全 文 ：第 17 卷 第 4 期
Vol. 17 No . 4
草 地 学 报
ACTA AGRESTIA SINICA
2009 年 7 月
Jul. 2009
沟叶结缕草高温胁迫的基因差异表达及其作用机制
黄锦文, 吴文祥 , 陈冬梅, 郑红艳, 林文雄*
(福建农林大学农业生态研究所, 福州 350002)
摘要:为了从基因表达水平研究沟叶结缕草( Zoy sia matr el la)高温耐热性的分子机制, 利用 SSH 方法构建了沟叶
结缕草对高温( 40 )处理响应的正向差减文库。通过 rev er se nor thern 杂交方法筛选文库,挑选出高温胁迫处理下
35 个差异表达基因,对这些基因进行测序, 并将测序所得结果与基因组数据库( NCBI)进行比对, 从而获得了 26 个
基因功能已知的差异表达基因。这些已知基因分别参与信号转导、植物代谢、植物抗逆性反应、基因表达调控和蛋
白质合成等过程。
关键词:沟叶结缕草; 高温胁迫;抑制消减杂交; 基因表达
中图分类号: S688. 4 文献标识码: A 文章编号: 10070435( 2009) 04043505
Analysis of Different Expression of Genes in Zoysia Matrella
Exposed to High Temperature Treatment
HUANG Jinwen, WU Wenx iang, CHEN Dongmei , ZHENG Hongyan, LIN Wenx iong
( Inst itute of Agroecology, Fu jian Agricu lture and Forest ry University, Fuzhou 350002, China)
Abstract: Some studies on the genes of diseaseresistance, insectresistance and saltto ler ant in turfg rass
have been carried out , how ever few information is available in the heattolerant g enes. In order to study
molecular mechanisms of heat resistance of Zoy sia matr el la, an invest igat ion, detecting the related gene
expression prof iles expo sed to high temperatur e st ress, w as conducted using suppr ession subtr act iv e hy
bridizat ion( SSH ) . After the reverse northern hybridizat ion screening, a total of 35 EST s f rom SSHcDNA
library w ere sequenced and al l of the sequences o f inser ted f ragments w ere analyzed w ith the aid of bioin
formatics. It obtained 26 different funct ionally known genes. T hese genes w ere sorted into four g roups
such as signal tr ansduct ion, metabolism, str ess resistance, g ene expression regulat ion and protein synthesis.
Key words: Zoy sia matrella; H igh temperature str ess; Suppression subtractive hybridizat ion ( SSH ) ; Gene
expression
沟叶结缕草( Zoy sia matrel la) 为禾本科结缕
草属多年生草本植物,原产于日本南部、台湾及东南
亚等地,目前,在我国长江以南诸多省份已得到广泛
利用,并成为暖季型草坪草中最重要的草种之一。
当前,草坪草抗病、抗虫、耐盐基因等研究取得了一
定的进展,而耐热基因的研究却寥寥无几,我国草坪
草耐热性转基因研究还没有成功的报道[ 1~ 3]。抑制
消减杂交法( suppr ession subtract ive hybridization,
SSH )是一种特异的分离与表达差异相关 EST 序列
的有效方法,具有灵敏性高、操作简单、假阳性率低、
速度快、效率高等特点。本研究旨在利用抑制消减
杂交方法构建沟叶结缕草耐热响应的 SSHcDNA
文库,通过测序获得相关基因表达的 EST 序列, 并
对获得的 EST 序列应用生物信息学方法进行序列
比对分析,以期了解沟叶结缕草耐热基因表达特点,
进而为草坪草耐热基因的定位, 分离克隆以及转基
因提高耐热性研究提供依据。
收稿日期: 20081222;修回日期: 20090424
基金项目:福建省生态学重点学科资助( 0608537)
作者简介:黄锦文( 1967 ) ,女,福建闽清人,副教授,博士,主要从事作物生理生态及分子生态学研究, Email : huangjw 1126@ sohu. com; *
通讯作者 Author for corresponden ce: Email: w enxion g181@ 163. com
草 地 学 报 第 17卷
1 材料与方法
1. 1 试验材料与处理
本试验以沟叶结缕草为材料, 取之于福建农林
大学运动场。2005年 10 月 10日在福建农林大学
试验基地铺植沟叶结缕草匍匐茎。2007年 4月 10
日草坪成坪后选取同一匍匐茎上的分蘖株挖起, 分
成 3株移栽到土壤基质完全相同的花盆中, 并在 25
~ 30 的室温下恢复生长 5个月后进行处理、取样。
试验设计 40 高温对沟叶结缕草植株进行高温诱
导,盆栽结缕草置于温度设定为 40 和 16 h/ 8 h
(光/暗)的光照培养箱中分别处理 12 h、24 h 后取
样,以 30 正常室温下生长的盆栽植株为对照, 取
样后用做 SSH 分析。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 总 RNA 提取 将高温处理后的新鲜叶片
研磨成粉后采用 T RIzol ( Inv itro gen) 法进行总
RNA 的提取。随后用 DN ase 降解基因组 DNA,
以去除 DNA 的干扰, 并用紫外可见分光光度计检
测所得 RNA 样品的浓度和纯度, 再用 1. 2%的琼脂
糖凝胶电泳检测各样品的完整性。等量混合 40
高温处理下生长 12 h、24 h的样品叶片总 RNA, 作
为 Tester; 取正常条件下生长的对照叶片总 RNA,
作为 Driver。
1. 2. 2 抑制消减杂交 各取 T ester 总 RNA、Driv
er 总 RNA 约 1 g,加入 Pr imer 1和 Pr imer 2合成
cDNA 第一链, 接着完成双链 cDNA 的合成, 之后
进行 PCR扩增、纯化。
1. 2. 3 抑制消减文库的构建 将 PCR产物纯化后
的目的片段连接到 Pmd18T Vector 上, 连接好的
产物转化到大肠杆菌 DH5感受态细胞中, 于 37
培养箱过夜,挑取明显的白色菌落进行扩增培养。
1. 2. 4 消减文库插入片段的酶切检测 随机挑取
部分克隆接种到含有氨苄青霉素 LB 液体培养基
中, 37 振荡培养过夜。采用 SDS碱裂解法提取质
粒,用 1%的琼脂糖凝胶电泳检测产物酶切结果。
1. 2. 5 筛选阳性克隆 为进一步筛选阳性克隆, 挑
取经菌液 PCR鉴定的片段大小在 300 bp 以上的克
隆,用 Rever se No rthern狭缝杂交的方法筛选阳性
克隆。经菌液 PCR,分别以 Driver cDNA 和 T ester
cDNA 为探针进行杂交。
1. 2. 6 克隆子的测序 选取与正向探针杂交有信
号,而与反向探针杂交无信号;或者正向信号强于反
向信号的克隆子测序。序列由上海生工生物工程技
术服务有限公司测定。
1. 3 比对方法
基因差异表达EST 生物信息学分析进入 NCBI
( ht tp: / / www. ncbi. nlm . nih. go v/ BLAST / ) , 选择
blastn或 blastx, 提交去除载体序列和两端接头序
列的 EST 序列并选择适当的参数, 进行在线 DNA
序列同源性比较。
2 结果与分析
2. 1 RNA的含量和质量
利用 Trizo l试剂分别提取高温胁迫 12 h、24 h
叶片的总 RNA, 样品经紫外分光光度计检测,结果
表明:各样品的 OD2 60 / OD280均在1. 9~ 2. 0范围内,
纯度较高。总 RNA 用电泳检测, 结果表明: 28S
rRNA和 18S rRNA 条带清晰可见, 且 28S rRNA
的含量大于 18S rRNA, 说明 RNA 完整性较好, 可
满足试验要求。用 DNase 降解 tester 和 driver 中
的基因组 DNA, 电泳结果显示 tester 和 driver 的
RNA均保持完整性(图 1)。
图 1 总 RNA 电泳检测结果
F ig. 1 T otal RNA examined on agar ose gel
注:泳道 1.高温处理下沟叶结缕草叶片总 RNA;泳道 2.对照叶
片总 RN A
Note: Lane 1. Total RNA of Zoy siag rass leaves un der the high
tem perature t reatment ; L ane 2. Cont rol RNA
2. 2 双链 cDNA的合成
利用 SMART cDNA PCR 方法合成双链 cD
NA,首先对 PCR 循环参数进行优化,选择 21个循
环的 PCR产物进行消减杂交。
2. 3 双链 cDNA的 Rsa酶切分析
本试验中合成的 dscDNA 电泳结果为 0. 5~ 10
kb范围的慧尾状条带, Rsa 酶切后的 dscDNA 分
436
第 4期 黄锦文等:沟叶结缕草高温胁迫的基因差异表达及其作用机制
布在 0. 2~ 2 kb 之间, 说明本次试验 dscDNA 合成
的 Rsa酶切成功。
2. 4 消减产物二次 PCR的结果
经过 2次杂交和 2次 PCR,一些差异表达的基
因得到了富集; 经过 2次 PCR 的扩增,差减库中的
片段大约在 100~ 800 bp之间且主要集中在 400 bp
左右,同时也可以看出消减之后的片段较没有消减
的片段要淡且范围变小, 说明消减产物二次选择性
PCR扩增运行正常,也反映了接头连接效率高。
2. 5 差异表达基因的 T载体克隆
经过两次选择性 PCR富集的消减产物纯化后
与 T 载体连接后转化, 经蓝白斑筛选, 共获得 1078
个上调表达的克隆, 采用菌液 PCR方法对每一个克
隆进行鉴定,确认是否有片段插入,并观察插入片段
的大小。同时对部分克隆的质粒 DNA 进行 EcoR
/ BamH 双酶切, 结果与菌液 PCR 基本一致。
结果表明: 文库的插入片段大小介于 100~ 800 bp
之间为有效重组。
2. 6 差异表达基因的进一步筛选
对差减文库所得的片段做进一步筛选, 以降低
SSH 技术的假阳性的几率。本研究通过狭缝杂交,
对所构建的差减文库的部分克隆分别与 tester cD
NA 和 driver cDNA 分别进行了正向筛选和反向筛
选,挑选正向杂交的信号强于反向杂交的信号的克
隆,即为差异表达的克隆。
2. 7 分离得到部分差异基因的测序与序列分析
挑取的克隆测序原始序列中, 3条 EST 序列未
找到相似性较高序列, 其余 32 条 EST 序列去除由
SSH 引入的接头引物序列后与基因组数据库( NC
BI)进行比对,同源序列的查询结果见表 1。blast 的
分析结果表明, 32条 EST 序列中, 功能已知的基因
31个, 1个基因功能未知。功能已知的差异表达基
因表达图谱包括的同源基因涉及 15种生物, 基因功
能归纳成 4大类群:即信号转导、代谢反应、基因表
达转录调控和蛋白质合成及抗逆性反应。
3 讨论与结论
3. 1 应答高温胁迫的信号转导
在获得的已知功能的 EST 中参与信号转导的
主要有 GT P 酶激活蛋白( GTPase act ivat ing pro
tein 12)和成熟酶相关蛋白 ( maturaserelated pro
tein)基因。近年发现的 G蛋白调节因子是细胞内
GTP 酶激活蛋白,它可加速 Gi和 Gq水解 GTP,
从而限制 Gq和 Gi蛋白激活的强度和持续时间,调
节信号转导过程[ 4] 。细胞内的成熟酶与生物体内信
号转导也有着一定的关系。在酵母体内, 成熟酶是
细胞色素 b合成不可缺少的组分, 而细胞色素 b轻
链由两条分子量不同的多肽链组成, 其中一条上的
P2Y1受体是一种配体开启的离子通道, 介导细胞
外核苷酸传导的细胞间信号。可见, 高温胁迫下沟
叶结缕草加强了细胞内外信号的转导作用,至于信
号受体之间如何偶联有待于进一步研究。
3. 2 高温胁迫下的代谢响应
在所获得的 32条 EST 序列中与光合作用有关
的有 3条,包括 2条参与光合磷酸化及电子传递过
程的 ATP 酶( AAA AT Pase)基因和 1条与光合作
用 CO 2 的同化及同化物的运输有着密切关系的依
赖 NADP苹果酸酶 ( NADPdependent malic pro
tein)基因。AT P 合酶 F0 亚基 ( AT P synthase F0
subunit 1)与 NADH 脱氢酶 NADH ( dehydrogen
ase subunit 2)则是植物呼吸作用电子传递过程不
可缺少的组分。细胞色素 C( cytochrome c)是生物
氧化的一个非常重要的电子传递体, 在线粒体崤上
与其它氧化酶排列成呼吸链, 参与细胞呼吸过程。
甘氨酸裂解体系蛋白( gly cine cleavage sy stem pro
tein)是植物体内氮代谢不可缺少的酶类。肽酶
( pept idase)是植物体内多种代谢的催化剂。可见,
沟叶结缕草在高温下, 加强了光合作用、呼吸作用和
氮代谢等多种新陈代谢过程。
3. 3 高温胁迫下基因表达转录调节和蛋白质合成
在所获得的 EST 中与基因表达转录调控有关
的有 8 条。其中, 执行转座功能的酶, 即转座酶
( t ransposase) , 能把转座子从相邻序列中脱离出来,
再插入到新的 DNA 靶位点 [ 5]。转座因子遍及各类
生物之中,它们转座能够启动多种突变和染色体重
排,具有重要的生物学意义[ 6] 。在高等真核生物中,
前体mRNA 的剪接及其调节是一个复杂的、由多因
子参与的过程,它对基因正常功能的发挥起着重要
作用。SR蛋白( serine r ich pr otein)家族是真核生
物众多拼接因子之一, 在决定组织细胞的特异性及
个体发育的阶段性方面发挥着关键作用 [ 7~ 9]。本试
验挑选的35条 EST 序列中, 有3条与植物的SR基
437
草 地 学 报 第 17卷
表 1 cDNA差异片段与基因组数据库中序列的同源性比对
T able1 Compar ison of sequence similarity display for cDNA differential fragments w ith the sequences f rom genomic libr ary
克隆
Clone
长度
Len gth ( bp)
相似序列
Bes t hom ologu e in datab as e
得分
Scor e
ID 含量
ID% / E value
来源
S ource
信号转导相关基因 signal t ran sduct ion
254 401 Rho GT Pase activat ing protein 12 33. 1 32/ 7. 6 Xenopus laevis
358 293 maturase related protein 484 98/ 7e134 Oryza sat iva
代谢相关基因 metabolism
111 295 AAA ATPase 33. 1 32/ 7. 4 Anaeromyxobacter dehalogenans
157 211 NADPdependent malic pr otein 377 99/ 8e102 M alu s x domest ica
219 270 cytochrome c biogenesi s 488 99/ 5e135 Oryza sat iva
275 295 AAA ATPase 33. 1 32% / 7. 6 Anaeromyxobacter dehalogenans
297 270 ATP synthase F0 subunit 1 483 98/ 2e133 Oryza sat iva
326 270 NADH dehydrogenase subunit 2 488 99/ 5e135 Oryza sat iva
119 541 glycin e cleavage system protein 62. 4 54/ 2e08 Hydrogenivirga sp.
246 295 peptidase, U 7 family protein 33. 9 37/ 4. 4 Burk holderia thailan dens is M SMB43
基因表达转录调控和蛋白合成相关基因 gene expression t ranscriptional regu lat ion and p rotein synthesis
25 372 partial t rn7 gene for transposas e 56. 5 100/ 8e05 Listonel la anguillarum serovar
38 533 serine rich protein 43. 9 52/ 0. 006 Arachis hypogaea ( pean ut )
308 631 serine rich protein 34. 3 100/ 6. 7 Arachis hypogaea ( pean ut )
284 295 Periplasmic s erine proteases 33. 5 37/ 5. 6 Burkh olderia m al lei
88 295 LysR family t ran script ional regulator 32. 7 47/ 9. 6 Pseudomonas fluores cen s
253 721 LysR family t ran script ional regulator 35. 0 36/ 5. 2 Pseudomonas fluores cen s
107 363 putat ive reverse t ranscriptase 65. 5 100/ 1eo9 C icer ariet inum ( chick pea)
240 353 LacI family t ranscription regulator 60. 1 86/ 6e08 Escherichia coli ATCC 8739
84 409 ribosomal protein S1 196 85/ 7e49 Oryza sat iva
149 270 26S ribosomal RNA 488 99/ 5e135 Oryza sat iva
363 293 26S ribosomal RNA 484 98/ 7e134 Oryza sat iva
225 270 mitochondrial 26S rRNA gene 433 96/ 2e118 T rit icum aest ivum ( br ead w heat )
165 247 protein synthesis init iat ion factorl ike 60. 1 96/ 6e08 Arabidop sis thal iana( thale cr ess)
365 270 ribosomal protein S7 488 99/ 5e135 Oryza sat iva
抗逆性反应相关基因 St ress resistance
96 350 salt t olerant p rotein 136 76/ 6e31 T rit icum aest ivum ( br ead w heat )
54 295 pdr2 gen e for PDRlike ABC transp orter 193 97% 5446 Oryza sat iva
69 333 pdr2 gen e for PDRlike ABC transp orter 263 98/ 4e67 Oryza sat iva Japonica Group
155 537 catalas e ( EC1. 11. 1. 6) CAT2 m aiz e 61. 6 90/ 3e08 Zea mays
190 230 chain A, s olut ion s t ructure of thior edoxin type H 101 78/ 2e20 Oryza sat iva
214 231 glycine and pr ol inerich pr otein 206 93/ 5e50 Sporobolu s stapf ianus
361 262 thioredoxin H mRNA 174 85/ 1e40 T rit icum aest ivum ( br ead w heat )
功能未知基因 Function unknow n
71 339 No sign ificant similarit y foun d
因表达有关。
本试验中获得 6个与蛋白质合成有关的基因得
到加强表达,主要是核糖体蛋白类基因。许多核糖
体蛋白既具有结构上的功能, 又是翻译过程中必不
可少的因子,是细胞内蛋白质合成的细胞器。
3. 4 高温胁迫下抗逆蛋白基因的表达
沟叶结缕草在高温胁迫下具有良好的生长势,
这与其在高温逆境下体内大量抗逆蛋白基因的加强
表达有着密切关系, 在所获得的 35 条 EST 序列中
共有 7条基因与植物的抗逆性有关。耐盐蛋白( salt
to ler ant protein)最初是从烟草盐适应悬浮培养细
胞进行研究的, Singh 等 [ 10, 11] 首次发现培养的烟草
细胞在含 NaCl氯化钠的培养基上生长时, 有一特
异蛋白的表达。已有一些证据表明, 植物在受到盐
逆境胁迫时会合成特异的蛋白质以提高抗性[ 12]。
ABC 转运蛋白 ( AT Pbinding casset te t ranspo rt
ers)是膜整合蛋白,它利用水解的能量对溶质中各
种生物分子进行跨膜转运,转运蛋白广泛存在于真
核和原核生物中[ 13] 。Yoshihiro Kobae 等[ 14]在拟南
芥植物受病菌侵染的研究中进一步支持了 ABC 转
运蛋白中的 PDR 基因与植物的防御有关的观点。
在高温胁迫下, 沟叶结缕草体内过氧化氢酶( cata
lase)基因得到加强表达,过氧化氢酶能有效地清除
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第 4期 黄锦文等:沟叶结缕草高温胁迫的基因差异表达及其作用机制
代谢过程中产生的活性氧, 使生物体活性氧维持在
一个低水平上, 从而防止活性氧引起的膜脂过氧化
及其它伤害过程。脯氨酸富集蛋白 ( Prolinerich
pro teins, PRPs)是植物细胞壁蛋白, 其表达多受机
械伤害及各种环境胁迫的刺激[ 15]。细胞壁蛋白在
细胞壁的建造和细胞的防卫过程中有重要作用 [ 16]。
硫氧还蛋白( T hio redox in , T rx )是一类广泛存在于
生物体内的多功能酸性蛋白, 参与细胞的一系列生
化反应, 包括酶活性的调节[ 17, 18] 、转录因子的调
控[ 19, 20]、抗氧化胁迫[ 21] 等, 是重要的酶活力调节蛋
白。
综上所述, 沟叶结缕草对高温胁迫存在着一个
复杂的抗逆信号应答和代谢调控网络。信号识别是
整个抗逆性反应的最原初事件, 逆境胁迫下产生的
外源信号,首先通过成熟酶等基因的加强表达完成
核苷酸的细胞间信号传导,内源信号分子则在 GT P
酶激活蛋白等基因表达下进行信号的传递和放大,
信号分子的信号转导作用贯穿了整个抗逆过程。沟
叶结缕草在外界高温信号刺激下,启动了防御反应
机制,加强防御蛋白基因表达,一方面合成多种抗逆
蛋白抵御逆境, 增强其耐热能力、另一方面防御蛋白
的合成又进一步加强植物体内信号的转导以及代谢
的调节作用,使植物体内光合作用、呼吸作用及氮代
谢等多种代谢活动增强, 为结缕草在高温下生长提
供了必不可少的代谢流和能量, 同时也反映了结缕
草对高温逆境的代谢适应。而高温胁迫下的基因表
达转录调节和蛋白质合成相关基因的加强表达, 则
反映了高温条件下,植物体内多肽的各种合成与分
解代谢的动态平衡,对维持体内调控网络的稳定性
起着重要作用。
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(责任编辑 刘敏轩)
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