈伤组织再生的影响
如表 2 所示，不同剂量辐照对愈伤组织再生速度
有显著影响。随着剂量的增加，直径≥5mm 和分化形
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核 农 学 报 24 卷
成 3 个以上小苗的外植体比率均呈先上升后下降的趋
势。剂量为 20Gy 时，直径≥ 5mm 的外植体比率为
76. 39%，比对照提高 33. 33%，并显著高于其他各剂
量。分化形成 3 个以上小苗的外植体比率在剂量为
10 和 20Gy 时较高，分别比对照提高 12. 50% 和
8. 68%，但两者没有显著差异。不同剂量辐照对愈伤
组织的再生率也有显著影响。40Gy 处理的愈伤组织
再生率比对照低 8. 78%，达到显著水平，其他剂量同
对照间没有显著差异。
表 1 不同剂量辐照处理的 2 种愈伤组织比率
Table 1 Rate of calluses in different
irradiation treatments
剂量
dose (Gy)
胚性愈伤
embryogenic calluses
直径≥5mm 愈伤组织
calluses of
diameter≥5mm
0 90. 00 ± 6. 97a 63. 75 ± 9. 27a
5 81. 67 ± 9. 13ab 63. 75 ± 8. 15a
10 80. 00 ± 7. 45ab 62. 50 ± 6. 25a
20 75. 00 ± 8. 33ab 56. 25 ± 6. 25a
40 68. 33 ± 9. 13b 52. 50 ± 7. 13a
注:相同字母表示没有显著差异(P < 0. 05)。下表均同。
Note:Means with the same letter are not significantly different(P <
0. 05). The same as following tables.
2. 3 再生植株染色体倍性检测
图 1 中最高峰代表了植物体大部分细胞中 DNA
的相对含量，即染色体倍性。不同剂量处理的愈伤组
织获得的再生植株 DNA 相对含量分布在 42. 73% ～
45. 91%之间。经统计分析，它们之间没有显著差异，
说明不同剂量辐照对再生植株的染色体倍性是没有显
著影响的。
表 2 不同剂量辐照处理愈伤组织再生外植体比率
Table 2 Regeneration rate of calluses
from different irradiation treatments
剂量
dose
(Gy)
直径≥5mm
diameter≥5mm
≥3 个小苗
≥3 plantlets
总再生率
total regeneration
rate
0 57. 29 ± 4. 70bc 9. 38 ± 3. 42c 98. 96 ± 2. 55a
5 67. 19 ± 4. 12b 14. 06 ± 4. 42bc 98. 44 ± 2. 89a
10 65. 63 ± 5. 79b 21. 88 ± 6. 68a 96. 88 ± 3. 34a
20 76. 39 ± 9. 26a 18. 06 ± 4. 89ab 97. 22 ± 4. 54a
40 51. 79 ± 5. 94c 14. 29 ± 4. 72bc 90. 18 ± 6. 10b
2. 4 再生植株的脯氨酸含量和 SOD、POD、CAT 活性
不同剂量的辐照处理均使再生植株叶片中的脯氨
酸含量显著提高(表 3)，最高达到对照(0Gy)的 2. 4 倍
(20Gy)，但不同剂量之间没有显著差异。不同辐照处
理对再生植株的 SOD、POD 和 CAT 活性没有显著影响。
SOD 活性分布在 2. 99 ～ 3. 09U / gFW·min － 1之间;POD
活性分布在 12. 64 ～ 14. 99U / gFW·min － 1之间;CAT 活性
分布在 0. 85 ～ 0. 99U / gFW·min － 1之间。
表 3 不同剂量辐照处理再生植株生理指标
Table 3 Physiological indexes of the regenerated plants in different irradiation treatments
剂量
dose (Gy)
脯氨酸含量
content of proline(%)
SOD 活性
activity of SOD
(U /gFW·min)
POD 活性
activity of POD
(U /gFW·min)
CAT 活性
activity of CAT
(U /gFW·min)
0 0. 05 ± 0. 01a 3. 09 ± 0. 06a 14. 54 ± 1. 88a 0. 85 ± 0. 12a
5 0. 10 ± 0. 02b 2. 99 ± 0. 04a 14. 99 ± 3. 18a 0. 93 ± 0. 01a
10 0. 11 ± 0. 01b 3. 05 ± 0. 10a 12. 77 ± 0. 79a 0. 99 ± 0. 04a
20 0. 12 ± 0. 01b 3. 07 ± 0. 14a 14. 14 ± 1. 39a 0. 98 ± 0. 07a
40 0. 10 ± 0. 01b 3. 09 ± 0. 06a 12. 64 ± 2. 58a 0. 98 ± 0. 07a
3 讨论
植物在组织培养过程中，会产生体细胞无性系变
异，如果施加一定的诱变剂，则可以增加再生植株的变
异频率，获得更多的变异材料。辐射诱变与离体培养
相结合定向筛选具有优良性状突变体的方法在水
稻［11］、甜菜［12］等作物育种上已取得成功。愈伤组织
体细胞胚胎发生通常被认为是单细胞起源的，因此用
愈伤组织作为辐照对象，能够减少嵌合体的产生，获得
稳定遗传的变异，在草坪草抗逆性突变体筛选方面是
一种理想的育种手段。本试验首次以沟叶结缕草胚性
愈伤组织为试材，研究了60 Co γ 射线不同剂量辐照对
愈伤组织生长、再生和变异的影响，为沟叶结缕草的组
织培养结合诱变育种提供了基础数据。
本试验发现，低剂量辐照(5Gy)对愈伤组织的生
长、再生没有显著影响，但由于突变频率较低，可能获
得的遗传变异少，对育种的意义不大。中等剂量辐照
(10 和 20Gy)能大大提高愈伤组织的再生速度，在高
羊茅种子萌发试验中也发现了类似的促进作用［13］。
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图 1 不同辐照处理再生植株 DNA 相对含量
Fig. 1 Relative content of DNA in regenerated plants im different irradiation treatments
较高的剂量辐照(40Gy)使愈伤组织的胚性保持能力
和再生率均有所下降，但可能会提高突变频率。而随
着辐照剂量的增加，愈伤组织受到的损伤加重，这种损
伤很可能会表现为再生植株对外界环境的抗性减弱。
因此在提高辐照剂量以获得更多变异的同时，也要考
虑辐照剂量对再生植株抗性生理指标的影响。
与对照相比，辐照处理使再生植株叶片内的脯氨
酸含量显著提高，但是对再生植株的 SOD、POD 和
CAT 活性没有影响。脯氨酸是一种广泛存在的渗透
调节剂［14］，能提高植物细胞溶质浓度，降低水势，以利
于植物从外界获得水分，从而适应不良生境。在高
温［15］、干旱［16］及盐［10］胁迫下，草坪草体内会积累脯氨
酸，以维持渗透压。SOD、POD 和 CAT 等重要的保护
酶能清除植物体内的活性氧，维持细胞的稳定和完整，
提高植物对逆境的适应性［17］。因此，保护酶活性的高
低及脯氨酸含量在一定程度上反映植物耐逆境的能
力［17，18］。
经不同剂量辐照的沟叶结缕草胚性愈伤组织，虽
然在生长速度、胚性保持、再生能力以及再生植株脯氨
酸含量方面存在差异，但移栽后成熟的植株上观察不
到明显的形态差异(数据未列出)，而且再生植株的染
色体倍性也没有发生变化(图 1)这表明试验所使用的
辐照剂量至多引起短期的生理变化或个别与形态特征
无关的基因的突变。但是，10 和 20Gy 处理不仅对愈
伤组织的再生有促进作用，而且能显著提高再生植株
的脯氨酸含量，因此可在此基础上进一步定向筛选抗
盐、抗旱等有利突变体。而 40Gy 的剂量虽然对愈伤
组织的胚性保持和再生能力有一定的抑制作用，但仍
能使再生植株的脯氨酸含量有所提高，因此可考虑在
今后的试验中适当提高辐照剂量，使染色体在结构、数
量上产生明显的变异，扩大变异谱。
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